基因功能鉴定 异源表达
酶蛋白的异源表达的意义和作用
酶蛋白的异源表达的意义和作用
摘要：
1.酶蛋白异源表达的定义和意义
2.酶蛋白异源表达的作用
3.酶蛋白异源表达的应用实例
4.酶蛋白异源表达的发展前景
正文：
一、酶蛋白异源表达的定义和意义
酶蛋白异源表达是指将外源基因插入到受体细胞的基因组中，使外源基因在受体细胞内表达，从而产生相应的酶蛋白。
酶蛋白异源表达的意义在于，它可以使受体细胞拥有原本没有的酶蛋白，从而赋予受体细胞新的功能。
二、酶蛋白异源表达的作用
酶蛋白异源表达的作用主要体现在以下几个方面：
1.提高生产效率：通过酶蛋白异源表达，可以使受体细胞产生更多的酶蛋白，从而提高生产效率。
2.改变生产过程：酶蛋白异源表达可以使受体细胞产生新的酶蛋白，从而改变生产过程，提高生产质量。
3.赋予新功能：酶蛋白异源表达可以使受体细胞拥有原本没有的酶蛋白，从而赋予受体细胞新的功能。
三、酶蛋白异源表达的应用实例
酶蛋白异源表达在实际应用中具有广泛的应用前景，例如：
1.在农业领域，通过酶蛋白异源表达，可以提高作物的抗病虫能力和抗逆能力，从而提高产量和质量。
2.在医学领域，通过酶蛋白异源表达，可以生产出更多的药物，从而提高药物的生产效率。
3.在环保领域，通过酶蛋白异源表达，可以利用微生物分解污染物，从而提高环境保护的效果。
四、酶蛋白异源表达的发展前景
随着科学技术的不断发展，酶蛋白异源表达技术也在不断完善和提高。
乳酸菌素基因PlnE和PlnF在大肠杆菌中的异源表达
乳酸菌素基因PlnE和PlnF在大肠杆菌中的异源表达杨芳,余占桥,张日俊(中国农业大学饲料生物技术实验室,动物营养学国家重点实验室,北京 100193)摘要:为获得高产量纯品植物乳杆菌素PlnE和PlnF,研究其开发生物兽药的可能,试验通过人工合成植物乳杆菌素基因PlnE和P lnF,构建表达载体pG EX 4T E和pGEX 4T F,经IPT G诱导表达条件优化后,进行亲和层析纯化融合表达蛋白,并使用SDS PA GE进行鉴定。
试验结果表明,pGEX 4T E和pGEX 4T F构建成功,纯化后获得2种产量高达30%的纯品融合蛋白,SDS PA G E鉴定两融合蛋白表达正确。
说明PlnE和P lnF基因片段编码的多肽能在原核细胞中正确表达,为进一步研究该细菌素的生物活性奠定了基础。
关键词:植物乳酸杆菌;细菌素;原核表达;融合蛋白中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号:1671 7236(2010)12 0055 05细菌素是由某些细菌通过基因编码、核糖体途径合成的一类具有抗菌活性的多肽、蛋白质及其衍生物,产生菌对其细菌素具有自身免疫性(Ander s son等,1998;Riley等,2002;T orkar等,2003;Car o lissen M ackay等,1997)。
由于细菌素与抗生素相比无抗药性和残留性,目前国内外对细菌素的研究多数集中在开发替代抗生素治疗使用的生物保健剂和兽药上。
NCBI数据库中确定基因和蛋白质序列的细菌素有数百种,然而仅有一种羊毛硫细菌素Nisin用于食品防腐,绝大多数处于试验阶段,究其原因主要是产细菌素的野生菌株产量低,分离纯化困难,距离产业化生产还有很长距离。
研究结果发现,细菌素异源表达对象多为 a类单肽链非修饰细菌素,最终获得的产物活性产量差异较大(余占桥等,2009)。
低水平异源表达的主要原因是直接表达的细菌素肽链对宿主细胞具有毒害作用,抑制其生长。
使用蛋白质表达技术进行异源蛋白质表达群的分析
使用蛋白质表达技术进行异源蛋白质表达群的分析蛋白质表达技术是一种重要的实验手段，可以用于研究和生产异源蛋白质。
异源蛋白质表达群是指一组表达相同外源基因产物的细胞或生物体群体。
通过对异源蛋白质表达群的分析，可以揭示蛋白质的结构、功能及其在生物学过程中的作用，对于药物研发和基因工程等领域具有重要意义。
一、异源蛋白质表达群的构建在进行异源蛋白质表达群的分析之前，首先需要构建目标蛋白质的表达载体。
表达载体是一种带有目标基因的DNA分子，可以使该基因在细胞内得以表达。
常用的表达载体包括质粒、病毒和细胞系等。
