甘蓝型油菜矮杆基因Bnrgads的克隆和功能分析

甘蓝型油菜矮杆基因Bnrgads的克隆和功能分析

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书

学位论文

是否保密否如需保密，解密时间年月日

独创性声明

本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究

成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已

经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位

或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定．与我一同工作的同志对本研究

所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意．

研究蝴：到怨帆汐／，9年乡月罗日

学位论文使用授权书

本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力．注：保密学位论文(即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论文)在解密后适用于本授权书．

学位敝作者签名：割超导师张壕、趁

签名日期：．zofo牟-、乡月9日签名日期如p年彳月，6日。

注；请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间

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甘蓝型油菜矮杆基因Bnrga．ds的克隆和功能分析

目录

摘；要．I Abstract ．．．III 缩略语表VI 第一章文献综述．1 1．1禾本科作物矮杆突变体的遗传研究和应用1 1．1．1水稻矮杆突变体的遗传研究和应用l 1．1．2小麦矮杆突变体的遗传研究和应用2 1．2油菜矮杆突变体遗传研究现状．3 1．3高等植物矮杆性状的机理研究5 1．3．1赤霉素与植物矮化5 1．3．1．1 GA生物合成途径与植物矮化．5 1．3．1。2 GA信号转导途径与植物矮化7 1．3．2油菜素内酯和植物矮化12 1．3．2．1 BR生物合成和植物矮化．．13

1．3．2．2 BR信号转导途径和植物矮化．．15 1．3．3生长素与植物矮化．．1 5 1．3．3．1生长素生物合成和植物矮化15 1．3．3．2束缚型生长素的形成和植物矮化16 1．33．3生长素的极性运输与植物矮化16 1．3．3．4生长素信号转导途径和植物矮化．17 1．4本研究的目的和意义．．17第二章材料和方法一19 2．1植物材料．1 9 2．2矮杆基因的定位19 2．2．1定位群体的构建19 2．2．2基因组DNA的提取．．19 2．2．3 BSA法和SSR分析．．20 2．2．4 PAGE凝胶制备和电泳检测．．21

华中农业大学2010届博士学位论文

2．2．5 SCAR标记SCM07的检测。2l 2．2．6数据分析22 2．3候选基因的分析．22 2．3．1候选基因转录水平的分析22 2．3．1．1总RNA的提取．．22 2．3．1．2 cDNA的合成．．22 2．3．1．3半定量RT-PCR 。23 2．3．2候选基因编码序列比对23 2．3．2．1编码序列的扩增．23 2．3．2．2 DNA片段的回收、克隆．23 2．3．2．3感受态细胞的电击转化24 2．3．2．4质粒的提取、检测和测序24 2．3．2．5甘蓝型油菜不同品种BnRGA编码序列的测定．．25 2．4候选基因的转化验证．．25 2．4．1转化载体的构建25 2．4．2拟南芥的遗传转化和阳性植株筛选．27 2．4．3转基因拟南芥的筛选和表型观察27 2．5定点突变．．27 2．6酵母双杂交实验．28 2．6．1酵母双杂交的载体构建28 2．6．2酿酒酵母感受态细胞的制备29 2．6．3酵母菌的转化．30 2．7亚细胞定位．．31 2．7．1转化载体的构建 3 1 2．7．2亚细胞定位观察 3 l 2．8甘蓝型油菜的遗传转化．31 2．8．1甘蓝型油菜的转化方法3l 2．8．2阳性植株的PCR检测．32 2．8．3阳性植株花器官的GUS染色．32

