双向电泳文稿演示
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是其他分离方法所无与伦比的。 双向电泳 技术、计算机图像分析与大规模数据处理 技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的
三大基本支撑技术。
双向电泳 定义
双向电泳 （two-dimensional electrophoresis)是 一种平板电泳技术 ，是等电聚焦胶电泳和SDSPAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照PI分 离），然后再进行SDS-PAGE(按照分子大小）， 样品中的蛋白经过等电点和分子质量的两次分离 后，可以得到分子的等电点、分子质量和表达量 等信息。
蛋白质组学
蛋白质组学：研究一种生物或一种细胞组 织内全部蛋白质组成及其活动规律的科学。
可视为分子生物学的大规模筛选技术， 目的在于： 1.归类细胞中的蛋白质的整体分布； 2.鉴定并分析感兴趣的个别蛋白； 3. 最终阐明它们的关系与功能。
蛋白质组分析的首要要求
➢ 将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千 种混合蛋白质进行分离、检测和分析 。 ➢ 双向电泳技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂 蛋白质混合物的首选技术。对于蛋白质组学的研究来说，它 的最基本的实验手段就是利用双向凝胶电泳在整个基因组水 平上检测蛋白质表达的情况。
双向电泳文稿演示
应用对象：蛋白质混合物的分离
运动方向： 等电聚焦电泳（水平方向）-重点 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（垂直方向）
1994年Wilkin和Williams提出蛋白质组这一 概念后，蛋白质组在生物学界得到了充分 关注，而蛋白质组的开门技术— — —双向 电泳由O ’Farrell于1975年首次建立并成功 地分离约1 000个E.coli蛋白 。
Differential analysis
PMF
LCMS/MS
MS/MS
双向电泳技术应用中的关键步骤： 1、样品制备（蛋白提取）：
（1）细胞培养、处理和收集； （2）将细胞在IEF裂解缓冲液中溶解； （3）将样品离心以去除不溶的细胞碎片和DNA，提取
上清，-80℃保存。 2、蛋白质定量和上样：
（1）固相PH梯度干胶条（immobiline PH Gradient,IPG）水化、等电聚焦；
（2）IPG的平衡； （3）SDS-PAGE； (4)蛋白质检测：考马斯亮兰染色或银染色； 3、图像分析及数据处理：
将染色后凝胶放在光密度扫描仪上，扫描后的图像用 PDQUEST 2DE软件分析，选择部分匹配的蛋白质斑点进行 比较。
双向电泳的作用和地位
➢双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是一种分析从细胞 、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混 合物的有力手段， 是目前唯一能将数千种 蛋白质同时分离与展示的分离技术， 其高 分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能
由于2DE是依据蛋白质的两种不同性质，即等电 点和分子量进行分析，因此分辨率远高于其它任 何一种单一的电泳方法，是目前分析混合蛋白质 样品最有效的手段。另外，经染色得到的电泳图 ，是个二维分布的蛋白质图并且双向电泳分离的 结果是蛋白质呈现斑点状而不是条带状。
胶性 中电 加解 入质 了溶 双液
PH9源自文库PH3
化学破碎
有机溶剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿 表面活性剂：Triton、Tween
酶促破碎 自溶法、外加酶制剂法
沉淀蛋白——可溶性是关键 硫酸铵沉淀法 三氯乙酸(TCA)沉淀法 丙酮沉淀法 TCA-丙酮沉淀法 醋酸铵沉淀法
样品的溶解——是2-DE成功分离蛋白质的 最关键因素之一
样品的溶解直接关系到分离的分辨率，为使尽可能 多的蛋白质溶解，必须完全破坏分子间的相互作用，把 蛋白质复合物解聚和变性为单体形式，使其在整个分离 过程以多肽链形式存在，同时要避免对蛋白质的任何化 学修饰。
加上电 场后建 立稳定 PH梯度
蛋白质 溶液加 入，建 立电场
染色后，蛋 白质因PI值 不同，沿PH 梯度分离开
双向凝胶电泳示意图
第一向 等电聚焦
第二向
SDS－聚丙 烯酰胺凝胶 电泳
PI 逐渐降低
PI 逐 渐 降 低
等电聚焦胶放在SDS －聚丙烯酰胺凝胶上
分子 量逐 渐降 低
2DE仪器系统
恒温水浴 垂直板电泳 仪（第二向）
双向电泳经典工作流程
1、样品制备的基本步骤： ⑴破碎、⑵沉淀、⑶溶解、 ⑷去除杂质
2、等电聚焦电泳 3、两维间的平衡 4、SDS—PAGE电泳 5、染色 6、结果分析
样品处理
一般性原则：样品制备是双向电泳中最为关键的一 步，这一步处理的好坏将直接影响 2-DE 结果。 目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法 是多种多样，但都遵循几个基本的原则：
蛋白质组学技术流程
提出生物学问题
实验组和对照组样品制备
双向电泳(2DE/DIGE)
凝胶图像分析
差异蛋白点选取
蛋白酶解及质谱分析 差异蛋白点的成功鉴定
生物学问题的解释
2DE在蛋白质组学方 案中所处的位置
State 1
2DE
?