1. 质粒表达系统质粒表达系统通常使用大肠杆菌作为宿主细胞。
将目标基因插入含有启动子、终止子和选择性标记等功能元素的质粒中，经过转化、筛选和培养等步骤，使目标基因在大肠杆菌中表达。
2. 病毒表达系统病毒表达系统常用于哺乳动物细胞。
将目标基因插入病毒载体中，经过转染和感染等步骤，使目标基因在宿主细胞中得到高效表达。
常用的病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒和军团菌病毒等。
3. 细胞系表达系统细胞系表达系统是直接使用细胞系作为表达载体。
将目标基因通过基因操纵技术导入细胞系中，使其在细胞系中表达。
常用的细胞系包括CHO细胞和HEK293细胞等。
二、异源蛋白质表达群的分析方法异源蛋白质表达群的分析主要通过鉴定和定量目标蛋白质的表达水平、结构特征和活性等方面。
1. 蛋白质鉴定蛋白质鉴定是对异源蛋白质表达群中的目标蛋白质进行鉴定和定位。
常用的方法包括质谱法、免疫印迹和糖基化分析等。
质谱法可以通过检测蛋白质分子质量和氨基酸序列来鉴定目标蛋白质；免疫印迹可以通过特异性抗体与目标蛋白质结合来检测目标蛋白质的存在；糖基化分析可以揭示蛋白质的修饰情况及其对结构和功能的影响。
2. 表达水平定量表达水平定量是对异源蛋白质表达群中目标蛋白质的表达量进行定量分析。
常用的方法包括荧光素酶报告基因法、荧光染料标记法和放射性同位素标记法等。
荧光素酶报告基因法通过检测报告基因与目标基因的转录水平关系来估计目标蛋白质的表达水平；荧光染料标记法可以通过检测荧光信号强度来定量目标蛋白质；放射性同位素标记法可以通过检测放射性同位素的衰减来估计目标蛋白质的表达水平。
异源基因表达系统
（3）分泌表达载体
由于蛋白在表达过程中常形成包涵体， 克服此类问题的主要方式是以分泌表达形式， 将蛋白运送到外周质、外膜甚至进入培养介 质中，这需要在信号肽的帮助下完成。
正因为伴侣蛋白具有促进蛋白质正确折叠的 能力，因此，人们试图通过与伴侣蛋白的共表达 来避免包涵体的产生．
（6）表面呈现表达载体
表面呈现表达分两种情况：一种是噬菌体表面呈 现技术．另一种是细菌表面呈现。
此处仅讨论后一种。细菌表面呈现表达优越性在 于：可以提供活疫苗及有利于寻找药物；有助于研
•虽然该方法改进了生产哺乳动物基因产物的能力，但并不是 万能的。产物溶解性和二硫桥正确的排列仍然是使用大肠杆菌 进行异种基因表达最大的障碍。
通过改变细胞的折叠机制提高产品质量
1. 如果我们设计生产的蛋白在一种热力学不稳定的状 态，我们则无法获得这种可溶性蛋白。
2. 细胞会使用分子伴侣（阻止聚集作用的路径）和可 折叠的催化剂（促进可折叠过程的特殊阶段）来制 造一个合适的折叠蛋白分子。
原核生物中表达真核基因产物
•大肠杆菌仍然是异源基因产物表达的热门宿主。 尽管有多年的大量实验室经验，当在原核生物中
表达真核基因产物时，与产物质量相关的争论依然存 在。 •大肠杆菌的密码子偏爱性与哺乳动物系统有很大不同， 当在这种细菌中尝试表达哺乳动物基因产物时会出现 问题。
密码子的遗传背景
基因表达中的主要影响因素现在已经非常清楚。 稀有密码子聚类能够导致核糖体的暂停和移码，
减低目的基因产物的产量导致不可靠地截断产物 的生成。 密码子遗传背景影响的位置敏感性在3’端的遗传 信息比在5 ’末端更严重。 通过改变较大肠杆菌或为大肠杆菌宿主解码稀有 碱基的供体tRNA偏爱密码子稀有使用的密码子容 易补救二者之一。
异源和同源 dmrt1 基因过表达载体在青鳉体内的整合和表达
1. 中国水产科学研究院 黄海水产研究所, 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室, 山东 青岛 266071; 2. 上海海洋大学 水产与生命学院, 上海 201306; 3. 大连海洋大学 水产与生命学院, 辽宁 大连 116023
