异源表达
糖苷酶的异源表达及酶活表征
糖苷酶的异源表达及酶活表征专业：微生物学研究生：张鹏飞指导教师：王一丁摘要：目的及意义：在时代飞速发展，传统能源日益锐减且价格不断上涨、温室气体大量排放、以及全球气候变化的今天，新型可再生能源产业的兴起和发展迫在眉睫。
其中，以农、林业废弃物为主的木质纤维素成为最普遍、储量最丰富的可再生资源，它不仅可以用于畜牧养殖、制备生物燃料及食品添加剂，还应用于工业生产和医疗卫生行业。
木质纤维素的合理高效利用不仅能够缓解环境压力，还能够带动经济增长。
但是，木质纤维素自身的特性使得其很难彻底分解并充分利用。
主要原因如下：1）组成木质纤维素的纤维素、木质素和半纤维素之间紧密联系导致降解不彻底；2）纤维素降解发酵所需的酶产量过低，不能满足工业发展的大量需求；3）单一的糖苷酶降解效率较低。
因此，本研究旨在寻找多种高效糖苷酶，对其基因进行密码子优化和改造，以期产生可以大量表达且易于收集和纯化的目标蛋白，并对异源表达所获取的融合蛋白酶进行酶学性质表征。
以期达到对木质纤维素的高效利用。
材料方法：本文利用分子生物学方法构建目的蛋白的重组表达载体，采用大肠杆菌和毕赤酵母两种异源表达体系作为糖苷酶的异源表达宿主细胞，对几种不同来源的异源表达的糖苷酶进行过表达，以及运用DNS方法对酶的酶学性质进行了详细的表征（最适pH和温度、pH和热稳定性以及二价金属离子的影响）。
结果：目标蛋白在异源细胞中均成功表达。
三种纤维素酶（pJL-14、pJL-36、A10）、甘露聚糖酶（C6）和果胶酶（pJL-44）的最适反应pH值分别为：5.5、5、4、4和4，均偏弱酸性，在中性及弱碱性的环境中均比较稳定。
而最适反应温度及热稳定性存在差异：pJL-14、pJL-36的最适反应温度分别为45℃和40℃，35℃和30℃以下较为稳定；C6的最适反应温度为60℃，40℃以下比较稳定；A10的最适反应温度为80℃，60℃以下较为稳定；pJL-44最适反应温度为60℃，25℃以下稳定存在。
糖苷酶的异源表达及酶活表征
糖苷酶的异源表达及酶活表征目的及意义:在时代飞速发展,传统能源日益锐减且价格不断上涨、温室气体大量排放、以及全球气候变化的今天,新型可再生能源产业的兴起和发展迫在眉睫。
其中,以农、林业废弃物为主的木质纤维素成为最普遍、储量最丰富的可再生资源,它不仅可以用于畜牧养殖、制备生物燃料及食品添加剂,还应用于工业生产和医疗卫生行业。
木质纤维素的合理高效利用不仅能够缓解环境压力,还能够带动经济增长。
但是,木质纤维素自身的特性使得其很难彻底分解并充分利用。
主要原因如下:1)组成木质纤维素的纤维素、木质素和半纤维素之间紧密联系导致降解不彻底;2)纤维素降解发酵所需的酶产量过低,不能满足工业发展的大量需求;3)单一的糖苷酶降解效率较低。
因此,本研究旨在寻找多种高效糖苷酶,对其基因进行密码子优化和改造,以期产生可以大量表达且易于收集和纯化的目标蛋白,并对异源表达所获取的融合蛋白酶进行酶学性质表征。
以期达到对木质纤维素的高效利用。
材料方法:本文利用分子生物学方法构建目的蛋白的重组表达载体,采用大肠杆菌和毕赤酵母两种异源表达体系作为糖苷酶的异源表达宿主细胞,对几种不同来源的异源表达的糖苷酶进行过表达,以及运用DNS方法对酶的酶学性质进行了详细的表征（最适pH和温度、pH和热稳定性以及二价金属离子的影响）。
结果:目标蛋白在异源细胞中均成功表达。
三种纤维素酶（pJL-14、pJL-36、A10）、甘露聚糖酶（C6）和果胶酶（pJL-44）的最适反应pH值分别为:5.5、5、4、4和4,均偏弱酸性,在中性及弱碱性的环境中均比较稳定。
而最适反应温度及热稳定性存在差异:pJL-14、pJL-36的最适反应温度分别为45℃和40℃,35℃和30℃以下较为稳定;C6的最适反应温度为60℃,40℃以下比较稳定;A10的最适反应温度为80℃,60℃以下较为稳定;pJL-44最适反应温度为60℃,25℃以下稳定存在。
可以看出,相同来源的糖苷酶和不同来源的同工糖苷酶热稳定性和最适反应温度均不同。
融合型异源蛋白的表达
化学断裂法： 用于蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为溴化氰（CNBr）
它与多肽链中的甲硫氨酸残基侧链的硫醚基反应，生成溴化亚氨内 酯，后者不稳定，在水的作用下肽键断裂，形成两个多肽降解片段 其中上游肽段的甲硫氨酸残基转化为高丝氨酸残基，而下游肽段N 端的第一位氨基酸残基保持不变。这一方法的优点是回收率高（可 达到85%以上），专一性强，而且所产生的目的蛋白的N端不含甲 硫氨酸，与真核生物细胞中的成熟表达产物较为接近。然而，如果 异源蛋白分子内部含有甲硫氨酸残基，则不能用此方法
大分子量的异源蛋白来说，上述三种氨基酸残基的出现频率是相当高的
融合型异源蛋白的表达
目的蛋白的回收
酶促裂解法：多残基位点 为了克服仅切单一氨基酸残基的蛋白酶所带来的应用局限性，
