激光共焦角膜显微镜和角膜内皮镜.
激光扫描共聚焦显微镜
1、 选择好适宜的荧光探针。 原则上讲,无论是荧光素还是荧光标记抗体均 可用于LSCM 。如果打算用2种以上荧光标记物,要 注意它们是否激发光波长及发射光波长能区别开， 还要注意是否与LSCM的激发器相匹配，要根据现有 的激发波长来选择荧光标记物。
• 不同的荧光探针在不同标本的效果常有差异，故除综合 考虑以上因素以外，有条件者应进行染料的筛选，以找 出最适的荧光探针。
6.观察活细胞、活组织：ＬＳＣＭ在不损伤
细胞的前提下，对活组织、活细胞进行观 察和测量，这不仅省去了繁琐的样品前期 处理过程(如脱水、脱蜡、染色等);而且观 察过的样品还可以继续用于其他的研究。 这种功能对于细胞培养、转基因研究尤为 重要。这可以说是ＬＳＣＭ最大的优势。
7. 生化成分精确定位观察配合专用的分子探 针，对于要检测的成分不仅可以定位到细 胞水平，还可以定位到亚细胞水平和分子 水平。
2015/6/12
激光扫描共聚焦显微镜：以激光作为激发光源，采用 光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫 描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统.
形态学研究：组织细胞 标本的抗原免疫荧光检 测，凋亡检测…
目的结构是用荧光探针标记的， 都可以用激光共聚焦显微镜观察
分子生物学：荧光原位杂交对DNA 和RNA定量，外源基因在真核细胞 的表达及定位，蛋白质相互作用 (FRET)…
4. 采 用点扫描技术将样品分成无数个点，用十分细小的激光 束逐点逐行扫描成像，再通过电脑组合成一个整体。传统的 光镜在场光源下一次成像，标本上每一点都会受到相邻点的 衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无 法相比的。
5.光电倍增管：检测设定范围内的光信号，并将光信号转换成 电 信号，相当于相机中的CCD或胶卷。 PMT只能检测到信号的强弱，不能记录信号的颜色，记录 的 结果通过信号强度和填充颜色表示。PMT单位用电压值V 表示，数值越大代表信号倍增越大，提高倍增会同时增加图 像的正常信号强度和噪声信号强度，使图像的信噪比下降。
角膜共聚焦显微镜检查流程 -回复
角膜共聚焦显微镜检查流程-回复角膜共聚焦显微镜（Confocal Corneal Microscopy）是一种非侵入性的角膜成像技术，通过其高分辨率的能力，可以帮助医生诊断和评估各种眼部疾病，如角膜炎、角膜溃疡和角膜屈光不正等。
本文将详细介绍角膜共聚焦显微镜检查的流程。
一、麻醉在进行角膜共聚焦显微镜检查前，需要先对患者进行麻醉，以避免不适和疼痛感。
一般而言，麻醉眼药水会被滴入患者双眼，然后患者需要等待片刻，以确保麻醉效果充分。
二、准备设备在患者眼睛麻醉后，医生会开始准备角膜共聚焦显微镜。
这包括将显微镜装置安装到显微镜座上，并连接电源。
接下来，医生会进行一系列校准步骤，以确保显微镜设备能够获得高质量的成像。
三、就位和调焦患者需要靠近显微镜，并将他们的额头适应在显微镜的头架上。
医生会逐步调节显微镜，以确保患者的眼睛对准了显微镜的接口，从而获得清晰的成像。
接着，医生会将显微镜对焦到患者的角膜表面，以获得最佳成像。
四、显微镜成像一旦就位并调焦完毕，角膜共聚焦显微镜将开始进行成像。
医生会使用显微镜上的控制按钮或计算机软件，控制成像的深度和速度。
他们会选择适当的成像模式和参数，以获取所需的角膜信息。
在成像过程中，患者需要保持眼睛保持固定，以确保成像的稳定性和准确性。
五、结果分析在角膜共聚焦显微镜成像完成后，医生会对所得的图像进行分析和评估。
他们会仔细观察图像的每个细节，以确定角膜的结构、层次和表面的情况。
医生可以使用不同的成像模式和波长来观察角膜上不同的细胞和组织类型，以便检测异常或病变。
六、诊断和建议基于角膜共聚焦显微镜成像的结果和分析，医生将能够做出准确的诊断，并提供相关的治疗建议。
根据检查结果，医生可以决定是否需要进行其他的检查或测试，以进一步了解眼部疾病的程度和影响。
总结起来，角膜共聚焦显微镜检查是一项快速、无创且非常准确的眼科诊断工具。
通过该检查，医生可以获得角膜的详细图像，以帮助他们诊断和了解各种眼部疾病。
激光共焦显微镜对正常人中央角膜的观察
激光共焦显微镜对正常人中央角膜的观察石尧;吴艳【期刊名称】《国际眼科杂志》【年(卷),期】2009(9)3【摘要】目的:利用激光共焦显微镜观察正常人的中央角膜组织结构和细胞形态.方法:对54例(68眼)患者进行激光共焦显微镜连续扫描,使用激光共焦显微镜对其角膜中央区进行检查, 拍摄各层角膜图像,观察组织结构和细胞形态,对细胞密度进行计数并分析.结果:角膜组织学结构:上皮细胞较其它细胞的体积小,数量多,随深度增加细胞逐渐变小.Bowman膜较薄,无明显细胞结构,层间有神经走形.基质层的细胞核围成"网眼"状结构,随深度加深,"网眼"变大,排列变松.Descemet膜表现为一个与后基质层和内皮层交织的移行带.内皮细胞为六边形结构,排列规则.角膜细胞密度:在各年龄组间,上皮细胞表层与基底层之间的差异均有统计学意义(P<0.01),前基质层细胞密度与中、后基质层密度之间有统计学差异(P<0.05).A组和D组的内皮细胞密度有统计学差异(P<0.05).其余各年龄段的角膜各层细胞密度,随年龄的增加,数差异均无统计学意义.结论:激光共焦显微镜可以在实时、活体和三维空间从细胞水平对角膜各层结构进行无创的定性定量分析,较传统光学共焦显微镜能获得更清晰、更密集的角膜图像,对角膜疾病的基础研究与临床诊断具有很高的价值.