Functional analysis
State 2
Database search
1.尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的 总蛋白，减少蛋白质的损失；
2.减少对蛋白质的人为修饰； 3.破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使
蛋白质处于完全变性状态。
样品制备的基本步骤
破碎——最小限度的减少蛋白水解和其它 形式的蛋白降解原则
机械破碎 捣碎法、研磨法、匀浆法 物理破碎 温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法
电源
等电聚焦仪 （第一向）
双向电泳的优缺点
优点：根据电荷差异和分子大小分离蛋白，因此 能分离分子电荷相同但分子大小不同或者同分异 构体（分子量相同但构象不同）以及经过翻译后 修饰的蛋白（如电荷数不同的磷酸化蛋白和非磷 酸化蛋白，在双向电泳胶上出现一串水平斑点）。
缺点： 不能分离疏水性及强酸强碱性蛋白； 不能分离低丰度蛋白； 灵敏度受样品量限制及染色效果影响； 不能完全自动化，耗时较长。
溶解的目标：
1、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体 完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液
（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使 2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个 多肽的点的强度会下降）
三大基本支撑技术。
双向电泳 定义
双向电泳 （two-dimensional electrophoresis)是 一种平板电泳技术 ，是等电聚焦胶电泳和SDSPAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照PI分 离），然后再进行SDS-PAGE(按照分子大小）， 样品中的蛋白经过等电点和分子质量的两次分离 后，可以得到分子的等电点、分子质量和表达量 等信息。
蛋白质组学
蛋白质组学：研究一种生物或一种细胞组 织内全部蛋白质组成及其活动规律的科学。
可视为分子生物学的大规模筛选技术， 目的在于： 1.归类细胞中的蛋白质的整体分布； 2.鉴定并分析感兴趣的个别蛋白； 3. 最终阐明它们的关系与功能。
蛋白质组分析的首要要求
➢ 将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千 种混合蛋白质进行分离、检测和分析 。 ➢ 双向电泳技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂 蛋白质混合物的首选技术。对于蛋白质组学的研究来说，它 的最基本的实验手段就是利用双向凝胶电泳在整个基因组水 平上检测蛋白质表达的情况。
双向电泳文稿演示
应用对象：蛋白质混合物的分离
运动方向： 等电聚焦电泳（水平方向）-重点 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（垂直方向）
1994年Wilkin和Williams提出蛋白质组这一 概念后，蛋白质组在生物学界得到了充分 关注，而蛋白质组的开门技术— — —双向 电泳由O ’Farrell于1975年首次建立并成功 地分离约1 000个E.coli蛋白 。
Differential analysis
PMF
LCMS/MS
MS/MS
双向电泳技术应用中的关键步骤： 1、样品制备（蛋白提取）：
（1）细胞培养、处理和收集； （2）将细胞在IEF裂解缓冲液中溶解； （3）将样品离心以去除不溶的细胞碎片和DNA，提取
上清，-80℃保存。 2、蛋白质定量和上样：
（1）固相PH梯度干胶条（immobiline PH Gradient,IPG）水化、等电聚焦；
（2）IPG的平衡； （3）SDS-PAGE； (4)蛋白质检测：考马斯亮兰染色或银染色； 3、图像分析及数据处理：
将染色后凝胶放在光密度扫描仪上，扫描后的图像用 PDQUEST 2DE软件分析，选择部分匹配的蛋白质斑点进行 比较。
双向电泳的作用和地位