可在受体蛋白编码序列与不含起始密码子的外源基因之间加装一段 编码寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接头片段，该寡肽为具有 蛋白酶活性的凝血因子Xa的识别和作用序列，其断裂位点在Arg的 C末端。纯化后的融合蛋白用Xa处理，即可获得不含上述寡肽序列 的目的蛋白。由于Xa的识别作用序列由四个氨基酸残基组成，大 多数蛋白质中出现这种寡肽序列的概率极少，因此这种方法可广泛 用于从融合蛋白中回收各种不同大小的目的蛋白产物
融合型异源蛋白的表达
目的蛋白的回收
融合蛋白中受体蛋白部分的存在可能会影响目的蛋白的空 间构象和生物活性，如果将之注入人体还会导致免疫反应，因 此在制备和生产药用目的蛋白时，将融合蛋白中的受体蛋白部 分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位点专一性断裂方 法有两种：
化学断裂法 酶促裂解法
融合型异源蛋白的表达
融合型异源蛋白的表达
融合型目的蛋白表达系统的构建
使用蛋白质表达技术进行异源蛋白质表达群的分析
使用蛋白质表达技术进行异源蛋白质表达群的分析蛋白质表达技术是一种重要的实验手段，可以用于研究和生产异源蛋白质。
异源蛋白质表达群是指一组表达相同外源基因产物的细胞或生物体群体。
通过对异源蛋白质表达群的分析，可以揭示蛋白质的结构、功能及其在生物学过程中的作用，对于药物研发和基因工程等领域具有重要意义。
一、异源蛋白质表达群的构建在进行异源蛋白质表达群的分析之前，首先需要构建目标蛋白质的表达载体。
表达载体是一种带有目标基因的DNA分子，可以使该基因在细胞内得以表达。
常用的表达载体包括质粒、病毒和细胞系等。
1. 质粒表达系统质粒表达系统通常使用大肠杆菌作为宿主细胞。
将目标基因插入含有启动子、终止子和选择性标记等功能元素的质粒中，经过转化、筛选和培养等步骤，使目标基因在大肠杆菌中表达。
2. 病毒表达系统病毒表达系统常用于哺乳动物细胞。
将目标基因插入病毒载体中，经过转染和感染等步骤，使目标基因在宿主细胞中得到高效表达。
常用的病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒和军团菌病毒等。
3. 细胞系表达系统细胞系表达系统是直接使用细胞系作为表达载体。
将目标基因通过基因操纵技术导入细胞系中，使其在细胞系中表达。
常用的细胞系包括CHO细胞和HEK293细胞等。
二、异源蛋白质表达群的分析方法异源蛋白质表达群的分析主要通过鉴定和定量目标蛋白质的表达水平、结构特征和活性等方面。
1. 蛋白质鉴定蛋白质鉴定是对异源蛋白质表达群中的目标蛋白质进行鉴定和定位。
常用的方法包括质谱法、免疫印迹和糖基化分析等。
质谱法可以通过检测蛋白质分子质量和氨基酸序列来鉴定目标蛋白质；免疫印迹可以通过特异性抗体与目标蛋白质结合来检测目标蛋白质的存在；糖基化分析可以揭示蛋白质的修饰情况及其对结构和功能的影响。
2. 表达水平定量表达水平定量是对异源蛋白质表达群中目标蛋白质的表达量进行定量分析。
常用的方法包括荧光素酶报告基因法、荧光染料标记法和放射性同位素标记法等。
荧光素酶报告基因法通过检测报告基因与目标基因的转录水平关系来估计目标蛋白质的表达水平；荧光染料标记法可以通过检测荧光信号强度来定量目标蛋白质；放射性同位素标记法可以通过检测放射性同位素的衰减来估计目标蛋白质的表达水平。
酶蛋白的异源表达的意义和作用
酶蛋白的异源表达的意义和作用
摘要：
1.茂名高新区简介
2.段晓红的个人背景
3.段晓红的工作经历
4.段晓红的教育经历
5.段晓红的成就和荣誉
正文：
茂名高新区，全名茂名高新技术产业开发区，位于广东省茂名市，是茂名市经济发展的重要载体。
其主要产业为石油化工、新型建材、电子信息等，区内企业众多，经济实力雄厚。
段晓红，女，1976 年出生，广东茂名人，大学本科学历，现任茂名高新区某企业高级工程师。
段晓红的工作经历丰富，曾在多家知名企业担任重要职务。
她的职业生涯始于1998 年，当时她在茂名一家石油化工企业担任技术员。
在此期间，她不仅积累了丰富的实践经验，还通过自学和参加培训，不断提升自己的专业技能。
2002 年，段晓红升任该企业的高级工程师，开始从事技术管理和研发工作。
段晓红的教育经历同样丰富。
她在1994 年至1998 年间，在广东某知名大学学习化学工程专业，并取得了本科学历。
在校期间，她不仅学习成绩优异，还积极参加各类学术活动和社会实践，锻炼了自己的组织协调能力和团队合作精神。
段晓红在事业上取得了一系列的成就和荣誉。
她曾多次获得企业的优秀员工和优秀工程师等荣誉，还被评为茂名高新区优秀科技人才。
她的多项科研成果也被企业和行业协会认可，并在行业内推广应用。
人羧肽酶b的异源表达,纯化及其酶活研究
人羧肽酶b的异源表达,纯化及其酶活研究全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：人羧肽酶B（carboxypeptidase B，CPB）是一种重要的胰脾酶家族成员，具有在肽链C端切除氨基酸的功能。
CPB在体内参与多种生理过程，如蛋白质降解、消化和免疫调节等。
由于其重要性，对CPB的研究已经引起了广泛关注。
CPB的异源表达、纯化和酶活研究一直是研究者面临的挑战之一。
本文将重点讨论关于人羧肽酶B的异源表达、纯化及其酶活研究的最新进展。