摘要: 利用半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) dmrt1 基因和青鳉(Oryzias latipe) dmrt1 基因构建过表达载体, 采用显 微注射技术将两种载体分别导入青鳉受精卵中, 比较异源和同源 dmrt1 基因对青鳉胚胎孵化率的影响以及两种 dmrt1 基因在青鳉体内的基因整合率、基因表达率及对芳香化酶基因(cyp19a)表达的影响。结果表明, 注射 48 h 后, 两种载体均在胚胎内大量表达, 注射青鳉同源性 dmrt1 载体的受精卵孵化率(69.5%)要显著高于注射异源性 dmrt1 载体的受精卵(36.5%)。30 dph(days post hatching)两组被注射稚鱼均能检测到基因整合, 注射同源 dmrt1 的整合率 (30%)要高于异源 dmrt1(10%)。30 dph 稚鱼体内检测不到异源性 dmrt1 载体的表达, 但能检测到同源 dmrt1 载体的 mRNA 表达, 同时芳香化酶基因的表达受到了抑制。本研究为研究舌鳎性别分化相关基因功能提供了基础, 并为 在模式鱼类中研究海水鱼相关基因功能累积了必要的资料。
青海湖盐单胞茵QHL1ectABC基因簇克隆鉴定及二氨基丁酸转氨酶基因ectB的异源表达
生 物 学 杂 志
Ｊ ＯＵＲ ＮＡＬ Ｏ Ｆ Ｂ Ｉ Ｏ Ｌ ＯＧＹ
Ｖｏ ｌ ＿ ３０ Ｎｏ ． ２
Ａｐｒ ，２ ０１ ３
ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． ２ ０ ９ ５—１ ７ ３ ６ ． ２ ０ １ ３ ． ０ ２ ． ０ ０ ５
Ｈ ａ ｌ ｏ ｌ ｎ Ｏ Ｉ Ｉ ￣ Ｓ ｓ ｐ ．Ｎ ｊ ２ ２ ３ ｅ ｃ ｔ Ａ Ｂ Ｃ基 因簇 所 编 码 的 酶 蛋 白相 似 性 分 别 达 ５ ７ ％、 ９ ６ ％和 ８ ５ ％ 。利 用分 子 克 隆技 术 构 建 二 氨
基 丁酸转氨 酶基 因 ｅ ｃ ｔ Ｂ的重组表达 载体 ｐ Ｅ Ｔ ２ ８ 一 ｅ ｃ ｔ Ｂ， 通过 限制 性 内切 酶酶切 和 测序 分析 ， 结果表 明其 目的基 因的
Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｔ ｈ ｅ ｍ ｏ ｄ ｅ ｒ ａ ｔ ｅ ｈ ａ ｌ ｏ ｐ ｈ ｉ ｌ ｅ Ｑ Ｈ Ｌ １ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｆ ｒ ｏ ｍ ２ ０ ｗ ａ ｔ ｅ ｒ ｓ ａ ｍ ｐ ｌ ｅ ｓ ｏ ｆ Ｑ ｉ ｎ ｇ ｈ ａ ｉ Ｌ ａ ｋ ｅ ｗ ａ ｓ ｐ ｒ ｅ ｌ ｉ ｍｉ ｎ ａ ｒ ｉ ｌ ｙ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｉ ｆ ｅ ｄ ａ ｓ ａ ｍ ｅ ｍｂ ｅ ｒ ｏ ｆ
ｔ ｈ ｅ ｇ ｅ ｎ ｕ ｓ Ｈｏ ｌ ｏ ｍｏ ｎ ａ ｓ ．Ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｎ ｓ ｅ ｒ ｖ ｅ ｄ ｅ ｃ ｔ Ｂ ｇ ｅ ｎ ｅ ｏ ｆ １ ２ ６ ９ ｂ ｐ ｒｏ ｆ ｍ ｔ ｈ ｉ ｓ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｗａ ｓ ａ ｍｐ ｌ ｉ ｉ ｆ ｅ ｄ ｂ ｙ Ｐ Ｃ Ｒ．Ｔ ｈ ｅ ｅ ｃ ｔ ＡＢ Ｃ ｇ ｅ ｎ ｅ ｃ ｌ ｕ ｓ ｔ ｅ ｒ ｆ ｏ ｒ ｂ ｉ ｏ ｓ ｙ ｎ —
基因差异表达的研究方法
基因差异表达的研究方法摘要寻找差异表达基因成为目前基因研究的一个非常重要的手段。
寻找差异表达基因的方法有消减杂交法、mRNA 差异显示、代表性差异分析法、基因表达的序列分析、抑制消减杂交、表达序列标签、cDNA微阵列、半定量PCR、定量PCR。
特综述以上各种方法的原理、方法过程、优缺点及其应用，随着科学技术的发展对差异表达基因的研究会更加完善。
关键词基因；差异表达；消减杂交；差异显示；研究方法在真核生物的生命现象中，从个体的发育、生长、衰老、死亡，到组织、细胞的分化、凋亡或肿瘤的恶化以及细胞对各种生物、理化因子的应答，本质上都涉及基因在时间上或空间上的选择性表达，即基因的差异表达。
基因的差异表达与组织、细胞的生物学性状和功能密切相关，成为生命科学的重要研究课题（潘美辉等，1997）。