【总页数】3页(P489-491)【作者】石尧;吴艳【作者单位】210002,中国江苏省南京市,南京军区南京总医院眼科;210002,中国江苏省南京市,南京军区南京总医院眼科【正文语种】中文【中图分类】R77【相关文献】1.生物角膜用于人角膜板层移植术后的临床疗效及激光扫描共焦显微镜动态观察[J], 王素娟;张月琴;李金;余晓菲;窦新岩;王丽娅2.生物角膜用于人角膜板层移植术后的临床疗效及激光扫描共焦显微镜动态观察[J], 王素娟;张月琴;李金;余晓菲;窦新岩;王丽娅;3.VisuMax飞秒激光准分子激光角膜原位磨镶术术后角膜反应的共焦显微镜观察[J], 许烨;周行涛;牛凌凌;徐建江;褚仁远4.HRTⅡ代/Rostock角膜模块对正常人眼角膜缘和中央角膜的观察 [J], 唐淼;胡楠5.激光共焦显微镜下圆锥角膜交联术后角膜基质的观察 [J], 张经; 王青枝因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
激光角膜共焦显微镜观察真菌性角膜炎的研究
病灶在较暗的背景 中折光很强 ， 明亮 、 呈 杂乱无章 、 相互交错 的线状或短棒状结构 ， 形类 似神经组织 ， 走 但较其弯 曲 度明显增大 。病灶处见大量炎性 细胞浸润 。所有受检 眼角膜刮片 、 真菌培养 、 激光 角膜共焦 显微镜检查 的阳性率 分别为 ４ ．％ 、２ ２ ８７ ６ ． ％和 ７ ．％ ；６例检查前未进行抗真菌治疗 的患眼的阳性率 分别为 ７ ． ％、７ ５ 和 １０ ； ８４ １ ５ ０ ８ ．％ ０％
２ 例 检查 前 已行 抗 真 菌 治 疗 患 眼 的 阳性 率 分 别 为 ２ ． ％ 、２ ９ 和 ６ ．％ 。 结论 ： 光 角 膜 共 焦 显 微 镜 对 真 菌 １ ８６ ４ ． ％ １９ 激 性 角 膜 炎 的检 出具 有 及 时 、 创 和 高 阳性 率 的 特 点 ， 作 为 真 菌 性 角 膜 炎诊 断 的一 种 新 的 重 要 手 段 。 无 可 关 键 词 ： 激 光 ； 角 膜 共 焦 显 微 镜 ； 真 菌 ； 角膜 炎 中图分类号 ： Ｒ ７．１ ７ ２ ２ 文 献标 识码 ： Ａ 文章 编 号 ： １０ —１９ ２０ ）４０ ８－３ ０ ８８ ９ （ ０ ９ ０ －３ ００
石 尧 ， 吴 艳 ， 薛春 燕 ， 黄振平
（ 南京 军 区南京 总 医院眼科 ， 苏南京 ２ ０ ０ ） 江 １０ ２
摘要 ： 目的 ： 真菌性角膜炎是常见 的致盲性眼病之 一 ， 在我 国发病率高 ， 其早期诊 断和治疗 至关重要 。本研 究 旨 在探讨激 光角膜共焦显微镜在真菌性 角膜炎 临床诊断 中的意义。 方法 ： ３ 对 ７例（ ７只眼） 门诊诊 断为真菌性 ３ 经
Ｌ ｓｒｃ ｎｏ ａ ｃ ｒ ｅｌ ｃｏｃ ｐ ： ｅ ｄａ ｎ ｓ ｃｏ ｔ ｎｆｒｆｎ ａ ｅａｉｓ ａｅ ｏ ｆｃ ｌ ｏｎ ａ ｍｉｒｓｏ ｙ Ａ ｎ ｗ ｉｇ ｏｔ ｐｉ ｏ ｇ ｌ ｒ ｔｉ ｉ ｏ ｕ ｋ ｔ
激光扫描共聚焦显微镜
分辨率高
免疫荧光标记技术
• 免疫荧光技术是将抗体（或抗原）标记上荧光素（例如 FITC )，它与细胞或组织内相应抗原（或抗体）结合后， 通过观察、检测特征的荧光，定性、定位及定量地检测样 品中的抗体。免疫荧光技术的优点是其具有免疫反应的特 异性，又结合了荧光检测的敏感性
•注：动态监测过程需要连续采集一个固定视野的图像，因此 在离子测定时要求细胞贴壁牢固，监测期间不发生移位现象， 否则，不易的到好的定量结果。
常见的应用和方法
用激光扫描共聚焦显微镜在细胞原位检测核酸 激光扫描共聚焦显微术通过成像显示出细胞内核酸的
分布特征及含量，即实现定位，定性及定量检测 核酸 常用：细胞核定位及形态学观察 染色体观察等 前提：需将核酸用荧光探针标记 常用荧光探针： Hoechst33342 Hoechst33258 DAPI 等
激光扫描 共聚焦显微镜
简介
• 激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起 来的一项具有划时代意义的高科技新产品，它是 在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置， 利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率 提高了30%~40%，使用紫外或可见激光激发荧光 探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光 图像，在亚细胞水平上观察诸如Ca 2+ 、pH值， 膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态 学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等 领域中新一代强有力的研究工具，是目前生物医 学领域中最先进的荧光成像和细胞分析手段之一。
• 另一方面，样品也会受到同一焦平面上的 临近区域所激发荧光的干扰，使得图象对 比度降低，这被称为侧向（XY）干扰
激光共焦显微镜观察真菌性角膜炎治疗效果的研究
ｗ ｉ ｈｗ ｄｔ ｔ ｉｉ ｌ ｉｎ ｃｎｅ（ ０ ０ ） Ｔ ｅｆ ａ ｅ ｅｔｅｐｗ ｒｒｔ ｗ ｓ８ ． ％ ， ｈｃ ｕｉ ｈｃ ｓｏ ｅ ｅｓ ｔｔ ａ ｓ ｉ ａｃ Ｐ＜ ．５ ． ｈ ｎｌ ｆ ｃｖ ｏ ｅ ａ ａ ８ １ ｗ ｉｈｃ ｒ ｇ ｈ ｈ ａ ｓｃ ｇ ｆ ｉ ｉ ｆ ｉ ｅ ｎ
