木薯MeASR基因克隆及表达分析

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生物技术通报 Biotechnology Bulletin
2015,Vol.31,No.10
透胁迫处理条件下，转基因株系的发芽率高于野生 型。此外，LLA23 的过量表达能够改变转基因植株 中 ABA 和胁迫相关基因的表达水平。这一结果首次 从遗传学上证明了 ASR 基因参与调控 ABA 信号转 导，并能增强植物对干旱胁迫的耐受性。随后，来 自于番茄、香蕉、玉米、水稻、小麦的 ASR 基因都 被报道在提高植物抗旱性上发挥着重要作用［5-10］。 这些研究结果证明了 ASR 基因通过减少水分散失、 促进渗透平衡、减少细胞损伤、降低活性氧积累、 诱导抗氧化系统等生物学过程增强植物对干旱和渗 透胁迫的耐受性［5-10］。所以可以肯定，ASR 基因参 与 ABA 信号转导，并能提高植物对干旱胁迫的耐受 性，但是其作用机制仍然有待于进一步研究。
关键词 ： 木薯 ；MeASR 基因 ；基因克隆 ；表达分析 ；亚细胞定位 DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.021
Clone and Expression of MeASR Gene in Cassava
Hu Wei Yan Yan Wei Yunxie Wang Wenquan Xia Zhiqiang Lu Cheng Hou Xiaowan Peng Ming
GATGCTTCT-3'。从正常生长两个月的木薯幼苗叶片 cDNA 中扩增 MeASR 基因的开放阅读框，将扩增产 物回收后连接到克隆载体 pMD18-T 上，获得重组质 粒，阳性克隆测序正确后，用 Nco Ｉ /Spe Ｉ进行双 酶切并回收目的片段。同时，利用 Nco Ｉ /Spe Ｉ双 酶切 pCAMBIA1304 载体，并回收载体片段。利用 T4 连接酶将目的片段和载体片段进行连接，将连接 产物转化大肠杆菌 DH5α 后，挑取单克隆扩大培养， 经 PCR 和质粒双酶切验证后，进行测序分析，构建 成植物表达载体 pCAMBIA1304-MeASR-GFP。将测 序正确的阳性克隆的质粒转入农杆菌 LBA4404 中。 利 用 农 杆 菌 介 导 的 瞬 时 转 化 法 将 pCAMBIA1304MeASR-GFP 导入洋葱表皮细胞中，随后将洋葱表皮 放在铺有滤纸的 MS 培养基上，25℃暗培养 16-24 h， 然后制作装片，通过 FluoViewTM FV1000 激光扫描共 聚焦显微镜观察荧光信号。 1.2.6 基因的表达分析 根据 TaKaRa 实时荧光定 量标准说明书设计 qRT-PCR 引物（MeASR ：P5 5'TCACAAGGAAGGCGAAGA-3' ；P6 ：5'-GCAAAGGCAAATCCAATA-3' ；MeEF1 引 物 ：P7 ：5'-TGAACCACCCTGGTCAGATTGGAA-3'，P8 ：5'-AACTTGGGCTCCTTCTCAAGCTCT-3'），引物均由上海生工生物 工程有限公司合成。为了保证引物的特异性，引物 设计在非保守区域，PCR 产物的长度维持在 300 bp 以内，并进行了测序分析。以 1.2.2 中得到的 cDNA 为模板，以木薯 MeEF1 基因为内参进行 qRT-PCR 分析。实时荧光定量 PCR 采用 SYBR Green Ⅰ试剂 盒（TaKaRa 公司），按照操作说明在 Mx 3005P 荧光 定量 PCR 仪（吉泰生物科技有限公司）上进行。荧 光定量 PCR 的反应程序 ：95℃预变性 3 min ；95℃ 变性 7 s，55℃退火 10 s，72℃延伸 15 s，循环 40 次。 荧光定量 PCR 的反应体系 ：SYBR Green Ⅰ 10 μL， ROX 0.4 μL，引物 0.5 μL，cDNA 模板 1 μL，ddH2O 7.6
·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2015, 31(10):125-130
木薯 MeASR 基因克隆及表达分析
胡伟 颜彦 韦运谢 王文泉 夏志强 卢诚 侯晓婉 彭明
（中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口 571101）
摘 要 ： 脱落酸 - 胁迫 - 成熟诱导蛋白（Abscisic acid-stress-ripening，ASR）在植物对非生物逆境胁迫的应答过程中发挥着 重要作用。利用 PCR 技术从木薯中克隆了第一个 ASR 基因 MeASR，序列分析表明该基因开放阅读框（ORF）330 bp，编码 109 个 氨基酸。多序列比对和进化树分析表明该基因所编码的蛋白具有 ASR 家族蛋白的保守结构域，与番茄 ASR 家族蛋白 SlASR4 具有 较近的亲缘关系。亚细胞定位分析表明 MeASR 定位在细胞核，实时荧光定量 PCR 分析表明该基因的表达显著受渗透胁迫和 ABA 诱导。结果表明，MeASR 可能作为转录因子参与木薯对干旱逆境胁迫应答及 ABA 信号调节。