比较不同细胞或不同基因型在基因表达上的差异，不仅是研究生命过程分子机制的基础，亦是分离克隆目的基因的前提（胡昌华，2001）。
寻找差异表达基因成为目前基因研究的一个非常重要的内容。
差异表达的基因通常用稳定状态下mRNA的丰度高低有无来比较。
差异表达基因有2个含义，即表达基因的种类改变和基因表达量的变化。
通过它能找到疾病不同阶段、不同状态下表达不同丰度的基因，从而为进一步研究打下基础。
分离和鉴定差异表达基因是了解各项生命活动和疾病分子调控机制的重要手段（梁自文，2001）。
笔者拟对目前现有的寻找差异基因的方法作一综述。
1消减杂交法（subtractive hybridization）消减杂交在1984年由Palmer和Lamer（Lamar EE et at.，1984）提出，其目的是分离出两类同源分子间差异表达的基因，关键是利用分子杂交原理去除共同序列，保留差异序列，通过PCR多次循环扩增而分离，从而能进一步研究其差异表达基因。
具体做法：首先以oligo-dT为引物，从tester中制备放射性标记的单链cDNA 文库。
异源表达
异源表达确实是个很困难的课题，不同的体系、菌种、载体，不同的组合，确实不知道会有哪种适合目的基因另外重组工程菌的稳定性也是个难题，不过有不同的难度：1。
以质粒的形式存在于菌体里，以质粒表达这种一般保存还是容易的，多数情况下用抗生素压着就问题不大，而且直接用质粒保存，用时现转也能顺利表达的情况也有的是2。
重组在宿主基因组中，与宿主蛋白一起表达这就保存起来比较困难了，毕竟不是原装货，很有可能穿几代以后就被踢出来了，有时即使没有踢出来也不表达了(我就遇到过，鉴定基因还在，就是不表达了)，很有可能插入的位点在宿主基因组的非活跃区域，过几代就基因沉默了。
一般个人认为可以一试的方法包括(1)用抗生素传代、保菌后抗生素复苏等等(2)得到工程菌后第一代就保10管，取一管传一代再保10管，再取一管做使用菌株，也就是保存最原始的菌种(3)筛选时多筛点，几十个菌株同时传代，5代以后(其实最好10-30代，可惜一般没那个精力)还能保留表达能力的算相对比较稳定了异源蛋白的表达是个很复杂的问题，有许许多多的影响因素，而且由于蛋白本身千差万别，很难有一个很完善或很标准的流程方法。
另外，表达的宿主也是多种多样，目前比较常用的包括 E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动物细胞等，各自有着其本身的特点，优缺点各异。
但是，异源表达又是分子生物学中很重要的一个工具，园子里不少战友都在做这方面的工作，许多帖子在讨论这方面的问题。
因此想发起一个针对这方面的专题讨论，希望有助于大家的工作，当然也希望能对自己的工作有所帮助，欢迎大家讨论。
还有，由于本人只做了有关E.coli和甲醇酵母的工作，其他虽然我们研究所也有人做，但毕竟本身没做过，若有错误或不严谨的地方欢迎战友们指正。
首先在这里提出几方面问题，希望大家讨论：1. 宿主的选择。
表达宿主虽众多，但比较常用的也就 E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动物细胞等，各自代表了一种体系。
漆酶基因异源表达及其酶活性的研究进展
漆酶基因异源表达及其酶活性的研究进展刘晓庆;那日;郭九峰【摘要】近年来由于漆酶在生物漂白和农作物秸秆利用等方面具有广阔的应用前景,对漆酶的研究越来越受到国内外学者的重视.然而,自然界漆酶的产量和酶活较低,难以适应工业化生产需求.此外,漆酶的产酶效率低,成本高.实现漆酶的异源高效表达是解决这一问题的有效途径.目前,国内外已有多种来源的漆酶基因被成功克隆,并在不同的宿主细胞中实现异源表达,但迄今为止漆酶基因异源袁达结果仍然不理想,离真正实现漆酶的高效表达还有一定距离.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2016(000)001【总页数】4页(P18-21)【关键词】漆酶;宿主细胞;异源表达;基因克隆;酶活性【作者】刘晓庆;那日;郭九峰【作者单位】内蒙古大学物理科学与技术学院,内蒙古呼和浩特010021;内蒙古大学自治区离子束生物工程重点实验室,内蒙古呼和浩特010021;内蒙古大学自治区离子束生物工程重点实验室,内蒙古呼和浩特010021;内蒙古大学自治区离子束生物工程重点实验室,内蒙古呼和浩特010021【正文语种】中文【中图分类】S188漆酶(laccase，Ec1.10.32)属于含铜的多酚氧化酶，能有效降解自然界中木质素等复杂有机物。