一、异源表达人羧肽酶B的异源表达可以利用细胞培养技术，如大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。
大肠杆菌是一种常用的表达系统，因为其生长快速、易于操作、表达量高等优点。
通常通过将CPB基因克隆到表达载体中，并转化至大肠杆菌中进行表达。
值得注意的是，CPB的表达量和纯度受到多种因素的影响，如表达宿主的选择、表达条件的优化等。
二、纯化表达获得的融合蛋白需要进行纯化才能得到纯净的CPB。
传统的CPB纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
近年来，随着蛋白质工程技术的进步，一些新的纯化方法也被应用于CPB 的纯化，如亲和抓卡技术、蛋白质组学方法等。
这些新方法在提高纯化效率、减少操作步骤和成本等方面具有明显优势。
三、酶活研究人羧肽酶B的酶活研究是对其生物活性和功能的理解的关键。
酶活性通常通过对底物的降解速率进行测定来评估。
对CPB的底物特异性、抑制剂活性等也是酶活研究中的重要内容。
通过对CPB的酶活性进行研究，可以深入了解其在生理和病理条件下的作用机制，并为相关疾病的治疗提供理论基础。
人羧肽酶B的异源表达、纯化及其酶活研究是对其功能和应用进行深入探究的重要方向。
随着技术的不断进步，相信对CPB的研究将会取得更多突破，为相关领域的发展带来新的机遇和挑战。
第二篇示例：人羧肽酶B（CPB）是一种重要的内源性蛋白酶，广泛存在于哺乳动物细胞中，扮演着调控蛋白质的降解、修复和合成等生理功能的关键角色。
井岗霉素在天蓝色链霉菌M145中的异源表达
０ ５ ｎ卜 － ｐ ８ 的 Ｔ Ｓ ． ｏ Ｌ Ｈ ． ０ｉ １ ０ Ｅ 缓冲液中， ５ 水浴中热激 ５ ｉ， 在 ０Ｃ ｎ冷却至室温后加入等体积 ２孢子预萌发培养 ｍ ×
４３ ５
Ｔａ ｓ ｍ ｒ ｓ ｔ 。发酵液经过氯仿纯化后直接用质谱进行检测 ， ｐｙｅ 质谱分析是在离子井的正离子模式下进行 ， 干燥 气流为 １ ・ ｉＩ喷雾器压力为 ５ ａ干燥气温为 ３５ｏ， ０Ｌｍｌ ， ｌ － ０ ， Ｐ ２ 多级质谱断裂分析轰击 电压在 １ ￣． Ｖ之间。 Ｃ ． １ ０ ５
基 ，７ Ｃ ３ 培养 ２ ， ．ｈ离心收集孢子 并重新悬浮于适量 的无菌水 中， 混合器 上振荡打散孢子 ， ５ 在 按照 １。１９孢子 ０： （ ０
数： 大肠杆菌数） 的比例与大肠杆菌细胞混合， 然后于 ３ 培养箱培养， 后用含 ０ ｇ ７Ｃ ２ｈ ０ ．ｍ 硫链丝菌素和 ０ ３ ５ Ｉ 萘啶酮酸的 １ Ｌ ｎ ｇ 无菌水覆盖 ， ３ 培养数天后即可看到接合转移子。 ｍ 置 ０Ｃ 从长出的转移子中提取质粒 ， 转化
的新鲜培 养 的水稻 纹枯 病菌 的 Ｐ Ａ茵块 ， Ｄ 置于 ３ ０℃培养 ， 空 白对 照 的茵 丝体 生长 接近 培 养皿边 缘 时 中 待 止 培养 ， 观察 测试 菌株 平板 中指示 茵 的生 长情况 。
维普资讯 http://www.cqviLeabharlann
第 ５期
‘ 蹇 晓红 ， ： 等 井岗霉素在天蓝色链霉菌 Ｍ１５中的异源表达 ４
维普资讯
维普资讯
４２ ５
上 海 交 通 大 学 学报 （ 业 科 学 版） 农
整合型异源蛋白的表达
转位因子是指生物细胞内天然存在的一类无复制能力的DNA可 移动因子，不同生物种群拥有结构不同的转位因子，例如：
噬菌体 原核细菌 真核细菌 高等植物 高等动物
G片段（G-Fragment） 插入顺序（IS） 转座子（Tn、Ty） 可移动因子（Ac、Ds） 跳跃基因（mobil gene）
整合型异源蛋白的表达
DNA体内重组的基本原理
转位因子依赖型的体内重组：转位因子的结构
ACCATGGTT
TTGGTACCA
IS（1 kb） Ty（5 kb）
IR 抗药性基因 IR
IR
转位酶基因 IR
IS
Tn（2 - 20 kb）
识别位点 阻遏基因 IS
整合型异源蛋白的表达
DNA体内重组的基本原理
转位因子依赖型的体内重组：整合形式
整合型异源蛋白的表达
以整合形式表达目的蛋白的优缺点
目的基因稳定表达 整合型的目的基因随受体细胞染色体DNA的复制而复制，在大 多数情况下相当稳定，工程菌在没有选择压力存在下可以连续 培养而不丢失目的基因表达盒，这对以改良物种遗传性状为目 的的基因工程案例特别有意义 目的基因表达率低 单拷贝整合的目的基因表达率受到限制，此时可通过强化表达 元件而加以补偿
整合型异源蛋白的表达
DNA体内重组的基本原理
在生物体细胞尤其是原核细菌细胞内，广泛存在着DNA 的遗传重组机制，其可能的生物学功效是促进生物种群的进 化。细胞内的遗传重组可分为两大类：
转位因子依赖型 同源序列依赖型
整合型异源蛋白的表达
DNA体内重组的基本原理
转位因子依赖型的体内重组：转位因子家族
同源重组有整合和交换两种形式，前者只需要一个断裂位点， 而后者涉及两个断裂位点
碳酸酐酶异源表达及在微藻中co2固定作用机制的研究
碳酸酐酶异源表达及在微藻中co2固定作用机制的研究
碳酸酐酶是一种重要的酶，主要参与细胞的光合作用。
在微藻的碳循环过程中，它可以解
偶联碳酸二氢酯和氧化碳。
在近年来，随着生物技术的发展，碳酸酐酶异源表达在生物技
