第二章_培养基灭菌1

不同种的微生物的热死 灭反应的△E各不相同， 对于某种微生物，在一 定的T下作灭菌实验， 求得相应的K值 ，按lnK——1/T作图， 从直线的斜率可求出△E。
微生物的热死灭动力学
（2）K、△E、T三者之间的关系
K=f(△E、T) K A e 一定温度下，对特定的菌体来说△E是定值，那么 在热灭菌过程中能控制的因素是什么： 温度 T 那么温度高一些灭菌好呢？还是温度低一些好 呢？ （这是要讨论解决的问题） 从式子ln K = - △E /RT + ln A来看，T升高，K增大 灭菌的目的：有效杀灭杂菌，同时尽可能降低对营养 的破坏程度。 对培养基进行灭菌，培养基中营养物质和微生物的△E 不同。 K增大的幅度还取决于△E 。
例：
嗜热脂肪芽胞杆菌孢子 和 维 生 素 B1 的 热 处 理 数 据 （一定 T 下， ln(N/N0 ) = - K t ），就不同的 T，求 得前者的比热死亡速率常数 KBS 和后者的比破坏速率常 数 KVB， 按 lnK——1/T 标 会 ， 得图，由图算出： • △EBS=67000×4.184 J/mol • △EVB=22000×4.184 J/mol • ln K = - △E /RT + ln A
微生物的热死灭动力学
K除了决定于菌体的种类或存在的方式以外，更 重要的是温度 T 对 K 的影响，这是热灭菌工程设计 中的核心问题。（在什么温度下灭菌好？） K随着温度的变化而变化。研究结果表明，温度 和菌种与K的关系可用阿伦尼乌斯方程来表示：
K A e
E / RT
式中 A：频率因子，min-1 △E：菌体死灭反应活化能，J/mol R：气体常数 8.28J/mol· K T：绝对温度
进行培养基灭菌的操作方式 • 分批（间歇）灭菌 • 连续灭菌
对液体培养基的湿热灭菌是指：将培养基中杂菌总 数N0杀灭到可以接受的总数N，至于所需的温度和 时间，决定于
Hale Waihona Puke • 杂菌孢子的热死灭动力学 • 培养基中有效成分受热破坏的可接受程度 • 反应器的形式和操作方法
• 微生物的热死灭动力学（对数残留定律 ）
上表是含有维生素B1的培养基中，将其中的嗜热脂肪 芽胞杆菌孢子杀菌至N/N0=10-16时，不同灭菌温度下灭 菌所需要的灭菌时间和维生素B1受热破坏的数据。
微生物的热死灭动力学
高温短时灭菌方法是灭菌 动力学得出的重要结论，它既 能快速灭菌，又能有效地保存 培养基中的营养成分。
需要无菌的单元和措施:
• 1)培养基和设备需经灭菌 • 2) 好氧培养过程中使用的空气应经除菌 处理 • 3) 设备应严密，生物反应器中要维持高 于环境压力 • 4) 使用无污染的纯粹种子 • 5)培养过程中加入的物料也要经过灭菌
无菌状态: 从系统中杀死或者清除所有活 的微生物和他们的孢子. 培养基的灭菌：杀灭或者除去培养基中有 生活能力的细菌营养体及其孢子。杀灭比 除去杂菌更加常用。
微生物的热死灭动力学
在对培养基进行热灭菌时，在杂菌死亡的同时， 培养基中一些不太稳定的成分也会因受热而破坏， 例如：糖溶液会焦化，蛋白质会变性，维生素失 去活性，醛糖与氨基化合物反应——美拉德反应， 一些化合物会发生水解。 营养物质的受热破坏也可以看作一级反应：
dc Kd c dt
ln(C/C0 ) = -Kd t
第二章 培养基灭菌
• 微生物的培养过程： 培养基配制→灭菌→接种→培养
•
为什么要进行培养基灭菌？
• 1) 生物反应的基质或产物因杂菌的消耗而 损失，造成生产能力的下降。 • 2) 由于杂菌所产生的一些代谢产物改变了 发酵液的某些理化性质，使目标产物的提 取困难，造成收得率降低或使产品质量下 降。 • 3) 污染的杂菌可能会分解产物，而使生产 失效。 • 4) 发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解， 而使生产失效。
对培养基进行湿热灭菌时，培养基中的微生物 受热死亡（微生物体内蛋白质变性）的速率与残存 的微生物数量成正比。
dN kN dt
均相系统，它 符合化学反应 的一级反应动 力学。
