木薯MeASR基因克隆及表达分析

·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2015, 31(10):125-130
木薯 MeASR 基因克隆及表达分析
胡伟 颜彦 韦运谢 王文泉 夏志强 卢诚 侯晓婉 彭明
（中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口 571101）
摘 要 ： 脱落酸 - 胁迫 - 成熟诱导蛋白（Abscisic acid-stress-ripening，ASR）在植物对非生物逆境胁迫的应答过程中发挥着 重要作用。利用 PCR 技术从木薯中克隆了第一个 ASR 基因 MeASR，序列分析表明该基因开放阅读框（ORF）330 bp，编码 109 个 氨基酸。多序列比对和进化树分析表明该基因所编码的蛋白具有 ASR 家族蛋白的保守结构域，与番茄 ASR 家族蛋白 SlASR4 具有 较近的亲缘关系。亚细胞定位分析表明 MeASR 定位在细胞核，实时荧光定量 PCR 分析表明该基因的表达显著受渗透胁迫和 ABA 诱导。结果表明，MeASR 可能作为转录因子参与木薯对干旱逆境胁迫应答及 ABA 信号调节。
的基本特征。ASR 基因的功能主要是参与调控植物 生长发育、衰老、果实成熟、激素信号转导以及对 逆境胁迫的应答［2，3］。
多个物种的 ASR 基因都被报道受水分胁迫（干 旱、渗透、脱水胁迫）以及 ABA 诱 导［2，3］，ASR 基 因也因此而得名。2005 年 Yang 等［4］研究表明，百 合的 ASR 基因（LLA23）受 ABA、脱水胁迫和高盐 胁迫诱导。随后，在拟南芥中过量表达百合 ASR 基 因（LLA23）发现，LLA23 过表达株系提高了对干旱 胁迫的耐受性。生理学分析表明，在干旱处理条件 下，转基因株系具有较低的水散失率 ；在甘露醇渗
木薯（Manihot esculenta Crantz）是三大薯类作 物之一，全球第六大粮食作物，被誉为“淀粉之王”， 是世界近 8 亿人口赖以生存的粮食。在我国，木薯 作为新型能源、工业原料和潜在的粮食作物，具有 良好的发展潜力，是热带和亚热带地区最重要的经 济作物之一。木薯具有耐旱的生物学特性，一般情 况下，木薯能够忍耐 4-6 个月的干旱胁迫，是一种 典型的耐旱作物［11］。木薯特殊的耐旱能力表现在 通过丰富的根系从土壤深层吸收水分（地下 2 m）， 通过快速的气孔关闭减少水分散失，通过老叶片脱 落 减 少 水 分 消 耗， 最 终 提 高 木 薯 对 水 分 的 利 用 效 率，从而使木薯具有耐旱的特性。而且，在干旱胁 迫后恢复浇水，木薯能够快速地再生新叶片，维持 正 常 的 新 陈 代 谢， 并 补 偿 生 物 量［12］。 木 薯 在 干 旱 胁迫下对水分的吸收、气孔运动、叶片脱落等生物 学过程都是受 ABA 控制的关键生物学过程。因此， Okogbenin 等［12］提出 ABA 生物合成及信号转导可 能是调控木薯特殊耐旱性的关键途径之一。最近的 研究表明，木薯在适应干旱胁迫的过程中可能通过 减缓生长，从而延长对干旱胁迫的耐受时间 ；或者 通过老叶片的脱落维持一定的生长，从而抵抗干旱 胁迫［13］。虽然，近年来的研究取得了一定的研究进 展，但是对木薯耐旱机理的研究还不深入。本研究 从木薯克隆第一个 ASR 基因（MeASR），分析 MeASR 的细胞定位，并研究该基因在干旱和 ABA 处理的表 达水平，旨在研究木薯中的干旱胁迫应答基因，为 进一步解析木薯的耐旱机理提供参考。
Key words: cassava ；MeASR gene ；gene clone ；expression analysis ；subcellular location