术中发挥着重要的作用。
首先，碳酸酐酶在细胞光合作用中起着关键作用。
碳酸酐酶可以将脱氢的碳酸二氢酯和氧
化碳分解成两个简单的细胞代谢物──3-羟基色氨酸和羧酸。
细胞中的二氧化碳主要来自
呼吸而来，碳酸酐酶可以将碳氧化以及提供生物再生能力，促进了细胞的光合作用，可以
为细胞提供可燃物和能量。
其次，碳酸酐酶异源表达在微藻CO2固定方面也发挥着重要作用。
细藻是一种重要的CO2
吸收者，具有细胞内呼吸和光合作用的隐藏能量，可以为碳固定过程提供高水平的效率。
针对碳酸酐酶的异源表达，许多研究表明在微藻碳酸酐酶多基因异源表达系统中，可以实
现有效的碳固定作用。
此外，在特定背景基因水平上表达某些碳酸酐酶基因，其碳固定作
用可以提高，这也是近期研究的热点。
最后，在碳酸酐酶异源表达的研究中，一些新的策略也在开发当中。
比如，利用不同于现
有碳酸酐酶异源表达的转录调控因子来调控碳固定作用；或者改变表达的目的基因的结构，使微藻更容易摄取和利用碳源；另外，也可利用遗传变异等方法来提高碳固定作用，而这
些也是需要进一步探讨的研究方向。
总之，碳酸酐酶在细胞光合作用和微藻CO2固定方面发挥着重要的作用，碳酸酐酶异源表
达的研究也在不断发展。
随着研究的深入，我们有望将碳酸酐酶的异源表达技术应用到微
藻CO2固定方面，从而促进微藻的发展。
异源表达
异源表达确实是个很困难的课题，不同的体系、菌种、载体，不同的组合，确实不知道会有哪种适合目的基因另外重组工程菌的稳定性也是个难题，不过有不同的难度：1。
以质粒的形式存在于菌体里，以质粒表达这种一般保存还是容易的，多数情况下用抗生素压着就问题不大，而且直接用质粒保存，用时现转也能顺利表达的情况也有的是2。
重组在宿主基因组中，与宿主蛋白一起表达这就保存起来比较困难了，毕竟不是原装货，很有可能穿几代以后就被踢出来了，有时即使没有踢出来也不表达了(我就遇到过，鉴定基因还在，就是不表达了)，很有可能插入的位点在宿主基因组的非活跃区域，过几代就基因沉默了。
一般个人认为可以一试的方法包括(1)用抗生素传代、保菌后抗生素复苏等等(2)得到工程菌后第一代就保10管，取一管传一代再保10管，再取一管做使用菌株，也就是保存最原始的菌种(3)筛选时多筛点，几十个菌株同时传代，5代以后(其实最好10-30代，可惜一般没那个精力)还能保留表达能力的算相对比较稳定了异源蛋白的表达是个很复杂的问题，有许许多多的影响因素，而且由于蛋白本身千差万别，很难有一个很完善或很标准的流程方法。
另外，表达的宿主也是多种多样，目前比较常用的包括 E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动物细胞等，各自有着其本身的特点，优缺点各异。
但是，异源表达又是分子生物学中很重要的一个工具，园子里不少战友都在做这方面的工作，许多帖子在讨论这方面的问题。
因此想发起一个针对这方面的专题讨论，希望有助于大家的工作，当然也希望能对自己的工作有所帮助，欢迎大家讨论。
还有，由于本人只做了有关E.coli和甲醇酵母的工作，其他虽然我们研究所也有人做，但毕竟本身没做过，若有错误或不严谨的地方欢迎战友们指正。
首先在这里提出几方面问题，希望大家讨论：1. 宿主的选择。
表达宿主虽众多，但比较常用的也就 E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动物细胞等，各自代表了一种体系。
蛋白质异源表达及其稳定性的定向进化
➢ 操作手段：
（１）降低氯化镁的浓度；
（２）是添加氯化锰
（３）是降低其中某一种单核苷酸的浓度或者 用核
苷酸三磷酸盐类似物替代其中一种单核苷酸
➢ 关键：选择适当的突变频率
➢ 优点：快速、简便、操作方便
➢ 缺点：它比较费力耗时,一般适用于较小的基因片段( <
800bp） 3
4
2 error-prone PCR（易错PCR）
蛋白质异源表达及其稳定性的定向进化
0 内容
1 蛋白质的定向进化 2 定向进化的方法 3 定向进化的筛选 4 蛋白质定向进化的应用前景
1
2
2 蛋白质的定向进化方法
error-prone PCR（易错PCR） DNA shuffling (DNA改组) 体外随机引发重组
2
3
2 error-prone PCR（易错PCR）
a．用单链DNA为模板，对模板量要求少，大大降低了 亲本组分，便利筛选；
b．克服了DNA shuffling中片段重新组装前必须彻底 去除DNase I的缺点；
c．片段组装体系与片段合成体系缓冲系统可兼容，组 装前无需纯化操作；
d．随机引发DNA合成不受模板DNA长度的限制，便利了 小肽的改造。
3
9
error-prone PCR
3
5
2 DNA shuffling (DNA改组)
DNA改组 ( DNA shuffling )又称有性 PCR ，是将一群密切相关的序列 ( 小片段，这 些小片段之间有部分的碱基序列重叠，它 们通过自身引导 PCR延伸，并重新组装成 全长的基因。
3
15
3 噬菌体展示筛选技术
➢噬菌体展示技术是将各种多肽或蛋白质以融 合蛋白的形式表达并展示在噬菌体表面，利 于蛋白酶的催化或蛋白分离
分泌型异源蛋白的表达