➢双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是一种分析从细胞 、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混 合物的有力手段， 是目前唯一能将数千种 蛋白质同时分离与展示的分离技术， 其高 分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能
由于2DE是依据蛋白质的两种不同性质，即等电 点和分子量进行分析，因此分辨率远高于其它任 何一种单一的电泳方法，是目前分析混合蛋白质 样品最有效的手段。另外，经染色得到的电泳图 ，是个二维分布的蛋白质图并且双向电泳分离的 结果是蛋白质呈现斑点状而不是条带状。
胶性 中电 加解 入质 了溶 双液
PH9源自文库PH3
化学破碎
有机溶剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿 表面活性剂：Triton、Tween
酶促破碎 自溶法、外加酶制剂法
沉淀蛋白——可溶性是关键 硫酸铵沉淀法 三氯乙酸(TCA)沉淀法 丙酮沉淀法 TCA-丙酮沉淀法 醋酸铵沉淀法
样品的溶解——是2-DE成功分离蛋白质的 最关键因素之一
样品的溶解直接关系到分离的分辨率，为使尽可能 多的蛋白质溶解，必须完全破坏分子间的相互作用，把 蛋白质复合物解聚和变性为单体形式，使其在整个分离 过程以多肽链形式存在，同时要避免对蛋白质的任何化 学修饰。
加上电 场后建 立稳定 PH梯度
蛋白质 溶液加 入，建 立电场
染色后，蛋 白质因PI值 不同，沿PH 梯度分离开
双向凝胶电泳示意图
第一向 等电聚焦
第二向
SDS－聚丙 烯酰胺凝胶 电泳
PI 逐渐降低
PI 逐 渐 降 低
等电聚焦胶放在SDS －聚丙烯酰胺凝胶上
分子 量逐 渐降 低
2DE仪器系统
恒温水浴 垂直板电泳 仪（第二向）
双向电泳经典工作流程
1、样品制备的基本步骤： ⑴破碎、⑵沉淀、⑶溶解、 ⑷去除杂质
2、等电聚焦电泳 3、两维间的平衡 4、SDS—PAGE电泳 5、染色 6、结果分析
样品处理
一般性原则：样品制备是双向电泳中最为关键的一 步，这一步处理的好坏将直接影响 2-DE 结果。 目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法 是多种多样，但都遵循几个基本的原则：
蛋白质组学技术流程
提出生物学问题
实验组和对照组样品制备
双向电泳(2DE/DIGE)
凝胶图像分析
差异蛋白点选取
蛋白酶解及质谱分析 差异蛋白点的成功鉴定
生物学问题的解释
2DE在蛋白质组学方 案中所处的位置
State 1
2DE
?
Functional analysis
State 2
Database search
1.尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的 总蛋白，减少蛋白质的损失；
2.减少对蛋白质的人为修饰； 3.破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使
蛋白质处于完全变性状态。
样品制备的基本步骤
破碎——最小限度的减少蛋白水解和其它 形式的蛋白降解原则
机械破碎 捣碎法、研磨法、匀浆法 物理破碎 温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法
电源
等电聚焦仪 （第一向）
双向电泳的优缺点
优点：根据电荷差异和分子大小分离蛋白，因此 能分离分子电荷相同但分子大小不同或者同分异 构体（分子量相同但构象不同）以及经过翻译后 修饰的蛋白（如电荷数不同的磷酸化蛋白和非磷 酸化蛋白，在双向电泳胶上出现一串水平斑点）。
缺点： 不能分离疏水性及强酸强碱性蛋白； 不能分离低丰度蛋白； 灵敏度受样品量限制及染色效果影响； 不能完全自动化，耗时较长。
溶解的目标：
1、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体 完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液
（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使 2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个 多肽的点的强度会下降）