1993 年，ASR（Abscisic acid-stress-ripening） 基 因首次在番茄中被发现［1］，随后多个物种的 ASR 基 因被分离到。有趣的是，ASR 基因在拟南芥基因组 中不存在［2，3］。ASR 基因编码的蛋白具有转录因子 和 LEA（Late embryogenesis abundant protein）ology Bulletin
2015,Vol.31,No.10
透胁迫处理条件下，转基因株系的发芽率高于野生 型。此外，LLA23 的过量表达能够改变转基因植株 中 ABA 和胁迫相关基因的表达水平。这一结果首次 从遗传学上证明了 ASR 基因参与调控 ABA 信号转 导，并能增强植物对干旱胁迫的耐受性。随后，来 自于番茄、香蕉、玉米、水稻、小麦的 ASR 基因都 被报道在提高植物抗旱性上发挥着重要作用［5-10］。 这些研究结果证明了 ASR 基因通过减少水分散失、 促进渗透平衡、减少细胞损伤、降低活性氧积累、 诱导抗氧化系统等生物学过程增强植物对干旱和渗 透胁迫的耐受性［5-10］。所以可以肯定，ASR 基因参 与 ABA 信号转导，并能提高植物对干旱胁迫的耐受 性，但是其作用机制仍然有待于进一步研究。
收稿日期 ：2015-02-02 基金项目 ：中央级公益性科研院所基本科研业务费（1630052014003，ITBB140204），海南省自然科学基金项目（314122），海南省重大科技
专项（ZDZX2013023-1） 作者简介 ：胡伟，男，助理研究员，研究方向 ：植物分子生物学 ；E-mail ：huwei2010916@ 通讯作者 ：彭明，男，博士生导师，研究方向 ：植物分子遗传和作物遗传育种 ；E-mail ：mmpeng_2000@
GATGCTTCT-3'。从正常生长两个月的木薯幼苗叶片 cDNA 中扩增 MeASR 基因的开放阅读框，将扩增产 物回收后连接到克隆载体 pMD18-T 上，获得重组质 粒，阳性克隆测序正确后，用 Nco Ｉ /Spe Ｉ进行双 酶切并回收目的片段。同时，利用 Nco Ｉ /Spe Ｉ双 酶切 pCAMBIA1304 载体，并回收载体片段。利用 T4 连接酶将目的片段和载体片段进行连接，将连接 产物转化大肠杆菌 DH5α 后，挑取单克隆扩大培养， 经 PCR 和质粒双酶切验证后，进行测序分析，构建 成植物表达载体 pCAMBIA1304-MeASR-GFP。将测 序正确的阳性克隆的质粒转入农杆菌 LBA4404 中。 利 用 农 杆 菌 介 导 的 瞬 时 转 化 法 将 pCAMBIA1304MeASR-GFP 导入洋葱表皮细胞中，随后将洋葱表皮 放在铺有滤纸的 MS 培养基上，25℃暗培养 16-24 h， 然后制作装片，通过 FluoViewTM FV1000 激光扫描共 聚焦显微镜观察荧光信号。 1.2.6 基因的表达分析 根据 TaKaRa 实时荧光定 量标准说明书设计 qRT-PCR 引物（MeASR ：P5 5'TCACAAGGAAGGCGAAGA-3' ；P6 ：5'-GCAAAGGCAAATCCAATA-3' ；MeEF1 引 物 ：P7 ：5'-TGAACCACCCTGGTCAGATTGGAA-3'，P8 ：5'-AACTTGGGCTCCTTCTCAAGCTCT-3'），引物均由上海生工生物 工程有限公司合成。为了保证引物的特异性，引物 设计在非保守区域，PCR 产物的长度维持在 300 bp 以内，并进行了测序分析。以 1.2.2 中得到的 cDNA 为模板，以木薯 MeEF1 基因为内参进行 qRT-PCR 分析。实时荧光定量 PCR 采用 SYBR Green Ⅰ试剂 盒（TaKaRa 公司），按照操作说明在 Mx 3005P 荧光 定量 PCR 仪（吉泰生物科技有限公司）上进行。荧 光定量 PCR 的反应程序 ：95℃预变性 3 min ；95℃ 变性 7 s，55℃退火 10 s，72℃延伸 15 s，循环 40 次。 荧光定量 PCR 的反应体系 ：SYBR Green Ⅰ 10 μL， ROX 0.4 μL，引物 0.5 μL，cDNA 模板 1 μL，ddH2O 7.6
