山梨醇溶液(1molL)

山梨醇

山梨醇①物质名山梨醇②基本信息（中文名：山梨醇，英文名：Sorbitolum，外号D—G1ucitol、Sorbol、Diakarmon、Nivitin，清凉茶醇; 花椒醇; 山梨糖醇; 清凉花醇; 蔷薇醇; 山梨醇; 结晶山梨醇; D-山梨糖醇）分子式：C6H14O6，分子量182.17,山梨醇由法国Boussingault等从山草莓中分离而得，故名山梨醇，1958年Boye等合成成功。

化学性质：物理性质：白色无臭结晶性粉末，熔沸点95-99℃，溶于水,甘油,丙二醇,微溶于甲醇,乙醇,醋酸,苯酚和乙酰胺溶液,几乎不溶于多数其他有机溶剂，相对密度 1.489 折射率1.3477(10%水溶液)，具吸湿性。

③用途：山梨醇是一种用途广泛的化工原料，在食品、日化、医药等行业都有极为广泛的作用，可作为甜味剂、保湿剂、赋形剂、防腐剂等使用，同时具有多元醇的营养优势，即低热值、低糖、防龋齿等功效。

山梨糖醇具有吸湿性，故在食品中加入山梨糖醇可以防止食品的干裂，使食品保持新鲜柔软。

在面包蛋糕中使用，有明显效果。

山梨糖醇甜度低于蔗糖，且不被某些细菌利用，是生产地甜度糖果点心的好原料，也是生产无糖糖果的重要原料，可加工各种防龋齿的食品。

山梨糖醇不含醛基，不易被氧化，在加热时不和氨基酸产生美拉德反应。

有一定的生理活性，能防止类胡萝卜素和食用脂肪及蛋白质的变性，在浓缩牛乳中加入山梨糖醇可延长保质期，能改善小肠的色香味，对鱼肉酱有明显的稳定和长期保存的作用。

在果酱蜜饯中也有同样作用。

山梨糖醇代谢不引起血糖升高，可以作为糖尿病人食品的甜味剂和营养剂。

④化学性质山梨醇具有很大的吸湿性,在水溶液中不易结晶析出,能螯合各种金属离子。

由于分子中没有还原性基团,在通常情况下化学性质稳定,不与酸碱起作用,不易受空气氧化,也不易与可溶性氨基化合物发生美拉德褐变。

山梨醇对热稳定性较好,比相应的糖高很多,质量分数达60%以上就不易受微生物侵蚀[2]。

毕赤酵母感受态细胞制备

1.毕赤氏酵母GS115感受态细胞制备
(1)从YPD平板上挑取单菌落2~3个于含25mL YPD的250mL三角瓶中，220r/min，30o C过夜（下午5点接，到第二天9点转接）;
(2)取1mL 过夜培养物，接种含50mL 新鲜培养基（YPD）的250mL 摇瓶（接种两瓶，共100mL培养液），生长至OD600~1.3-1.5(4h左右）；
(3)将100mL培养液分装于3个50mL离心管中，4o C，5000g离心5min，用少许预冷的灭菌水悬浮细胞后并于1管中，加预冷的灭菌水至20mL；
(4)如上离心，用10mL 预冷的灭菌水悬浮细胞；
(5)如上离心，用10mL 预冷的1 mol/L山梨醇溶液悬浮细胞；
(6)如上离心，用0.5mL 预冷的1 mol/L山梨醇溶液悬浮细胞。

2.转化（电击转化）
(1)取80μL上述细胞与10μL 线性化DNA混合，转入预冷的0.2cm电转杯中；
(2)在冰上放置5min；
(3)根据所使用电转仪制造商推荐的酿酒酵母参数进行电击细胞（1.5KV，6ms）；
(4)立即加入0.9 mL 预冷的1 mol/L山梨醇溶液至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中；
(5) 5000g离心5min，剩余200μL菌液吹吸重悬细胞，涂布1块MD平板；
(6)在30o C孵育平板至菌落明显形成（大约3~4天）。

毕赤酵母手册

毕赤酵母表达实验手册作者：Jnuxz 来源：丁香园时间：2007-9-5大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。

然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。

大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。

另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。

包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。

大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。

但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。

近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。

因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。

［1］。

同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。

酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。

1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。

干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。

毕赤酵母实验操作手册

毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。

然而，许多蛋白质在翻译的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。

大肠杆菌缺少适合用于表达结构复杂的蛋白质。

另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。

包含体的形成虽然简化了产物的纯的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。

因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。

大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过其主要优点是成本低、产量高、易于操作。

但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。

近年程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵间题［1］。

与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外宿主．1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得素和胰岛素已大量生产并在人群中广泛应用，但很大部分表达由实验室扩展到工业规模时，培养基数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，而大多数外源基因的高效表达需要高拷贝数的量下降。