N：培养基中任一时刻的活微生物浓度（个/L） t：灭菌时间min K：比热死亡速率常数min-1
dN kN dt 上式适合于灭菌过程的任意时刻。 为了对灭菌全过程进行考虑，上式作 变上限积分，取边界条件t0=0 N=N0 积分式：
•
即使同一种微生物，其营养细胞和 芽胞的 K 值也有很大的差别，营养细 胞易于受热死亡，K值很高。120℃灭 菌K值可大致为1010（min-1）数量级， 而细菌孢子的K值在120℃只有10数量 级，下表是典型微生物培养环境中各 种微生物对湿热灭菌的相对热阻。
微生物的热死灭动力学
热阻越大，越不易杀灭，K值小。对培养基进行 热灭菌，必须以细菌的孢子为杀灭对象。
杂菌 dN kN dt ln(N/N0 ) = -K t
营养物质 dc Kd c dt ln(C/C0 ) = -Kd t
K A e
△T
E / RT
Kd A'e
△K △ Kd
E ' / RT
K对T的变化率是怎么样的？
K A e
E / RT
从上式可以做如下几点分析： （1）△E值可求 上式取对数得：ln K = - △E /RT + ln A
灭菌:是指用物理或化学方法杀灭物料或设 备中的一切生命物质的过程。
常见的灭菌和消毒的物理方法
常用控菌的化学方法
常用的灭菌方法 :
• 湿热灭菌Steam Sterilization (121℃,2030min） • 干热灭菌Dry heat sterilization （160℃保 温1～2h,玻璃器皿等） • 化学除菌 • 过滤除菌Filtration(澄清流体的除菌,air ) • 射线灭菌Irradiation （紫外线穿透力低，仅 用于表面消毒和空气的消毒）
微生物的热死灭动力学
根据上图，若把灭菌 温 度 从 1 0 5 ℃ （1/T=2.64×10-3）提高 到 1 2 7 ℃ （ 1 / T= 2.50×10 -3 ），则KVB从 0 . 0 2 min-1 增 大 到 0 . 0 6 min-1，KBS 从 0.12 增大到 40.0 min-1，也就是说， 灭菌温度提高了 22 ℃， 嗜热脂肪芽胞杆菌孢子 的比热死亡速率增大 330 倍，而维生素 Bd 比热死 亡速率仅仅增加了3倍。
E / RT
求一个变量（K）对另一个变量（T）的变化率 是 导数问题。 对ln K = - △E /RT + ln A 两边求T的导数
d (ln K ) E 2 dT RT d(lnK)/dT =△E/RT2 ，d(lnKd)/dT=△E’/RT2
现在看
d (ln K ) dT
和△E的关系：
N ln Kt No
N No
:存活率,无菌程度；t：灭菌时间
•
将存活率 与灭菌时间t在半对数坐 标纸上标绘可以得到直线。直线斜率K。
N No
K值越大表示微 生物越容易死亡
N Kt ln No
K（比热死亡速率常数）由两个因素决定 1、灭菌温度 2、微生物的种类和存在方式 在一定温度下，比热死亡速率常数K随微 生物种类不同而不同。例如，在121℃， 枯草芽胞杆菌FS5230的K：0.047～0.063s-1； 梭状芽胞杆菌PA3679的K：0.03 s-1； 嗜热脂肪杆菌FS1518的K：0.013 s-1。
C：对热不稳定物质的浓度 Kd :热不稳定物质的分解速率常数s-1。
分解速率常数Kd随物质种类和温度而 不同（营养物质中维生素最容易被破坏， Kd最大），温度对Kd 的影响也遵循阿伦 尼乌斯方程：
Kd A'e
E '/ RT
A′：系数； R：气体常数；T：绝对温度 △E′：不稳定物质热分解反应的活化能。
d (ln K ) dT
△E 越大，
越大。
灭菌动力学的重要结论
细菌孢子热死灭反应的△E很高，而大部分营 养物质热破坏反应的△E很低，因而将T提高到一定程 度会加速细菌孢子的死灭速率K，从而缩短在升高温 度下的灭菌时间（ ln(N/N0 ) = - K t ）；由于营养 成分热破坏的△E很低，上述的温度提高只能稍微增 大其热破坏程度Kd，但由于灭菌时间的显著缩短，结 果是营养成分的破坏量在允许的范围内。 结论：提高温度对培养基灭菌更有利。高温短时灭菌 既能快速灭菌，又能有效保存培养基中一些有效成分