镜及 角膜 真菌 培养 检查 ， 明确 菌丝 情况及 真菌 菌属 。 记 录 菌丝 阳性 患眼数 及 真菌培 养 阳性患 眼数 。所 有
镜 观察组 织 中菌 丝分 布情 况 ， 得 较好 的疗 效 。 取
１ 对 象与方 法
患眼 均采用 那 他霉 素眼用 混悬 液 （ 特真 ， ５ 那 含 ％那 他 霉 素 ， 国爱 尔康 公 司 生产 ） 眼治 疗 ， 时根 据 美 滴 同
Ｍ ｅｈ ｄ Ｆ ｕ ｔ ｔ ｏｃ ｓｓ（ ２ ｅ ｅ ） ｕｆ ｅ ｉ ｎ ａ ｋ ｒｔｉ ｗ ｒ ｅ ｔ ｉ ａ ｍ ｃ ｙｄ ｏ ． ａ ｅ ｔｏ ｓ ｏ ｒ — ａｅ ４ ｙ ｓ ｓｆ ｒｄｗ ｔ ｆ ｇ ｅａ ｔ ｅｅｔ ａ ｄ ｗｔ ｎ ｔ ｙ ｉ ｅ ｅ ｒ Ｌ ｓｒ ｙｗ ｅ ｈｕ ｌ ｉｓ ｒ ｅ ｈ ａ ｎ ｐ
及 内皮 层 往往 不 能窥入 ， 图 １ 见 。治疗 后 可 见 ， 灶 病 处 菌 丝密 度 明显 减少 ， 至消失 ， 边炎 性细 胞 浸润 甚 周 减少 ， 基质 透亮 度 增 加 ， 原 纤 维 增 生 ， 织 呈 瘢 痕 胶 组
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—
・
论
著 ・
激光共焦 显微镜观察真菌性 角膜 炎治疗效果 的研究
吴 艳， 石 尧 ， 薛春 燕
［ 要］ 目的 摘 研究激光共 焦显微 镜对观察 真菌 性角膜 炎治疗 过程 中病情转 归 的意义 。方 法
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围讲解
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。
把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。
1 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM ）的原理从基本原理上讲, 共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜, 它对普通光镜从技术上作了以下几点改进:1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好, 光源波束的波长相同, 从根本上消除了色差。
1． 2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板, 将焦平面以外的杂散光挡住, 消除了球差; 并进一步消除了色差1． 3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点, 用十分细小的激光束(点光源逐点逐行扫描成像, 再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。
而传统的光镜是在场光源下一次成像的, 标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。
这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。
1．4用计算机采集和处理光信号, 并利用光电倍增管放大信号图在共聚焦显微镜中, 计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像, 得到的图像是数字化的, 可以在电脑中进行处理, 再一次提高图像的清晰度。
而且利用了光电倍增管, 可以将很微弱的信号放大, 灵敏度大大提高。
由于综合利用了以上技术。
可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合, 是现代技术发展的必然产物。
2 ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用目前, 一台配置完备的ＬＳＣＭ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜, 它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合, 如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ＰＨ、微分干涉差显微镜(ＤＩＣ等, 因此被称为万能显微镜, 通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。
眼科角膜共聚焦显微镜检查操作技术
眼科角膜共聚焦显微镜检查操作技术角膜共聚焦显微镜(CMTF)全称为扫描裂隙角膜共聚焦显微镜，简称共焦显微镜，是近年来发展起来的一种活体显微检查技术。
1955年Minsky发明了第一台用于研究脑神经网络的共焦显微镜，Cavanagh等于1986年将其应用于眼科的动物实验，又于1989年首次用于活体人眼的观察。
此后，共焦显微镜在角膜病的基础研究和临床工作中得到广泛应用，使角膜病的研究和诊断水平向前推进了一大步。
一、基本原理角膜共聚焦显微镜的原理是利用共姬焦点技术，运用光扫描对活体组织进行三维空间的显示和实时的观察，其获得图像的扫描范围为300μm×400μm,厚约5um,放大倍数100o倍，X、Y、Z轴由三轴机器杆控制，移动范围可精确到小于IUn1。
与普通的光学显微镜相比，它具有高分辨率和图像高对比度的特点，能够在细胞水平对活体角膜进行无创伤的动态观察。
临床主要有两种类型：TandenISCanning共焦显微镜和Confoscan裂隙扫描型共焦显微镜。