同时，实验室用培养基复杂而昂贵，采用工业规模能够接受的培养基时，往往导致产量的酵母的局限，人们发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源来发展最为迅速，应用也最为广泛，已利用此系统表达了一系列有重要生物学活性的蛋自质。

山梨醇含量检测试剂盒说明书可见分光光度法

山梨醇含量检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定货号：BC2520规格：50T/48S产品内容：试剂一：液体15mL×1瓶，4℃保存；试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存；标准品：粉剂10mg×1支，4℃保存。

产品说明：山梨醇广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，不仅是糖运输形式之一，而且与生物抗逆性和食物风味密切相关。

因此，在糖代谢、抗逆性和食品研究中经常需要检测山梨醇含量变化。

山梨醇在碱性溶液中与铜离子形成蓝色络合物，在655nm波长有特征吸收峰。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、山梨醇的提取：按照组织质量（g）：蒸馏水体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.2g组织，加入2mL蒸馏水），研磨成匀浆，95℃水浴10分钟（盖紧，以防止水分散失），冷却后，8000g，25℃离心10min，取上清液待测。

标准样品准备：将标准液用1ml蒸馏水溶解，溶液浓度为10mg/ml，稀释至2、1、0.5、0.25、0.125、0mg/ml。

二、测定步骤1、分光光度计预热30min以上，调节波长至655nm，蒸馏水调零。

2、加样表（在EP管中依次加入下列试剂）：试剂（μL）标准管测定管试剂一150150试剂二140140样本1000标准液1000混匀后室温静置15min，10000g，25℃离心10min，取上清液测655nm下吸光值A。

三、山梨醇含量计算：1、根据标准溶液的浓度和吸光度建立标准曲线；y为标准品浓度（mg/mL），x为吸光值。

计算样本中山梨醇的含量y值（mg/ml）。

2、按照样本质量计算山梨醇含量（mg/g鲜重）＝y×V1÷(W×V1÷V2)=2×y÷W3、按照样本蛋白浓度计算山梨醇含量（mg/mg prot）＝y×V1÷(V1×Cpr)=y÷CprV1：加入样本体积，1mL；V2：加入提取液体积，2mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。

常用试剂培养基毕赤酵母实验技术

主要培养基：10×YNB（13.4%酵母氮源，含硫酸铵不含氨基酸）：溶解13.4gYNB于100mL水中，过滤除菌，加热至YNB完全溶解，存于4℃。

500×B（0.02%生物素）：溶解20mg生物素于100mL 水中，过滤除菌，放于4℃。

100×AA（0.5%各种氨基酸）：溶解各50mg L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸于100mL 水中，过滤除菌，存于4℃。

10×D（20%葡萄糖）：溶解200g D-葡萄糖于1 000mL水中，高压灭菌15min或过滤除菌，可放1年。

500×生物素(0.02%)：溶解20mg生物素于100mL水中，过滤除菌，放于4℃，可放1年。

100×H（0.4%组氨酸）：溶解400mg L-组氨酸于100mL水中，低于50 度加热以促溶解，过滤除菌，可放1年。

10×M（5%甲醇）：混合5mL甲醇与95mL水，过滤除菌存于4℃，可放2个月。

10×GY（10%甘油）：混合100mL甘油与900mL 水，过滤或高压灭菌，室温放置，可存放1年以上。

100×AA（0.5%各种氨基酸）：溶解各50mg L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸于100mL 水中，过滤除菌，存于4℃，可放1年。

1mol/L磷酸钾缓冲液pH6.0：32mL 1mol/L K2HPO4，868mL 1mol/L KH2PO4，调整pH值为6.0±0.1（如果需调pH值，用磷酸或KOH）。

过滤或高压灭菌，室温下可放1年以上。

100mg/mL遗传霉素：用无菌水制备30mL 100mg/mL 遗传霉素贮存液，过滤除菌，存于-20℃。

用来制备含不同终浓度遗传霉素平板：0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，3.0，4.0。

LB培养基：5%酵母提取物，10%胰蛋白陈，10%NaCI，pH7.0；高压灭菌后4℃保存。

1mol 山梨醇溶液相对密度

1mol 山梨醇溶液相对密度下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

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酵母电转化

在精编分子生物学实验指南上有一部分讲到了酿酒酵母，电转化具体过程如下：1）将转化用酵母菌株的单菌落接种于5ml YPD培养基中，30度过夜培养至饱和。

2）转化前一天晚上，在装有500ml YPD培养基的2L无菌烧瓶中接种适量的过夜培养液，于30度剧烈振摇，直到细胞密度达1*10的8次方（OD600约为1.3-1.5）。