2015,31(10)
胡伟等 ：木薯 MeASR 基因克隆及表达分析
127
/gorf/gorf.html） 及 GENSCAN （http ：///GENSCAN.html）进行基因开放 阅读框预测 ；利用 MEGA 5.0 软件构建进化树。 1.2.5 亚细胞定位分析 根据 MeASR 基因的 ORF 序列设计带有酶切位点 Nco Ｉ /Spe Ｉ且不含终止子 的引物 ：P3 ：5'-CATGCCATGGCGATGGCAGAAGAG AATAAGCA-3' ；P4 ：5'-GGACTAGTAAAGAGATGGT
1 材料与方法
1.1 材料 实验所用木薯品种为 KU50，由中国热带农业
科学院热带生物技术研究所提供。 1.2 方法 1.2.1 材料处理 将木薯茎秆用刀切成约 10 cm 长 的小节，每一小节含数个芽眼。将茎秆插入含有营 养 土 和 蛭 石 的 盆 中， 待 其 发 芽、 生 根。 将 生 长 两 个 月、 且 长 势 一 致 的 木 薯 幼 苗 作 为 供 试 材 料， 以 不 处 理 的 木 薯 幼 苗 作 为 对 照， 设 置 两 个 处 理 组 ： （1）甘露醇处理组共 24 颗木薯幼苗，每个样品 3 颗，用 300 mmol/L 甘露醇对木薯幼苗进行 0 h、2 h、 6 h、3 d、14 d、18 d、24 d 和 36 d 灌 根 处 理 ；（2） ABA 处理组共 21 颗木薯幼苗，每个样品 3 颗，用 100 μmol/L ABA 对木薯幼苗进行 0、2、6、10、24、 48 和 72 h（甘露醇、脱落酸等生化试剂购自上海生 工生物工程有限公司）喷施。取每个处理的木薯幼 苗叶片用液氮冷冻，并放入 -80℃超低温冰箱保存。 1.2.2 RNA 的提取及 cDNA 的合成 分别取 1.2.1 不 同处理后的幼苗叶片，按照 RNA 提取试剂盒（天根 生化科技有限公司）的使用方法提取木薯总 RNA。 同时，利用 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit （Fermentas 公司）将提取的总 RNA 反转录成 cDNA， 并于 -20℃保存备用。 1.2.3 基因克隆 以获得的 cDNA 第一链为模板，设 计正向引物 P1 ：5'-ATGGCAGAAGAGAATAAGCA-3' 和 反 向 引 物 P2 ：5'-TTAAAAGAGATGGTGATGCTTCT-3' 进 行 PCR 扩 增。 反 应 体 系 为 ：Taq DNA 聚 合 酶（ 康 为 世 纪 生 物 公 司 ）0.5 μL，dNTP 0.5 μL， 10× Buffer 2 μL，上下游引物各 0.5 μL，cDNA 模板 1 μL，ddH2O 15.5 μL ；反应程序为 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 20 s，48℃退火 20 s，72℃延伸 30 s， 35 个循环 ；72℃延伸 10 min。PCR 扩增产物经回收、 连接、转化后，挑取单克隆在 LB 液体培养基中培养， 并进行 PCR 鉴定。然后将已鉴定的阳性克隆送华大 基因生物科技公司测序。 1.2.4 生 物 信 息 学 分 析 利 用 DNAMAN 软 件 和 BLAST（http ：///Blast.cgi） 进 行 序列比对和保守结构预测 ；利用 ORF Finder（http ：//