真菌和植物中都可以分泌漆酶，少数的昆虫和细菌也可以分泌漆酶，而真菌是漆酶的主要生产者。
它通过获得O2对苯酚物质进行催化作用，而生成物中仅有水。
漆酶是一种不可多得的环保型氧化酶。
漆酶是参与自然界木质素循环与利用的重要酶之一。
漆酶对富含木质素的农作物残渣的有效降解作用不仅可以减少秸秆焚烧带来的环境问题，而且可以提高青贮饲料的品质和利用率，对与木质素结构相似的污染物也有明显的降解能力。
据统计，漆酶有作用底物250多种[1]1。
漆酶的底物多样性决定了它是一种多功能氧化酶。
它在工业、农业及食品工业都有着极其广泛的应用。
近年来研究表明，漆酶在生物技术方面也有重要的作用，可用于生物传感器与生物检测。
异源表达番茄蔗糖磷酸合成酶基因SlSPS促进拟南芥株型增大研究
河北农业大学学报 JOURNAL OF HEBEI AGRICULTURAL UNIVERSITY
Vol.44 No.3 May.2 0 2 1
文章编号：1000-1573(2021)03-0034-07
DOI：10.13320/ki.jauh.2021.0044
干旱促进水稻中 SPS 活性增加［17］。高盐处理下的 玉米秧苗的 SPS 活性增加［18］。本研究将番茄中的 1 个 SlSPS 基因转化拟南芥进行异源过量表达，并 对转基因的拟南芥进行表型观察发现，揭示 SlSPS 基因影响植物生长发育和蔗糖积累的生物学功能， 对番茄的产量和品质改良及其生产应用提供理论 依据。
研究发现，植物内不同的 SPS 家族基因的表达 特性不同，所发挥的功能也存在着共性和差异性。 反义表达 CmSPS1 的转基因甜瓜蔗糖含量下降、果 实变小［12］；转菠菜 SPS 基因的棉花表现出更高的 蔗糖 / 淀粉比率，棉花纤维细胞次生壁增厚，品质 提高［13］；转玉米 SPS 基因的马铃薯叶片 SPS 活性 提高，叶片抗衰老，产量增加、蔗糖含量提高［14］。 南极发草在南极夏天长白昼的环境下，SPS 活性极 高，蔗糖超量积累从而适应极端寒冷气候［15］。低 温处理下猕猴桃果实的 SPS 基因转录水平提高［16］。
异源表达番茄蔗糖磷酸合成酶基因 SlSPS
促进拟南芥株型增大研究
刘雅慧，朱龙英，杨学东，朱为民，张 辉，张迎迎
（上海市农业科学院 园艺研究所 / 上海市设施园艺技术重点实验室，上海 201403）
摘要：为了探究番茄 SlSPS 基因的功能，通过克隆番茄中 SlSPS 基因，构建过表达载体并在拟南芥中进行遗传转化，
SlSPS 基 因 过 表 达 载 体 pCAMBIA1300-35SSlSPS 转入农杆菌 GV3101 后，通过蘸花法转化拟
植物病原效应蛋白功能研究方法
植物病原效应蛋白功能研究方法摘要植株病原会分泌一些与植物相互作用的效应蛋白，这些蛋白在病原菌与寄主植物互作过程中起着重要作用。
结合几种细菌、真菌分泌的效应蛋白研究进展，介绍了用于病原菌效应蛋白研究的试验方法及其独特之处，包括图位克隆、异源表达分析等，提出研究一个单一效应蛋白需要多种分析方法。
关键词病原菌；效应蛋白；研究方法；作用机制植物与病原菌相互对抗的过程中，病原菌会分泌一些蛋白到寄主细胞中。
这些蛋白被称为“效应蛋白（Avr）”，能够通过多种方式抑制植物免疫反应，促使病原成功侵染植物。
植物主要通过2种防御反应来对抗病原菌的侵染[1-2]。
一种是通过表面受体（pattern recognition receptor，PRR），如CEBiP和OsCERK1[3]等，识别病原微生物分子相关模式（Pathogen-or microbe associated molecular patterns，PAMPs），激活植物内在免疫系统进行防御，被称为依赖于病原菌识别的免疫激活途径（PAMP-triggered immunity，PTI）；另一种是通过抗性蛋白（R 蛋白）识别病原菌分泌的效应蛋白，激活植物免疫系统，被称为效应蛋白介导的激活免疫途径（Effector-triggered immunity，ETI）[4]。