因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上 即可构建完全分泌型的受体细胞。此时，用另一种携带大肠杆菌信号 肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，并 使用相同性质的启动子介导目的基因的转录，则可实现目的蛋白从重 组大肠杆菌中的完全分泌。
分泌型异源白的表达
以分泌形式表达目的蛋白的优缺点
分泌表达形式的缺点：
相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健 全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少 数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式 低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌 尽管有，但并不普遍
分泌型异源蛋白的表达
蛋白质的分泌机制
原核细菌周质中含有多 种分子伴侣可阻止分泌 蛋白的随机折叠，分泌 在细胞周质或培养基中 的重组蛋白很少形成分 子间的二硫键交联，因 此与包涵体相比，分泌 型重组蛋白具有较高比 例的正确构象，生物活 性的回收率增加，且对 蛋白酶不敏感
分泌型异源蛋白的表达
分泌型目的蛋白表达系统的构建
分泌型异源蛋白的表达
在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形 式：即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中；或者通过 运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。蛋白 产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件
分泌型异源蛋白的表达
以分泌形式表达目的蛋白的优缺点
分泌表达形式的优点： 目的蛋白稳定性高 重组人胰岛素原若分泌到细胞周中，其稳 稳定性大约是在细胞质中的10倍 目的蛋白易于分离 目的蛋白末端完整 相当多的真核生物成熟蛋白N端并不含有 甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，蛋白质 N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠 杆菌的信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，其N端 的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去
低温脂肪酶基因的异源表达
低温脂肪酶基因的异源表达引言低温脂肪酶是一种胞外酶，酶的产生要经过异源表达，修饰折叠，最终分泌至细胞外。
决定脂肪酶表达的因素是多方面的，如宿主、外源基因、外界环境以及它们之间的相互作用等。
低温脂肪酶的异源表达大多选择大肠杆菌做为宿主。
现已发现分子伴侣能识别并调节细胞内多肽的折叠。
如果宿主体细胞分子伴侣与外源基因表达所需要的分子伴侣不匹配，外源基因便不能正确表达。
革兰氏阳性菌所产脂肪酶首先以“前酶原”的形式表达，酶的前体区域(pre．region)为信号肽，运输酶原至细胞外，酶原在胞外经蛋白酶水解后断裂产生成熟酶。
Rosenau将革兰氏阴性菌脂肪酶的分泌机制概括为三种类型。
(1)含有ATP结合盒(ABC)的输出体(ATP-binding cassette exporter)。
这种类型适用于N端缺少代表性的信号序列，但c端包含靶信号序列的脂肪酶的分泌。
ABC输出体包括三种蛋白质，由内而外依次是ATP酶，弓型的细胞膜融合蛋白(MFP)和外膜蛋白(OMP)。
三种蛋白质组合体横跨内外细胞膜，从而在周质中形成通道直接将酶分泌到胞外。
(2)分泌子(secreton)介导的分泌。
这种类型主要由xcp基因编码的蛋白质组成，其分布于细胞内外膜，并在外膜形成孔状通道。
(3)自输送体(autotransporter)介导的分泌。
通过该途径分泌的脂肪酶尽管分泌到胞外，但仍然与细胞表面密切相连或紧紧固着在细胞表面。
脂肪酶包含两个独特的结构域，N端具有催化活性并且暴露在细胞外，c端结构与所谓的自动输送蛋白(autotransporterprotein)类似，通过形成B．折叠结构的分泌通道协助将脂肪酶N端转运出外膜。
Quyen在对脂肪酶异源表达的研究时发现，在分子伴侣的作用下，大肠杆菌中表达的P．cepacia的脂肪酶可以分泌。
但也有学者研究发现，能表达脂肪酶并不意味着能完全分泌至胞外。
有一部分菌表达的重组蛋白存在于周质中，只有少部分分泌至胞外。
异源基因表达系统
大肠杆菌表达载体类型及其进展
大肠杆菌表达载体的类型：
1.
非融合表达载体
2.
融合表达载体
3.
分泌表达载体
4.ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
带纯化标签的表达载体
5.