1 材料与方法
1.1 材料 实验所用木薯品种为 KU50，由中国热带农业
科学院热带生物技术研究所提供。 1.2 方法 1.2.1 材料处理 将木薯茎秆用刀切成约 10 cm 长 的小节，每一小节含数个芽眼。将茎秆插入含有营 养 土 和 蛭 石 的 盆 中， 待 其 发 芽、 生 根。 将 生 长 两 个 月、 且 长 势 一 致 的 木 薯 幼 苗 作 为 供 试 材 料， 以 不 处 理 的 木 薯 幼 苗 作 为 对 照， 设 置 两 个 处 理 组 ： （1）甘露醇处理组共 24 颗木薯幼苗，每个样品 3 颗，用 300 mmol/L 甘露醇对木薯幼苗进行 0 h、2 h、 6 h、3 d、14 d、18 d、24 d 和 36 d 灌 根 处 理 ；（2） ABA 处理组共 21 颗木薯幼苗，每个样品 3 颗，用 100 μmol/L ABA 对木薯幼苗进行 0、2、6、10、24、 48 和 72 h（甘露醇、脱落酸等生化试剂购自上海生 工生物工程有限公司）喷施。取每个处理的木薯幼 苗叶片用液氮冷冻，并放入 -80℃超低温冰箱保存。 1.2.2 RNA 的提取及 cDNA 的合成 分别取 1.2.1 不 同处理后的幼苗叶片，按照 RNA 提取试剂盒（天根 生化科技有限公司）的使用方法提取木薯总 RNA。 同时，利用 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit （Fermentas 公司）将提取的总 RNA 反转录成 cDNA， 并于 -20℃保存备用。 1.2.3 基因克隆 以获得的 cDNA 第一链为模板，设 计正向引物 P1 ：5'-ATGGCAGAAGAGAATAAGCA-3' 和 反 向 引 物 P2 ：5'-TTAAAAGAGATGGTGATGCTTCT-3' 进 行 PCR 扩 增。 反 应 体 系 为 ：Taq DNA 聚 合 酶（ 康 为 世 纪 生 物 公 司 ）0.5 μL，dNTP 0.5 μL， 10× Buffer 2 μL，上下游引物各 0.5 μL，cDNA 模板 1 μL，ddH2O 15.5 μL ；反应程序为 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 20 s，48℃退火 20 s，72℃延伸 30 s， 35 个循环 ；72℃延伸 10 min。PCR 扩增产物经回收、 连接、转化后，挑取单克隆在 LB 液体培养基中培养， 并进行 PCR 鉴定。然后将已鉴定的阳性克隆送华大 基因生物科技公司测序。 1.2.4 生 物 信 息 学 分 析 利 用 DNAMAN 软 件 和 BLAST（http ：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 进 行 序列比对和保守结构预测 ；利用 ORF Finder（http ：//
木薯（Manihot esculenta Crantz）是三大薯类作 物之一，全球第六大粮食作物，被誉为“淀粉之王”， 是世界近 8 亿人口赖以生存的粮食。在我国，木薯 作为新型能源、工业原料和潜在的粮食作物，具有 良好的发展潜力，是热带和亚热带地区最重要的经 济作物之一。木薯具有耐旱的生物学特性，一般情 况下，木薯能够忍耐 4-6 个月的干旱胁迫，是一种 典型的耐旱作物［11］。木薯特殊的耐旱能力表现在 通过丰富的根系从土壤深层吸收水分（地下 2 m）， 通过快速的气孔关闭减少水分散失，通过老叶片脱 落 减 少 水 分 消 耗， 最 终 提 高 木 薯 对 水 分 的 利 用 效 率，从而使木薯具有耐旱的特性。而且，在干旱胁 迫后恢复浇水，木薯能够快速地再生新叶片，维持 正 常 的 新 陈 代 谢， 并 补 偿 生 物 量［12］。 木 薯 在 干 旱 胁迫下对水分的吸收、气孔运动、叶片脱落等生物 学过程都是受 ABA 控制的关键生物学过程。因此， Okogbenin 等［12］提出 ABA 生物合成及信号转导可 能是调控木薯特殊耐旱性的关键途径之一。最近的 研究表明，木薯在适应干旱胁迫的过程中可能通过 减缓生长，从而延长对干旱胁迫的耐受时间 ；或者 通过老叶片的脱落维持一定的生长，从而抵抗干旱 胁迫［13］。虽然，近年来的研究取得了一定的研究进 展，但是对木薯耐旱机理的研究还不深入。本研究 从木薯克隆第一个 ASR 基因（MeASR），分析 MeASR 的细胞定位，并研究该基因在干旱和 ABA 处理的表 达水平，旨在研究木薯中的干旱胁迫应答基因，为 进一步解析木薯的耐旱机理提供参考。
（Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Science，Haikou 571101）
Abstract: Abscisic acid-stress-ripening induced protein（ASR）plays an important role in response to abiotic stresses. In the present study we isolated a first ASR gene designated MeASR from cassava. Sequence analysis showed that the open reading frame of MeASR gene contained 330 bp, encoding 109 amino acids. Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis indicated that MeASR protein contained the conserved domains as ASR family had, and had a close genetic relationship with SlASR4 of tomato. Subcellular location assay showed that MeASR protein was localized in nucleus. Real-time quantitative PCR assay revealed that expression of MeASR was induced by osmotic stress and ABA treatments. These results suggested that MeASR might function as a transcription factor to involve in response to drought stress and ABAsignal regulation in cassava.
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胡伟等 ：木薯 MeASR 基因克隆及表达分析
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www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html） 及 GENSCAN （http ：//genes.mit.edu/GENSCAN.html）进行基因开放 阅读框预测 ；利用 MEGA 5.0 软件构建进化树。 1.2.5 亚细胞定位分析 根据 MeASR 基因的 ORF 序列设计带有酶切位点 Nco Ｉ /Spe Ｉ且不含终止子 的引物 ：P3 ：5'-CATGCCATGGCGATGGCAGAAGAG AATAAGCA-3' ；P4 ：5'-GGACTAGTAAAGAGATGGT
的基本特征。ASR 基因的功能主要是参与调控植物 生长发育、衰老、果实成熟、激素信号转导以及对 逆境胁迫的应答［2，3］。
多个物种的 ASR 基因都被报道受水分胁迫（干 旱、渗透、脱水胁迫）以及 ABA 诱 导［2，3］，ASR 基 因也因此而得名。2005 年 Yang 等［4］研究表明，百 合的 ASR 基因（LLA23）受 ABA、脱水胁迫和高盐 胁迫诱导。随后，在拟南芥中过量表达百合 ASR 基 因（LLA23）发现，LLA23 过表达株系提高了对干旱 胁迫的耐受性。生理学分析表明，在干旱处理条件 下，转基因株系具有较低的水散失率 ；在甘露醇渗
Key words: cassava ；MeASR gene ；gene clone ；expression analysis ；subcellular location
Leabharlann Baidu
1993 年，ASR（Abscisic acid-stress-ripening） 基 因首次在番茄中被发现［1］，随后多个物种的 ASR 基 因被分离到。有趣的是，ASR 基因在拟南芥基因组 中不存在［2，3］。ASR 基因编码的蛋白具有转录因子 和 LEA（Late embryogenesis abundant protein） 蛋 白
收稿日期 ：2015-02-02 基金项目 ：中央级公益性科研院所基本科研业务费（1630052014003，ITBB140204），海南省自然科学基金项目（314122），海南省重大科技
专项（ZDZX2013023-1） 作者简介 ：胡伟，男，助理研究员，研究方向 ：植物分子生物学 ；E-mail ：huwei2010916@126.com 通讯作者 ：彭明，男，博士生导师，研究方向 ：植物分子遗传和作物遗传育种 ；E-mail ：mmpeng_2000@yahoo.com