甘蓝型油菜矮杆基因Bnrga．ds的克隆和功能分析

第三章结果和分析33 3．1突变体扛，矮杆性状的遗传分析33 3．2腮J基因的分子标记定位．．34 3．2．1 SSR标记的筛选34 3．2．2 SCM07的检测．．36 3．2．3腮J连锁图谱的构建．．37 3．3 BnRGA和Bnrga．ds转录水平的比较38 3．4 BnRGA和Bnrga·ds的序列比对38 3．4．1 BnRGA和Bnrga．ds的DNA序列比对38 3．4．2 BnRGA和Bnrga-ds氨基酸序列比对．41 3．5 Bnrga．ds转化野生型拟南芥．．43 3．5．1转化载体的获得．．44 3．5．2 Bnrga．cls转化对野生型拟南芥的影响45 3．6 Atrga—cls转化野生型拟南芥46 3．7 VHYNP模体中Pro突变对Bnrga-ds与GIDl相互作用的影响48 3．8 BnRGA和Bnrga．ds的亚细胞定位50 3．9 Bnrga-ds转化甘蓝型油菜．．51第四章讨论54 4．1 Bnrga-ds突变位点的意义．．54 4．2 VHYNP模体中Pro突变对DELLA蛋白与GIDl相互作用的影响．55 4．3甘蓝型油菜矮杆突变体凼．J『与白菜矮杆突变体咖归的矮化机理比较．．56 4．4甘蓝型油菜矮杆突变体出一J『的应用57参考文献59致谢73附录．．74附录l：主要培养基配方74附录2：攻读博士期间发表的论文76

甘蓝型油菜矮杆基因Bnrga．ds的克隆和功能分析

摘要

株高是油菜重要的农艺性状。适度矮化的油菜品种不仅抗倒伏性增强，而且更适合于机械化收获。筛选株高适度和农艺性状优良的矮杆突变体是培育矮杆品种的

关键。与水稻和小麦相比，油菜矮杆突变体数量较少，而且仅有白菜突变体咖刃的

矮杆基因被克隆，矮化机理被揭示。因此，进一步发掘具有生产应用价值的矮杆资源并克隆相应的矮杆基因将有助于油菜的矮化育种。缸J『是一个通过EMS诱变小孢子获得的甘蓝型油菜半矮杆突变体。本研究以凼．，为研究材料，定位和克隆了矮杆

基因凼．J并对其进行了功能分析，探讨了凼．J矮杆性状形成的机理，为矮杆基因凼．J在矮化育种中的应用提供了理论基础。同时本研究还获得与出．J基因紧密连锁的分子标记，将有利于凼．J基因的分子标记辅助选择育种。另外，凼．J基因也被用于甘蓝型油菜的转基因育种。主要结果如下：

1．出，和高秆品种No．9369的Fl株高介于两个亲本之间，F2群体的株高呈三峰连续性分布。对F3家系的分析结果表明，F2群体中纯合矮杆、中间型和纯合高杆植株符合l：2：1的分离比例，表明凼．J矮杆性状受单个部分显性基因控制。

2．筛选获得了3个与DS-1基因连锁的SSR标记BnEMSll25、BrGMS83和BrMS226，它们位于甘蓝型油菜A6染色体，其中BnEMSll25与DS-1基因共分离。BnEMSl 125是根据甘蓝型油菜BnRGA编码序列开发的标记，RGA的突变在拟南芥等物种中造成了矮杆表型。因此我们将BnRGA作为DS-1的候选基因。SCAR标记SCM07是甘蓝型油菜矮杆基因Bzh紧密连锁的标记。本研究显示SCM07与DS-1 基因连锁，遗传距离为0．7cM，表明Bzh与DS-1可能是等位基因。

3．RT-PCR结果显示No．9369和出．J『的BnRGA(分别命名为BnRGA和B，zrga．凼)表达没有显著差异，表明矮化突变位点没有发生在BnRGA的启动子区域。

将出．J『与No．9369和12个甘蓝型油菜常规品种的BnRGA基因的编码序列进行比对，发现Bnrga．ds蛋白VHYNP模体中保守的脯氨酸(Pro)突变为亮氨酸(Leu)可能造成了出。J的矮化表型。

4．将BnRGA和Bnrga．ds分别转化野生型拟南芥，Bnrga—ds转基因植株高度比野生型明显降低，BnRGA转基因植株没有出现矮杆表型，进一步表明Bnrga—ds是控制出．J矮化性状的基因。