目前共焦显微镜已由录像系统转化为数码摄像系统，使图像更为清晰、完整，图片摄取速度更快捷，如Confoscan2.0共焦显微镜。
近来，激光角膜共焦显微镜也已用于临床，其图像清晰、分辨率高至1um、可对角膜病变和角膜缘疾病进行多层次立体及连续动态观察。
我科首次应用激光共焦显微镜(HRTII/RCM)对正常人活体角膜缘和角膜中央组织结构进行了观察，获得了传统光学共焦显微镜无法获得的图像和效果，填补了活体观察角膜缘的空白。
共焦显微镜由三大部分组成：①主机：由一个一维的扫描裂隙装置和一个与图像光路相一致的物体聚集盘组成，在一维的光切面上做三维的点状分层扫描。
②光学传输系统：把连续、同步的光扫描信号传到计算机屏幕和录像机磁带上。
③计算机分析系统：对记录在录像带上的图像进行分析、处理得到较清晰的图片资料。
对角膜的各层细胞数、大小、面积进行统计和数据分析。
眼科题库7
眼科检查部分各型试题一、选择题A型题1．国际标准视力表远视力检查距离为：（4.11）A．50mB．5mC．3mD．2.5mE．6m答案：B2．在眼病诊断中，较有参考价值的是：（5.11）A．矫正视力B．裸眼视力C．针孔视力D．远视力E．近视力答案：A3．对视力低于0.3的屈光介质浑浊患者预测术后视功能时，选择哪种检测视功能结果较可靠：（4.11）A．.眼电图B．图形视网膜电图C．闪光视网膜电图D．视觉诱发电位E．多焦视网膜电图答案：D4．以下对于磁共振成像（MRI）不正确的描述有：（4.12）A．通过射频探测病变B．用于眼内病变的诊断C．检测视神经病变D．探测磁性异物E．灵敏度优于CT答案：D5．正常人行眼底荧光血管造影检查，臂—视网膜循环时间大约为：（5.11）A．1—3秒B．7—12秒C．1分D．5分E．10分答案：B6．慢性闭角型青光眼形态学诊断应选择：（5.12）A．超声生物显微镜B．光学相干断层扫描C．A超D．B超E．彩色多普勒成像答案：A7．黄斑部裂孔检查宜选择：（5.11）A．超声生物显微镜B．光学相干断层扫描C．A超D．B超E．彩色多普勒成像答案：B8．目前测量较准确，不受巩膜硬度影响的眼压计是：（4.22）A．.Goldmann眼压计B．Schiotz眼压计C．费卡眼压计D．非接触眼压计E．眼压描计答案：A9．对比敏感度反映的是：（4.22）A．高对比度时的分辨能力B．不同物体远近关系C．空间、明暗对比二维频率的形觉功能D．二维物体形状、位置E．视杆细胞的功能状态答案：C10．有关三面镜检查法的描述，错误的是：（4.23）A．中央部分的凹面镜用于检查眼底的后极部B．750镜检查后极部到赤道部之间的区域C．.670镜用以检查周边部D．590镜可看到锯齿缘E．590镜不能用于检查前房角答案：E11．有关超声生物显微镜（UBM）的描述，错误的是：（4.12）A．它是50Hz的高频率分辨率的B超B．用于眼前段疾病的辅助诊断C．其因穿通力高可用于眼后节疾病辅助诊断D．它对闭角型青光眼、恶性青光眼的诊断有意义E．有利于眼前段肿瘤诊断答案：C12．裂隙灯显微镜检查时最常用的照明方法为：（4.11）A．弥散光照明法B．直接焦点照明法C．角巩膜缘分光照明法D．后部反光照明法E．镜面反光照明法答案：C13．正常人在30岁前，角膜内皮细胞的平均密度为每平方毫米是：（4.11）A．6000-8000个B．3000-4000个C．.2600-2800个D．2150-1500个E．1500-2000个答案：BB型题问题14—18A．同侧上象限偏盲B．同侧下象限偏盲C．黄斑分裂D．黄斑回避E．颞侧偏盲14．视交叉后视束病变（答案：C）（5.33）15．脑皮质疾患（答案：D）（5.34）16．视放射上方纤维素病变（答案：B）（5.34）17．距状裂下唇病变（答案：A）（5.34）18．视交叉病变（答案：E）（5.33）问题19---23A．象限盲B．鼻侧阶梯C．扇形缺损，尖端位于生理盲点D．扇形缺损，尖端位于中心注视点E．生理盲点扩大19．早期青光眼（答案：B）（5.12）20．视放射前部损伤（答案：A）（5.33）21．视网膜中央动脉分支阻塞（答案：C）（5.22）22．缺血性视盘病变（答案：C）（5.23）23．视路疾患（答案：D）（5.33）问题24—28A．.眼电图B．视网膜电图-a波C．视网膜电图-b波D．.图形视网膜电图E．视觉诱发电位24．视神经功能检查应选择（答案：E）（5.22）25．双极细胞检查应选择（答案：C）（5.23）26．光感受器检查应选择（答案：B）（5.23）27．神经节细胞检查应选择（答案：D）（5.22）28．视网膜色素上皮细胞检查应选择（答案：A）（5.22）问题29—31A．TnB．T-1C．T-3D．T+1E．T+329．指侧眼压正常记为（答案：A）（4.12）30．指侧眼压硬如石记为（答案：E）（4.12）31．指侧眼压软如唇记为（答案：C）（4.12）问题32—36A．A超B．B超C．彩色多普勒成像D．CTE．核磁共振32．玻璃体、视网膜病变选择（答案：B）（4.12）33．眼轴长度测量选择（答案：A）（4.12）34．眶内肿瘤首选（答案：D）（4.12）35．眶血流动力学检查选择（答案：C）（4.12）36．眼内磁性异物检查禁用（答案：E）（4.12）C型题问题37—40A．弓形暗点B．环形暗点C．两者均有D．两者均无37．青光眼可出现（答案：C）（5.12）38．视网膜色素变性（答案：B）（5.12）39．缺血性视盘病变（答案：D）（5.12）40．球后视神经炎（答案：B）（5.12）X型题41．Amsler方格主要用于检查：（4.12）A．视野范围B．中心暗点C．旁中心暗点D．测定黄斑功能E．测定视网膜光敏感度（答案：BCD）42．下列可出现向心性视野缩小的病有：（5.23）A.视网膜色素变性B.青光眼晚期C.垂体病D球后视神经炎E癔症（答案：ABDE）二、填空题1．眼病的主要症状有以下3个方面：视力障碍，感觉异常和外观异常。