随着植物病原效应蛋白基因组测序的完成，采取一定的策略分离、克隆相关Avr基因，对于Avr基因的功能及与寄主植物间的互作机制研究具有重要意义。
现结合几种细菌、真菌效应蛋白研究的最新进展，综述了病原功能效应蛋白研究策略，提出研究单一效应蛋白需要多种分析方法。
1 图位克隆策略分离效应蛋白植物病原效应蛋白基因间的同源性较低，其表达蛋白的结构功能及生化性质尚不清楚，因此，目前克隆效应蛋白基因的主要策略是图位克隆法[5]。
图位克隆（Map-based cloning）又称定位克隆（positional cloning），是一种建立在分子标记图谱基础上的基因分离和克隆技术。
米曲霉AAP新基因的异源表达及其酶学性质研究
米曲霉AAP新基因的异源表达及其酶学性质研究宋婷婷;吴珍珍;宗红;陆信曜;诸葛斌【摘要】通过生物信息学分析发现了米曲霉(Aspergillus oryzae)中属于氨肽酶M18家族的新成员天冬酰胺氨肽酶(AAP)基因,经反转录克隆获得该基因,实现了其在毕赤酵母GS115中的表达,同时研究了重组AAP的酶学性质及其在大豆蛋白水解中的应用.结果表明,重组AAP的分子质量约54.0 kDa,在较广的pH范围内有活性(pH 6.0 ～9.5),最适反应温度和pH分别为50℃和7.0,Zn2+和Ca2+对该酶起促进作用,EDTA能够显著抑制该酶的酶活.以Asp-pNA为底物时,Km为0.42 mmol/L,Vmax为21.57 μmol/(mL·min),该酶具有水解Nv末端为天冬氨酸和谷氨酸的底物特异性.重组AAP可显著降低大豆多肽的苦味,提高水解度,具有在食品中的应用潜力.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2019(045)005【总页数】7页(P38-44)【关键词】米曲霉;天冬酰胺氨肽酶;酶学性质【作者】宋婷婷;吴珍珍;宗红;陆信曜;诸葛斌【作者单位】糖化学与生物技术教育部重点实验室(江南大学),江苏无锡,214122;工业生物技术教育部重点实验室(江南大学),江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,工业微生物研究中心,江苏无锡,214122;糖化学与生物技术教育部重点实验室(江南大学),江苏无锡,214122;工业生物技术教育部重点实验室(江南大学),江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,工业微生物研究中心,江苏无锡,214122;糖化学与生物技术教育部重点实验室(江南大学),江苏无锡,214122;工业生物技术教育部重点实验室(江南大学),江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,工业微生物研究中心,江苏无锡,214122;糖化学与生物技术教育部重点实验室(江南大学),江苏无锡,214122;工业生物技术教育部重点实验室(江南大学),江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,工业微生物研究中心,江苏无锡,214122;糖化学与生物技术教育部重点实验室(江南大学),江苏无锡,214122;工业生物技术教育部重点实验室(江南大学),江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,工业微生物研究中心,江苏无锡,214122【正文语种】中文米曲霉(Aspergillus oryzae)具有强大的蛋白分泌能力和公认的食品安全性，是传统豆酱、酱油等酿造工业的重要菌株[1]，其分泌的蛋白酶能够将蛋白质水解成多肽及氨基酸，增强酿造食品的味道和风味[2-3]。
异源基因表达系统
大肠杆菌表达载体类型及其进展
大肠杆菌表达载体的类型：
1.
非融合表达载体
2.
融合表达载体
3.
分泌表达载体
4.ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
带纯化标签的表达载体
5.
带伴侣蛋白的表达载体
6.