带伴侣蛋白的表达载体
6.
表面呈现表达载体
（1） 非融合表达载体
其优越性在于，表达的非融合蛋白与天然状态下 存在的蛋白质结构、功能以及免疫原性等方面基本一 致，从而可以进行后续研究，而某些医药方面的产品 则可以推向临床。
异源基因表达系统
杨力媛 班级：生工所
背景
1980年异源基因表达技术逐渐成为一门 科学，相关技术的突破性进展以惊人的速 度不断出现。
在初期，大多数技术上相关的基础领域 有快速的发展，然后慢慢变为平稳，但成 果仍然显著。在接着的发展进程中不时会 有小的突破。
表达载体的基本要求
• 表达系统的核心是表达载体。一般说来，大肠杆 菌表达载体应满足以下要求 ： 1表达量高； 2适用范围广； 3表达产物容易纯化； 4稳拦性好。 迄今为止，还投有一个表达载体能完全满足上述 要求，因此，近年来出现了一些新型载体，可满 足不同目的的需要。
原核生物中表达真核基因产物
•大肠杆菌仍然是异源基因产物表达的热门宿主。 尽管有多年的大量实验室经验，当在原核生物中
表达真核基因产物时，与产物质量相关的争论依然存 在。 •大肠杆菌的密码子偏爱性与哺乳动物系统有很大不同， 当在这种细菌中尝试表达哺乳动物基因产物时会出现 问题。
密码子的遗传背景
基因表达中的主要影响因素现在已经非常清楚。 稀有密码子聚类能够导致核糖体的暂停和移码，
•虽然该方法改进了生产哺乳动物基因产物的能力，但并不是 万能的。产物溶解性和二硫桥正确的排列仍然是使用大肠杆菌 进行异种基因表达最大的障碍。
植物中次级代谢产物的异源表达技术研究
植物中次级代谢产物的异源表达技术研究植物次级代谢产物是指植物生长过程中非生存必需但对植物生长发育、防御捕食者或其他生物环境有重要作用的化合物，如色素、香气、鲜艳的花色等。
这些代谢产物在生产、医药、保健、化妆品等领域都有广泛的应用，是现代产业非常重要的组成部分。
利用生物技术手段实现植物次级代谢物的异源表达，可以有效地提高其产量和纯度，实现从天然植物中难以提取或微量可回收的次级代谢物的工业化生产。
一、次级代谢物的异源表达技术种类目前常用的植物次级代谢产物异源表达技术有三种：1. 细胞培养系统中的异源表达在细胞培养系统中利用植物原生质体、植物细胞或植物细胞培养系，可实现一些次级代谢物的异源表达。
将目标基因插入表达载体中，并转化入细胞中，利用外源刺激或化学物质的刺激，从而提高目标蛋白表达量。
2. 车前草属植物的系统发育和功能基因组学分析车前草属植物中，尤以伽蓝菜（Catharanthus roseus）、千日红（Digitalis purpurea）、绣球花（Enmanthis chinensis）等植物的葉绿体和线粒体基因组较大且含有许多次级代谢物的合成和调控基因。
通过对这些植物的系统进化和功能基因组分析，可以揭示次级代谢物的分子调控机制，优化基因控制回路以提高次级代谢物的产量和稳定性。
3. 概念相近的植物中的异源表达如果目标次级代谢物的合成途径在橙科、十字花科和茄科植物中较为相似，则可以采用植物杂交繁育或基因转化等方法，在概念相近的植物中实现目标基因的异源表达。
在不同植物间进行基因互通操作，可以有效实现目标基因的自由选择和基因操作。
二、基因的转化植物次级代谢物的引入和异源表达是在目标植物中导入外源基因或修改内源基因。
现有的技术通常利用寄主菌株或可重组介质，将目标基因通过质粒、病毒或转座子等载体系统外区域导入寄主植物细胞内，目标基因然后集成到寄主植物细胞的染色体DNA中并表现出外源的表达。
其中最常见的转化技术有以下几种：1. 农杆菌介导的转化农杆菌介导的转化是利用土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）与植物组织或细胞间的相互作用作为载体，将目标基因转移至寄主植物的染色体DNA中。
蛋白质异源表达的意义
蛋白质异源表达的意义基因异源表达的意义是指细胞在生命过程中，把储存在dna顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。
根据查询相关信息显示，基因异源表达指细胞分化过程中，奢侈基因按一定顺序表达，表达的基因数约占基因总数的百分之5至百分之10，某些特定奢侈基因表达的结果生成一种类型的分化细胞，另一组奢侈基因表达的结果导致出现另一类型的分化细胞，这就是基因的差别表达。
分子生物学名词随着人类基因组计划的完成，蛋白表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。
越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明，利用蛋白表达系统表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。
根据不同的表达要求，如表达量高低、目标蛋白的活性和表达产物的纯化方法，可选用适当的表达系统及相应的表达策略。
分类蛋白表达是现代工业、医疗和基础研究领域的重要组成部分，也是当前生物技术的难点和热点，重组蛋白表达的系统主要分为：原核蛋白表达系统以大肠杆菌表达系统为代表，具有遗传背景清楚、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单等优点，缺点主要是蛋白质翻译后缺乏加工机制，如二硫键的形成、蛋白糖基化和正确折叠，得到具有生物活性的蛋白的几率较小。