海德堡(HRT)共焦激光角膜显微镜
海德堡HRT3-CM 产品四大特点：
• 全球第一台并且是唯一以共焦激光做为光 源的角膜显微镜 • 前所未有的角膜活体组织检查： 800倍放大倍率 分辨率高达1μm • 丰富的图像获取方式 • 完全无创的检查方式
三种图像获取方式
• Section模式 • Sequence模式 • Volume模式
Section模式
• 选取角膜任意层次拍照，所见即所得，适合 一般角膜检查的常规图像采集。
0μm 表层鳞状上皮
30μm 上皮翼状细胞
40μm 柱状基底细胞
50μm 神经纤维丛
60μm 基底膜附近
100μm 浅基质层
400μm 深基质层
550μm 内皮细胞层
Sequence模式
• 在同一断层平面，以 10幅/秒速度连续记录 动态图像 ，适合角膜 动态病变的图像采集 （如角膜新生血管） 和患者配合较差时的 图像采集。
•山东省眼科医院 •青岛眼科医院 •山东大学齐鲁医院 •山西省眼科医院 •长治市人民医院 •哈尔滨二四二医院 •四川大学华西医院 •第三军医大学第二附属医院 •昆明眼科医院 •厦门眼科中心 •香港理工大学
棘阿米巴性角膜炎
离体组织学检查 (光学显微镜)
棘阿米巴滋养体
棘阿米巴包囊，部分呈 典型的串珠状排列
HSK基质型
上皮细胞排列紊乱
基底膜附近大量树突 状细胞聚集
基质层变性，失去正常 的网状结构
基质层内可见大量 新生血管
内皮细胞层大致正常
HSK内皮型
上皮细胞轻水肿， 排列紊乱
基底膜附近大量树突 状细胞聚集
Volume模式
• 沿Z轴方向动态连续纵 深扫描，每幅图像间 隔2μm，总体扫描厚 度80μm ，适合对病灶 的三维立体扫描，或 显示病变随深度增加 的变化趋势。
角膜共聚焦显微镜检查流程
角膜共聚焦显微镜检查流程
角膜共聚焦显微镜检查流程如下：
1、非接触型检查法更适用于儿童、心理紧张或角膜有术后新鲜伤口的患者。
受检者头部放置托架上，机器自动取像，根据所拍摄的照片分析角膜内皮的形态、大小，点击细胞数目分析角膜内皮的细胞密度。
也可应用计算机直接分析角膜内皮的细胞密度及大小，可对角膜上、中、下、鼻侧、预测几个点的内皮进行检查，分析后打印结果。
2、接触型检查法适用于配合检查的成年受检者。
用0.5%丁卡因滴眼液滴眼，进行角膜表面麻醉，患者头部固定于托架上，物镜须接触患者角膜，调节焦点使图像清晰，进行摄像或录像。
检查者坐在患者左侧，光学仪器和生物显微镜之间的角度为60-70°，嘱患者注视两仪器中间，使用16X放大倍数，3-4mm裂隙光线照射至角膜中间，对焦在角膜后部，调至40X 放大倍数。
黏多糖蓄积病角膜共焦激光显微镜表现一例
光 沉 积 物 以 及 粗 大 的 胶 原 纤 维 基 ， 质 细 胞 失 去 正 常 结 构 ( 图 3 ) ，
神经 纤 维 纤 细或显 示 不 清 ( 图 4 ) 。 角膜 内皮细胞 不 能显 示 图像 。
讨 论 ：黏 多 糖 蓄 积 病 根 据 其 临 床 表 现 、 生 化 特 征 和 遗 传 方
MPS I s
合 ( S c h e i e
综合征
)
MP S
、
( H ／S H u r l e r — S c h e i e
综
征) ，
为
图 2 角膜共焦激光显 微镜 下 角膜上 皮细胞 表现 ( × 800 ) 儿 童 B ：本 例 患 儿
A ：正 常
作 者 单 位 ：3 0 0 0 2 0 天 津 医 科 大 学 眼 科 临 床 学 院 天 津 市 眼 科 医 院 者 鸿 通 讯 作 ：蔡 英 ) ( E m a i l ：c h l c h l 0 1 1 8 @ is n a ． c o rn
京
：人
部呼
吸音
清
心 ，
律
齐
心
，
率
9
6
次 ／m i n
，心 前 区 可 闻收缩 期杂音 ，
腹 部 轻 度 膨 隆 肝 ， 肿 大 ， 肋 下 2 e m ；爪 形 手 。
双
眼视力
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03
不 ，
能矫 正 。 眼 睑 正 常 ， 睑 裂 高度 6 m m ， 角 膜 横 径 11 m m ， 纵 径 1 0 m Il l 呈 ． 均 匀 乳 状 混 浊
图 3 角膜共焦激光显 微镜 下角膜上 皮细胞 表现 ( × 800 ) 儿 童 B ：本 例 患 儿
激光共聚焦显微镜原理和应用
激光共聚焦显微镜原理和应用
激光共聚焦显微镜，又称双代理镜，是一种精密的衍射成像仪器，在
显微镜中用于研究各种微小样品的形态、结构和化学特性。
激光共聚焦显
微镜是一种高灵敏的、具有很高的分辨率的光学显微成像系统，在生物、
材料和分析科学等领域有着广泛的应用。
激光共聚焦显微镜的基本原理是利用一种双代理镜，其中一个代理镜
将外入的量子光束分成两部分，一部分照射到样品上，另一部分反射到另
一个代理镜上，两支平行光线通过要研究的样品，做出聚焦的衍射图像，
然后将衍射图像反射到接收端，接收端再将衍射图像转换成电子信号，然
后显示在屏幕上，这样就能将样品的形态、结构和化学组成辨认出来。
由于激光共聚焦显微镜的衍射成像效果比传统的光学显微镜要好，所
以在研究微小样品的形态、结构和化学组成时非常有用。
它可以用来观察
微小样品的形状和细节，如细胞、细菌和细胞器结构等，还可以观察抗原、抗体和药物在细胞和组织内的分布情况，在药物研发、生物医学、食品卫
生质量检测等多个领域得到了广泛的应用。
激光共聚焦显微镜成像原理及注意事项.