表面呈现表达载体
（1） 非融合表达载体
其优越性在于，表达的非融合蛋白与天然状态下 存在的蛋白质结构、功能以及免疫原性等方面基本一 致，从而可以进行后续研究，而某些医药方面的产品 则可以推向临床。
异源基因表达系统
杨力媛 班级：生工所
背景
1980年异源基因表达技术逐渐成为一门 科学，相关技术的突破性进展以惊人的速 度不断出现。
在初期，大多数技术上相关的基础领域 有快速的发展，然后慢慢变为平稳，但成 果仍然显著。在接着的发展进程中不时会 有小的突破。
表达载体的基本要求
• 表达系统的核心是表达载体。一般说来，大肠杆 菌表达载体应满足以下要求 ： 1表达量高； 2适用范围广； 3表达产物容易纯化； 4稳拦性好。 迄今为止，还投有一个表达载体能完全满足上述 要求，因此，近年来出现了一些新型载体，可满 足不同目的的需要。
原核生物中表达真核基因产物
•大肠杆菌仍然是异源基因产物表达的热门宿主。 尽管有多年的大量实验室经验，当在原核生物中
表达真核基因产物时，与产物质量相关的争论依然存 在。 •大肠杆菌的密码子偏爱性与哺乳动物系统有很大不同， 当在这种细菌中尝试表达哺乳动物基因产物时会出现 问题。
密码子的遗传背景
基因表达中的主要影响因素现在已经非常清楚。 稀有密码子聚类能够导致核糖体的暂停和移码，
•虽然该方法改进了生产哺乳动物基因产物的能力，但并不是 万能的。产物溶解性和二硫桥正确的排列仍然是使用大肠杆菌 进行异种基因表达最大的障碍。
链霉菌次级代谢产物生物合成基因簇异源表达研究进展
链霉菌次级代谢产物生物合成基因簇异源表达研究进展王苗;王倩【期刊名称】《贵州医药》【年(卷),期】2018(042)007【总页数】3页(P803-805)【关键词】链霉菌;次级代谢产物;异源表达;生物合成【作者】王苗;王倩【作者单位】遵义医学院/贵州省微生物资源及药物开发特色重点实验室,贵州遵义563003;遵义医学院/贵州省微生物资源及药物开发特色重点实验室,贵州遵义563003【正文语种】中文【中图分类】R394天然活性物质的合成、调控和抗性基因都是成簇的排列在微生物基因组内，通过基因工程等技术，将目的基因转移至不同的宿主菌内异源表达，不仅能够激活沉默基因簇，且可将异源表达体系作为一个非常有用的工具，通过生物合成或组合生物合成的方法生产出更多结构新颖且功能独特的实用天然产物或其衍生物[1-2]。
本文针对近年来在链霉菌体内次级代谢产物生物合成基因簇的异源表达研究进展进行综述，着重介绍了链霉菌次级代谢产物非核糖体肽酶(NRPSs) 、聚酮合酶(PKSs)和杂合NRPS/PKSs基因簇异源表达研究的方法及研究过程中需解决的问题，进而对近些年异源表达天然产物的新研究思路进行汇总及展望，以期为新药的研发及合成药的高效表达提供良好的来源和途径。
1 微生物异源表达体系功能介绍及应用近年来，微生物来源基因簇异源表达的研究逐步成为医药、生物和化学界长期的研究内容。
随着对微生物基因簇研究的深入，特别是一些不可培养微生物基因或沉默基因的激活表达研究，技术水平上迫切需要强大的功能齐全的异源表达体系来生产这些化合物，从而获得更多结构新颖且功能独特的实用新型活性物质 [3-4]。
将整个或部分抗生素的基因簇插入与其原始产生菌不同源的适宜宿主菌内表达，使其产生该抗生素完整结构或部分结构的过程，主要策略包括：生物信息学预测、克隆基因簇、修饰基因簇、转移基因簇、功能性表达基因、比较分析代谢产物图谱等，这种研究手段称为异源表达,生产这些活性化合物即建立基因簇异源表达体系 [5]。
蛋白质异源表达的意义
蛋白质异源表达的意义基因异源表达的意义是指细胞在生命过程中，把储存在dna顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。
根据查询相关信息显示，基因异源表达指细胞分化过程中，奢侈基因按一定顺序表达，表达的基因数约占基因总数的百分之5至百分之10，某些特定奢侈基因表达的结果生成一种类型的分化细胞，另一组奢侈基因表达的结果导致出现另一类型的分化细胞，这就是基因的差别表达。
分子生物学名词随着人类基因组计划的完成，蛋白表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。
越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明，利用蛋白表达系统表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。
根据不同的表达要求，如表达量高低、目标蛋白的活性和表达产物的纯化方法，可选用适当的表达系统及相应的表达策略。