酵母蛋白表达系统以甲醇酵母为代表，具有表达量高，可诱导，糖基化机制接近高等真核生物，分泌蛋白易纯化，易实现高密发酵等优点。
缺点为部分蛋白产物易降解，表达量不可控。
哺乳动物细胞和昆虫细胞表达系统主要优点是蛋白翻译后加工机制最接近体内的天然形式，最容易保留生物活性，缺点是表达量通常较低，稳定细胞系建立技术难度大，生产成本高。
异源蛋白质在细菌中表达是使用的主要的蛋白生产系统。
大肠杆菌一直是最经济的系统之一。
然而为了生产需要特异修饰、胞外分泌或有特异折叠需要的蛋白质，其他表达系统也是需要的。
密码子偏爱性原核细胞表达真核基因的cDNA时，会涉及到密码子的偏爱性，真核细胞在表达原核来源的基因、真核基因的cDNA拷贝或其他无内含子的基因时可能表现很多特异问题。
分子设计提高蛋白质异源表达量及其稳定性的研究
分子设计提高蛋白质异源表达量及其稳定性的研究分子设计提高蛋白质异源表达量及其稳定性的研究分析如下：分子的偏好性是指不同生物在翻译过程中对简并分子的使用频率存在差异，而在进化的过程中形成了一套与其相适应的常用分子。
蛋白质在翻译的过程中，是由tRNA转运氨基酸至核糖体中，mRNA中的三联体密码决定氨基酸序列（图1）。
由于分子存在简并性，因此同一种氨基酸可以由多个分子编码。
这意味着有61种可能的tRNA，而在生物体中都表达61种tRNA的可能性不高，并且每种tRNA的表达丰度也会存在差异。
那当外源基因的分子所对应的tRNA 在宿主细胞中的表达量低时，则会影响它的翻译效率。
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异源表达确实是个很困难的课题，不同的体系、菌种、载体，不同的组合，确实不知道会有哪种适合目的基因
另外重组工程菌的稳定性也是个难题，不过有不同的难度：
1。
以质粒的形式存在于菌体里，以质粒表达
这种一般保存还是容易的，多数情况下用抗生素压着就问题不大，而且直接用质粒保存，用时现转也能顺利表达的情况也有的是
2。
重组在宿主基因组中，与宿主蛋白一起表达
这就保存起来比较困难了，毕竟不是原装货，很有可能穿几代以后就被踢出来了，有时即使没有踢出来也不表达了(我就遇到过，鉴定基因还在，就是不表达了)，很有可能插入的位点在宿主基因组的非活跃区域，过几代就基因沉默了。
一般个人认为可以一试的方法包括
(1)用抗生素传代、保菌后抗生素复苏等等
(2)得到工程菌后第一代就保10管，取一管传一代再保10管，再取一管做使用菌株，也就是保存最原始的菌种
(3)筛选时多筛点，几十个菌株同时传代，5代以后(其实最好10-30代，可惜一般没那个精力)还能保留表达能力的算相对比较稳定了
异源蛋白的表达是个很复杂的问题，有许许多多的影响因素，而且由于蛋白本身千差万别，很难有一个很完善或很标准的流程方法。
另外，表达的宿主也是多种多样，目前比较常用的包括 E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动物细胞等，各自有着其本身的特点，优缺点各异。
但是，异源表达又是分子生物学中很重要的一个工具，园子里不少战友都在做这方面的工作，许多帖子在讨论这方面的问题。
因此想发起一个针对这方面的专题讨论，希望有助于大家的工作，当然也希望能对自己的工作有所帮助，欢迎大家讨论。
还有，由于本人只做了有关E.coli和甲醇酵母的工作，其他虽然我们研究所也有人做，但毕竟本身没做过，若有错误或不严谨的地方欢迎战友们指正。
首先在这里提出几方面问题，希望大家讨论：
1. 宿主的选择。
表达宿主虽众多，但比较常用的也就 E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动物细胞等，各自代表了一种体系。
E.coli 原核宿主，无翻译后修饰。
但周期短、费用低、表达量大，一直是最常用的宿主之一。
蛋白一般很好表达，量很大，但很可能由于蛋白的翻译后修饰不完善而没有活性(或形成包涵体)，尤其是表达真核蛋白时最应注意。
酵母，有了比较完备的翻译后修饰系统，尤其是糖基化。
但是个人感觉酵母表达异源蛋白时对蛋白本身的特点要求很大，有的蛋白表达量非常大，有的却几乎一点也没有，很折磨人。
昆虫细胞和动物细胞本
人没有做过，但园子里也有很详细的介绍，搜一下google也有不少，其中还有许多是画成了表格，对比各自的优缺点，网络不好，没找链接，希望有人可以不全，多谢多谢！
另外，也有很多用链霉菌表达的成功实例，不过个人感觉链霉做起来相当麻烦，周期长，转化困难，表达量也没什么优势，而且翻译后修饰虽然也有，但仍与真核差别较大。
不过链霉菌有许多次级代谢产物（一些小分子物质）可能比蛋白表达本身更有意义，我们实验室就有很多人在做这方面研究。
2. 转化子、表达子的筛选
转化子的筛选，由于许多质粒是穿梭质粒，因此大多具有E.coli中的抗性筛选标记，筛选起来是很方便的（当然，我不清楚细胞方面的筛选，一般使用病毒载体吧，希望高手们介绍一下）。