激光共聚焦显微镜成像原理及注意事项.激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy，简称LSCM）是一种高分辨率显微镜技术，能够在活体细胞和组织中实现光学切片成像。
其独特的成像原理使得它在生命科学研究中应用广泛，特别是对于三维结构的观察和表征。
本文将详细介绍激光共聚焦显微镜的成像原理及注意事项。
一、成像原理：激光共聚焦显微镜的成像原理基于共焦成像原理和激光扫描技术。
共焦成像原理是基于单一点扫描获得图像的原理，通过共焦点扫描光束与样品进行相互作用，并采集反射或荧光信号来生成图像。
激光扫描技术则是利用一个高速可移动的信号光束进行扫描，从而实现样品的成像。
具体来说，激光共聚焦显微镜的成像过程包括以下几个步骤：1. 激光束光路调节：将激光束从激光器引导到显微镜系统中。
这一步骤包括调节激光束的聚焦和对准光轴等操作。
2. 共焦原理叠加：在显微镜中，使用物镜透镜通过激光束得到一个具有良好成像性能的小孔径光斑，形成共焦光谱。
该光谱是适应共焦成像原理的基础工具。
3. 采集信号：通过光学扫描技术，将光谱移动到样品上，并定位到感兴趣区域。
当激光束与样品相互作用时，会发生反射或荧光的发射。
相应的反射或荧光信号通过探测器进行信号采集。
4. 图像生成：通过对采集到的反射或荧光信号进行数字化和处理，可以生成高分辨率的图像。
通过调节扫描参数，如扫描速度、激光功率和探测器灵敏度等，可以获得所需的图像质量。
二、注意事项：使用激光共聚焦显微镜进行成像时，需要注意以下几点：1. 样品的准备：样品的准备对于获得高质量的成像结果至关重要。
样品准备过程中需要避免损伤和变形，同时保持样品的生理状态和活性。
2. 激光功率的控制：激光束的强度对样品的损伤和成像结果具有重要影响。
因此，需要控制激光功率，避免过高的激光功率对样品造成伤害。
3. 扫描速度的选择：扫描速度过快可能导致图像模糊和细节丢失，扫描速度过慢则会增加成像时间。
角膜内皮细胞镜
二、眼病
1．圆锥角膜其内皮变化主要为：角膜内皮细胞呈多形化，有较小内皮细胞出现；多数细胞呈方向性增大，其长轴向着圆锥顶部；在急性圆锥病例，角膜中央局限性水肿及层间积液，局部有大的内皮细胞出现，为正常的7～10倍，被认为是内皮和后弹性膜破裂后修复的痕迹。
2．青光眼持续性高眼压可导致角膜内皮细胞受损。其表现为：总的内皮细胞数量降低，内皮细胞密度不同程度下降，细胞形态为多形性，可见大小不等的暗区。
3．眼内炎症由于眼内炎症的渗出物、炎性细胞不断刺激角膜内皮细胞，持续作用使角膜内皮细胞数量减少，内皮细胞坏死脱落后形成暗区。
三、角膜接触镜
长期戴角膜接触镜，可引起角膜慢性缺氧和代谢改变如乳酸增多等毒性物质堆集，造成角膜内皮细胞损伤。角膜内皮镜发现：角膜内皮细胞大小改变或六角形细胞数目减少，即影响了变异系数和六角形细胞百分比。因此，角膜内皮细胞的随访对安全配戴角膜接触镜是有临床意义的。
目前，临床上角膜内皮镜有两种类型，非接触型和接触型。
年齡31-40 41-50 51-60 61-80 80以上
CD值3000 2800 2600 2400-2500 2100-2400
SD(standard deviation):表示细胞面积标准差，理想值140以下。
CV(co-effient of variation):表示細胞面积变异系数，理想值30以下。
四、眼部手术
在内眼手术时，由于房水成分的改变，器械进出前房，以及手术对角膜的牵拉变形，均可或多或少地引起角膜内皮损伤，轻者仅为角膜暂时水肿，线状浑浊，严重者可导致角膜内皮失代偿，最终发生大泡性角膜病变，角膜完全混浊。
1．白内障手术白内障手术的改进，人工晶体植入的普遍应用，对手术者的技巧和手术前的检查角膜内皮细胞密度、形态、六角形细胞数目和变异系数等，要求更加严格，以防术后出现角膜内皮的损伤，导致角膜内皮失代偿。所以，术前了解角膜内皮的功能状态对提高手术安全性、筛选高危角膜患者具有重要意义。
激光共焦显微镜在真菌性角膜炎诊断中的应用
激光共焦显微镜在真菌性角膜炎诊断中的应用常青;王峰【摘要】AIM: To evaluate the value of Heidelberg retina tomograph 3-RCM (HRT3-RCM) in clinical diagnosis of fungalkeratitis.METHODS: Thirty-two eyes with clinical determined fungal keratitis were observed with HRT3 - RCM examination. In the same time, the corneal scraping was performed for all cases.RESULTS: In 32 patients, the positive rate of corneal scraping was 75% (24/32) and the positive rate of HRT3-RCM was 94% (30/32).CONCLUSION: HRT3-RCM, which is using laser as light source, is a new generation of confocal microscopy. It is a rapid, effective and noninvasive technique that can be used in the early diagnosis, treatment of fungal keratitis.%目的:探讨激光共焦显微镜HRT3-RCM在真菌性角膜炎诊断中的应用价值.方法:对临床拟诊真菌性角膜炎患者32例32眼行HRT3-RCM检查,同时进行角膜刮片细胞学检查.结果:在32例患者中,24例在角膜组织刮片中查到了菌丝,阳性率为75%;30例在激光共焦显微镜下观察到真菌菌丝,阳性率为94%.结论:HRT3-RCM是利用激光作为光源的新一代共焦显微镜,是一种快速、有效、无创的检查方法,可用于真菌性角膜炎的早期病原学诊断以及治疗观察.【期刊名称】《国际眼科杂志》【年(卷),期】2013(013)007【总页数】2页(P1457-1458)【关键词】真菌性角膜炎;激光共焦显微镜【作者】常青;王峰【作者单位】710002,中国陕西省西安市第一医院眼科;710004,中国陕西省西安市,西安交通大学第二附属医院眼科【正文语种】中文0 引言真菌性角膜溃疡是当前治疗比较棘手的化脓性角膜炎，随着抗生素、皮质类固酵和免疫抑制剂的广泛应用，该病有增多趋势。
海德堡(HRT)共焦激光角膜显微镜
独有的无菌角膜接触帽
独有的无菌角膜接触帽可避免交叉感染，使检查更安全。
独有的无菌角膜接触帽
激光在角膜上的反光点
接触角膜时反光点刚好位于需要 检查的部位，检查开始进行
技术参数
• • • • • • • 光学原理：共焦激光断层扫描技术 激光光源：670nm 水平分辨率：1um 纵向分辨率：1um 观测范围：400umx400um 放大倍率：800倍 扫描深度：1500um
病理：基底膜附近大小不等的沉积物
HRT3：基底膜附近可见大量强信号颗粒状物质沉积
海德堡HRT3-CM 共焦激光角膜显微镜
• 唯一的以共焦激光作为光源的角膜显微镜，清晰显示角膜
各层组织结构 • 800倍放大倍率，分辨率高达 1 µm
• 多种图像获取模式
Section——单一图像 Sequence——同一焦平面动态连续记录图像10幅/秒
非焦平面
海德堡HRT3-CM 产品四大特点：
• 全球第一台并且是唯一以共焦激光做为光 源的角膜显微镜 • 前所未有的角膜活体组织检查： 800倍放大倍率 分辨率高达1μm • 丰富的图像获取方式 • 完全无创的检查方式
0 µm
60 µm
10 µm
100 µm
30 µm
300 µm
40 µm
550 µm
棘阿米巴性角膜炎
离体组织学检查 (光学显微镜)
棘阿米巴滋养体
棘阿米巴包囊，部分呈 典型的串珠状排列
HSK基质型
上皮细胞排列紊乱
基底膜附近大量树突 状细胞聚集
基质层变性，失去正常 的网状结构
基质层内可见大量 新生血管
内皮细胞层大致正常
HSK内皮型
上皮细胞轻水肿， 排列紊乱
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共焦激光技术
影像探测器
聚光镜 针孔样结构 670 nm
焦平面
激光发生器
分光镜
Courtesy of J. Flanagan PhD, MCOpt
技术参数
• • • • • • • 光学原理：激光共焦纤维扫描技术 激光光源：670nm 水平分辨率：1um 纵向分辨率：1um 观测范围：400um*400um 放大倍率：800x 扫描深度：1500um
deth 117μm
06-09-18
06-09-18 滋养体
病变角膜组织切片内可见棘阿米巴包囊(箭头) ，PAS 染色×40
角膜基质层出现断裂，表示扫描区位于溃疡灶内，溃疡边 缘可见有细小圆形阿米巴包囊结构，包囊中心可见白色高反光 区。
阿米巴性角膜炎的 微囊
离体组织学检查 (光学显微镜)
活体检查 (HRT 3)
共焦显微镜下见，前弹力层局部出现皱褶，上皮下角 膜神经穿过皱褶处见皱褶甚至断裂。
患者，XXX，女，既往患双眼病毒性角膜炎史三年， 三年来双眼反复发作，来我院行共焦显微镜检查示，双 眼角膜上皮下神经广泛断裂，局部扭曲。
真菌性角膜炎
病因：致病真菌直接侵入角膜感染所致。多
见于农业性外伤（植物擦伤）或剔除泥土、
单纯疱疹病毒性角膜炎