分类蛋白表达是现代工业、医疗和基础研究领域的重要组成部分，也是当前生物技术的难点和热点，重组蛋白表达的系统主要分为：原核蛋白表达系统以大肠杆菌表达系统为代表，具有遗传背景清楚、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单等优点，缺点主要是蛋白质翻译后缺乏加工机制，如二硫键的形成、蛋白糖基化和正确折叠，得到具有生物活性的蛋白的几率较小。
酵母蛋白表达系统以甲醇酵母为代表，具有表达量高，可诱导，糖基化机制接近高等真核生物，分泌蛋白易纯化，易实现高密发酵等优点。
缺点为部分蛋白产物易降解，表达量不可控。
哺乳动物细胞和昆虫细胞表达系统主要优点是蛋白翻译后加工机制最接近体内的天然形式，最容易保留生物活性，缺点是表达量通常较低，稳定细胞系建立技术难度大，生产成本高。
异源蛋白质在细菌中表达是使用的主要的蛋白生产系统。
大肠杆菌一直是最经济的系统之一。
然而为了生产需要特异修饰、胞外分泌或有特异折叠需要的蛋白质，其他表达系统也是需要的。
密码子偏爱性原核细胞表达真核基因的cDNA时，会涉及到密码子的偏爱性，真核细胞在表达原核来源的基因、真核基因的cDNA拷贝或其他无内含子的基因时可能表现很多特异问题。
第四章 基因的鉴定与表达分析
灵敏度，可以检测到一些稀有转录子。
CpG岛法
CpG岛(CpG island)是基因组DNA序列中富含C、G的 DNA区域。在大规模的DNA测序中，每发现一个CG岛，意 味着在此区域有一个基因。利用CpG岛稀有酶如SacⅡ、
BssHⅢ、EagⅠ、HpaⅡ、NotⅠ识别其位点，切割基因组
DNA。CpG岛又称HIF岛，即用HpaⅡ酶将CpG岛周围的DNA 切成许多小片段，这些序列称为HIF序列。 原理： 2) 载体上要有功能强大的真核基因启动子，以获得高 效表达； 3）还要有原核生物的复制子与生长选择标记（如Amp)，
能在大肠杆菌中扩增，又要有真核生物的复制子、启动
子、加尾信号等以便在真核细胞中扩增及转录。
cDNA选择方法
基因组图谱绘制和基因定位克隆的常见问题 是大片段基因组编码DNA的鉴定。为解决此问题，
IEF)和十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)，把复杂的蛋白质混合物中的蛋白在二维平面上分 离展开。
基因差异表达法
---二维电泳（two-dimensional electrophoresis）技术
步骤： 样品制备→等电聚焦→平衡转移→ SDS— PAGE→斑点染色→图像捕捉和图谱结构确定
随着人类基因组计划的完成，基因的鉴定与表 达分析已经成为功能基因组研究的一个重要内容。
基因的特异性特征：
整体上的高度进化保守；
表达RNA转录物----具有可读框(ORF)；
脊椎动物-----CpG岛
一、基因的鉴定方法
常规方法
特异方法
（thern印迹杂交； 同源序列比对； 动物基因组印迹杂交；
• 主要步骤：
制备载体→将基因组片段亚克隆至表达载体中→
基因功能鉴定 异源表达
基因功能鉴定异源表达
基因功能鉴定异源表达指的是将异源基因（即来自其他物种的基因）转移到目标生物体内，并通过实验手段鉴定该基因在目标生物体内的生物学功能。
该技术广泛应用于基因功能研究、疾病模型建立、新药研发等领域。
其中，常见的异源表达载体包括质粒、病毒、细胞外泡等，通过转染、转染病毒、注射等方式将异源基因导入目标生物体内。
之后，根据研究目的，可以通过RNA干扰、CRISPR-Cas9等技术对异源基因进行靶向编辑，进一步探究其生物学功能。
基因功能鉴定异源表达技术的发展，不仅为基础科学研究提供了强有力的工具，也为临床医学研究提供了新思路和新途径。
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基因功能鉴定和异源表达是两个不同的概念，下面我将为您介绍一下它们的含义和方法。
基因功能鉴定
基因功能鉴定是指确定基因编码的蛋白质的生物学功能的过程。
在生物学研究中，确定基因功能对于理解生物系统的运作方式和解决人类疾病具有重要意义。
目前常用的基因功能鉴定方法包括基因敲除、基因过量表达、RNA干扰等。
基因敲除是将基因从细胞中删除，通过比较敲除细胞和野生型细胞的表型差异来确定基因的功能。
基因过量表达则是将基因在细胞中过量表达，观察表型变化以确定基因的功能。
RNA 干扰则是通过沉默基因表达来评估基因功能。
这些方法可以单独或结合使用，以确定基因的生物学功能。
异源表达
异源表达是指将外源基因或DNA序列导入宿主细胞或组织中，使其在宿主中产生蛋白质或RNA的过程。
这种方法被广泛用于生物制药、基因治疗等领域中。
异源表达可以通过转染、病毒载体、质粒转化等多种方法实现。
例如，将人类某一基因的DNA序列导入大肠杆菌中，可以使其在大肠杆菌中产生人类蛋白质，从而进行蛋白质的生产和纯化。
总之，基因功能鉴定和异源表达是生物学和生物技术领域中的两个重要概念，对于研究生物学和应用生物技术都有着重要的意义。