但是转化成功的并不意味着能够成功表达目的蛋白了，因此还需要“表达子”的筛选，尤其是整合入基因组的片断（E.coli一般是游离质粒表达，好像不用再筛选了，有就有，没有就没有了）。
我做的是毕赤酵母(GS115,pPIC9k)，在筛选过程中遇到了不小的问题，一般如果目的蛋白有些容易检测的特殊活性（比如抑菌活性），则筛选起来是比较容易的。
但是如果没有，由于酵母是整合入基因组表达的，就不太好说了，我用原位点杂交的方法筛选过，效果不好，但筛选量倒挺大；还有就是5ml小量发酵筛选，工作量就比较大了，而且筛了400-500个也没有。
还有就是发现不同的筛选方法获得的阳性菌株好像不是很平行，将上述筛到的菌株放大到100ml时就没有了。
请教师兄，他说有可能是不同水平发酵溶氧量差别很大，导致酵母生长状态差异，酵母又挺娇气的，差一点也不干活，比较郁闷。
不知有没有解决的方法。
不知大家有什么好的筛选方法介绍一下吧。
3. 稀有密码子
由于是异源表达，不同宿主之间其密码子的偏好性就有不少的差异，这种差异经常直接导致了异源表达的失败。
下面有几个问题，我有一些看法，希望大家能给与指导和帮助。
首先，如何确定是否是该问题导致的表达失败。
我的一位同学给了我个判断方法的建议，觉得很有道理，和大家分享讨论。
他建议我在不同水平简单检测一下表达的情况：基因水平，做个PCR之类的看看是否已成功转入（质粒或整合入宿主）；做个半定量RT-PCR看看mRNA 是否转录了；
再看看SDS-PAGE是否有蛋白表达。
如果根本转化就失败了，没有什么好说的；如果基因进去了但mRNA没有表达，可能需要考虑启动子的问题，换个强启动子或干脆换个质粒；如果mRNA 转录了可没有蛋白翻译，那就需要考虑是否是密码子偏好性或mRNA二级结
构的问题了。
然后进一步查证，需要利用软件或上网查找是否存在这样的二级结构，以及是否含有稀有密码子影响了翻译。
在这个问题上我试着查了一些网站，如http://www.kazusa.or.jp/codon/ ；http://gcua.schoedl.de/ ；http://www.genebee.msu.su/cgi-bin/nph-rna2.pl。
等等。
但是许多东西看不太懂，理解起来有困难。
希望能有软件高手详细介绍一下用法，尤其是能分析自己片断是否含有很多稀有密码子或二级结构等。
在此感谢了！
接下来就是如果确定有可能是稀有密码子问题如何解决？目前我见到的有两种方法，一是有些宿主比如大肠杆菌的Rosetta，是由BL21改造，整合了含稀有密码子tRNA的片断，使其能顺利表达的新型宿主菌，不知其他种类的宿主是否也有这种商业化的修饰菌；另外就是利用PCR等方法将片断上的稀有密码子改造（突变），换成其他编码同样氨基酸的密码子。
当然，还可能干脆就换表达体系了，这一般是大家最不希望的了。
4. 菌种的保存、退化
一般来说是加甘油20%左右，-70保存；或制成干粉保存。
但是在做甲醇酵母时发现了个问题，就是重组工程菌的退化现象比较严重，一般都是学生做得好好的，但是毕业以后下面的师弟一接手，蛋白就不表达了，或表达量非常的低。
连续好几个师兄的结果都是如此，很是奇怪。
我猜测可能是由于整合入基因组，毕竟是个外源的基因，不知整合到了染色体的什么部分，会不会过段时间就给“踢”下来，或就沉寂了？E.coli在复苏时都有抗性压着，酵母好像没有太合适的（不知pPICZ系列的那个抗生素好用不好用，但毕竟好贵
）。
我有个想法，是否也应像公司在做工程细胞时那样，挑个几十上百个，一起传代，10几代后仍然稳定表达的才说明基因整合到了合适的部位，不会再下来了？但是毕竟做研究生没那么多时间来干这个，否则万一不行毕业就困难了。
有没有其他解决方法呢？盼高手。
5. 拷贝数对表达量的影响
对于“游离”的质粒，比如E.coli的BL21表达时，质粒的拷贝数是否对表达量有所影响？当然，由于大肠表达最主要的问题经常是表达太高了形成了包涵体，所以说白了应该希望表达量更低点的可能比较多，经常尝试各种方法（低温、低浓度IPTG等等）来降低表达量。
那么BL21中的质粒是否是单拷贝的呢（没查过，不太清楚）？如果不是，能否通过降低拷贝数来降低表达量防止包涵体的形成呢？
至于酵母那种整合到基因组中的质粒，那么拷贝数是否对表达量有影响呢？通过我自己的经历，个人猜测还是有的。
在上面讨论了菌种的退化问题，1年左右，重组的酵母表达蛋白就消失了。
但是我曾
经将这些蛋白表达消失的重组菌作了PCR鉴定，发现外源的片断仍然是存在的，就是不表达了，那么是什么原因呢？我有几种猜测：一是可能整合的位置恰好是染色体的沉寂区了，过段时间以后就沉默了，不表达了；还有一种就是会不会是原来是高拷贝的重组菌在冻存以后退化了，变成低拷贝的了（也就是可能有蛋白表达但量很低了）。
当然，我后来没有作进一步的验证，比如做个杂交确证以下拷贝数到底多少，只是一种猜测。
那么，如何提高重组酵母菌的拷贝数呢？对于较早的PAO815质粒，采用的多是体外重组的方法达到高拷贝后再转化；对于pPICZ系列和pPIC9k等等则分别采用Zeocin和G418抗生素筛选的方法筛选高拷贝的质粒；园子里还讨论过一种多重转化获得高拷贝重组菌的方法也值得一试。