树枝状角膜炎
• 可为单发或多发，组织学上的上皮损害表 现为沿树枝状走行曲的细胞丧失。 • 单个损害可扩大，或邻近的损害融合成大 的病灶，形态不规则，呈“地图状”损害， 组织学上“地图状”损害可累及基底层上 皮细胞。 • 反复感染可累及角膜深层。 • 角膜上皮下感觉神经丛及上皮内神经末梢 受损，从而出现角膜知觉减退。
砂石等角膜异物后。 感染源：常见为曲霉菌、镰刀菌、白色念珠
菌、头孢霉菌、酵母菌。
病理：
• 早期角膜基质有脓疡形成，周围基质有卫星状浸 润坏死灶，内有破碎的板层和中性粒细胞浸润， 坏死灶内很少见完整的霉菌，但周围基质内却有 大量菌丝。 • 随着病情进展，临近脓疡趋于愈合，坏死物质连 同表面组织脱落形成溃疡，坏死程度依霉菌毒力、 抗原性、菌株种类而异。 • 部分霉菌可穿过后弹力层，形成角膜穿孔。 • 适当的抗霉菌治疗可使溃疡愈合而留有白斑， 若发生穿孔，常形成粘连性角膜白斑。
独有的纵向断层扫描
角膜内皮细胞计数功能
临床应用
药物毒性眼表病变
• 42岁男性 • 左眼“霰粒肿”手术 后长期频点各种抗生 素滴眼液3月余 • 左眼红痛、流泪2月
治疗1月余
棘阿米巴性角膜炎
感染源：棘阿米巴原虫
病理： • 病变早期累及上皮，成假树枝状上皮混浊。 • 病灶反复破溃和愈合，渐向基质深层发展， 有大小不等斑片状或盘状基质混浊。 • 晚期可发生溃疡穿孔。 诊断：角膜刮片后培养找到阿米巴原虫； 共焦显微镜阿米巴包囊
棘阿米巴性角膜炎
病例1 患者女，19岁，学生. 过夜配戴OK镜后出现左眼 红、疼痛、视力下降1月
deth 22μm
06-08-30
06-08-30 包囊
病例2
患者女, 22岁，学生. 配戴隐形眼镜后右眼红， 畏光，视力下降1月
deth 44μm
06-11-10
06-11-10 滋养体
病例3
患者女，19岁，学生. 过夜配戴OK镜后左眼红、 疼痛、视力下降1月
诊断： • 临床表现 • 坏死组织真菌培养 • 坏死组织涂片检查：找到真菌菌丝 • 角膜共焦显微镜检查：活体直接找到菌丝。
角膜浅基质层基质紊乱，可见大量菌丝分布，基质层结构破 坏，散在分布炎性细胞。
予全身及局部抗真菌治疗一周后复查共焦显微 镜，可见菌丝有明显减少。
患者，XXX，因“左眼眼痛、畏光、视物不见两月”， 外院诊断“真菌性角膜炎”，予抗真菌治疗后症状好转，但 视力无明显提高。入院行角膜共焦显微镜检查可见基质有高 反光区域，仅少量短小菌丝结构，但可见大量树突状细胞散 在分布于基质层内。
真菌性角膜炎
颗粒状角膜营养不良
组织病理学变化：角膜上皮变薄，前弹力 层破坏，实质浅层细胞内外有淡嗜伊红染 色颗粒状物，从实质层经过前弹力层破损 处进入上皮层内。
上皮和前弹力层尚完整，基底细胞失去极化，上皮下有颗粒 物质沉着，前弹力层消失。实质层内亦有颗粒或面包屑样物 质沉着，且部分融合成团块状。
50 µm
Tiefe:
0 µm
10 µm
30 µm
40 µm
62 µm
100 µm
300 µm
572 µm
Sequence模式：同一焦平面动 态扫描
同一焦平面动态连续记录图像 10幅/秒
Volumn模式：序列扫描图
沿Z轴向后 连续动态扫 描，每幅图 像间隔 2um ，共连续向 后扫描40幅 图像，深度 80µm
• 在角膜病诊断中应用的特点 活体组织切片 定性与定量分析 无创伤性 动态观察
0 µm
62 µm
10 µm
100 µm
30 µm
300 µm
40 µm
572 µm
检 查 窗口
HRTII角膜激光共焦显微镜
上皮细胞 - 30 µm
基质 - 300 µm
内皮细胞– 570 µm
四种检查模式
Section模式：可获取角膜不同深度的地形图
角膜上皮细胞呈局限性蜂窝状改变，细胞反光增强， 上皮层和基质层可见大量强反光区域，病变局限，与正常 组织分界清晰。
激光角膜共焦显微镜
角膜的基本解剖结构
• • • • • 上皮细胞层 前弹力层 基质层 后弹力层 内皮细胞层
激光共焦显微镜的原理
• 光源为波长670 nm的二极管激光源 • 激光束聚焦在角膜焦平面，通过振荡镜周期性的移 动,连续扫描获得角膜各层二维图像。 • 光敏探测器可以测到每一点的光反射强度,接收焦 平面上的反射光及其周围的散射光。 • 共焦平面可以通过焦平面调解环进行手动调解,因 此可获得角膜各个层面的图像,一系列不同共焦平 面的图像染的同时或之后发生，为一种亚急性 或慢性坏死性炎症。 • 轻型病例角膜混浊可完全吸收，长期或复发性病 例，基质炎症由前弹力层扩展至深层基质。 • 病变早期表现为板层水肿，细胞内和细胞间有液 体积聚 • 随着炎症发展，板层可发生断裂，白细胞从角膜 缘倾入病灶， • 晚期板层破坏严重，见大量巨噬细胞，血管侵入 坏死灶，出现炎性肉芽肿性病变。 • 最终出现不规则胶原沉积。