3）于4度4000g离心收获培养细胞，细胞用80ml无菌水重悬。

为了增加细胞对电击的感受性，继续步骤4。

如果不需要可接步骤64）加入10ml，pH7.5，10*TE缓冲液，摇晃均匀，再加入10ml10*乙酸锂，旋转摇匀，于30度请请摇动45min5）加入2.5ml 1 mol/L DTT,并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min6）将酵母菌悬液稀释在500ml水中，洗涤3次，每次以4000-6000g于4度离心沉淀细胞，依次重悬细胞，所用的溶液如下：第一次沉淀：250ml冰冷的水第二次沉淀：20-30ml冰冷的1mol/L山梨醇第三次沉淀：0.5ml冰冷的1mol/L山梨醇最终的OD600应为约2007）电转化：在无菌冰冷的微量离心管中加入40ul 酵母菌细胞和小于等于100ng 待转化的DNA（体积小于5ul），混匀。

转移至冰冷的电转槽中，接下来按照你的电穿孔仪的说明操作就可以啦。

8）往电击槽中加入1ml冰冷的1mol/L山梨醇，轻轻吹吸混匀9）直接涂布在山梨醇选择培养基平板上，于30度培养3-6天，直到平板上出现菌落。

步骤7-8可能会因电转仪的不同而有所不同。

其实用乙酸锂法也很方便的。

在一本酵母操作的实验手册上还看到了一个lazy-bones的转化实验方法，按照它做下来也得到了菌落。

《中国药典》2020版—山梨醇溶液国家药用辅料标准

附件：山梨醇溶液Shanlichun RongyeSorbitol Solution本品为山梨醇、少量的单糖、多糖及其他麦芽糖醇、甘露醇等的混合物，系部分水解淀粉经氢化制得。

本品含D-山梨糖醇（C6H14O6）不少于45.0%（g/g）(非结晶山梨醇溶液)；含D-山梨糖醇（C6H14O6）不少于64.0%（g/g）（结晶山梨醇溶液）。

【性状】本品为澄清、无色、糖浆状液体。

旋光度取本品约7.0g，置50ml 量瓶中，加硼砂6.4g 与水适量。

静置1h，偶尔摇动，用水稀释至刻度。

（如溶液不澄清，应滤过），依法测定（通则0621），比旋度应为+1.5°至+ 3.5°（非结晶山梨醇溶液）；旋光度应为0°至+ 1.5°（结晶山梨醇溶液）。

电导率取本品50.0ml，作为供试品溶液；另取新沸放冷的纯化水100ml 作为空白溶液。

将供试品溶液与空白溶液置25℃±1 ℃的水浴中保温1 小时后，缓缓搅拌，用电导率仪测定，以铂黑电极作为测定电极，先用空白溶液冲洗电极3 次后，测定空白溶液的电导率，其电导率值应不得过5.0µS/cm。

取出电极，再用供试品溶液冲洗电极3 次后，测定供试品溶液的电导率，经空白校正后，不得过10µS/cm。

【鉴别】（1）取本品约1.4g，加水75ml 使溶解，作为供试品溶液；取上述溶液3ml 至15cm 试管，加新制的10%邻苯二酚试液3ml，摇匀，加硫酸6ml，摇匀，加热30s，即显深粉色或酒红色。

（2）在含量测定项下记录的色谱中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。

【检查】酸度取本品1.4g，加水至10ml，依法检查（通则0631），pH 值应为5.0~7.5。

溶液的澄清度与颜色取本品7.0g，置50ml 量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，依法检查（通则0901 与通则0902），溶液应澄清无色。

还原糖取本品适量（含无水物3.3g），置锥形瓶中，加3ml 水使溶解，加碱性枸橼酸铜试液20ml，加玻璃珠或沸石数粒，加热使在4~6 分钟内沸腾，保持沸腾3 分钟。

实验总结的几种高效酿酒酵母转化方法

电转法设计方案一：感受态制备：1.挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜；2.取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养约16-18h(OD:1.3-1.5)；3.于4℃离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤一次后，细胞用10ml冰无菌水重悬，可换成较小的离心管；4.加入1ml，pH7.5，10×TE缓冲液，摇晃均匀，再加入1ml 10×LiAc，旋转摇匀，于30度轻轻摇动45min；5.再加入0.4ml 1 mol/L DTT，并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min；6.于4℃离心，弃上清（用枪吸），再用25mL冰无菌水洗涤；7. 2.5ml冰冷的1mol/L山梨醇洗涤，离心收集菌体，弃上清（用枪吸）；8.每管用100ul山梨醇溶解，分装于EP管中（80ul/管），于-70℃冰箱保存。

电转化：1．向感受态细胞中加入约5～10ug（体积小于10 ul）的DNA，用枪吹吸均匀，转移至预冷的电转杯中，静置5min；2．擦干电转杯，电击，电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆；3．立即加入1ml 预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30℃静置1h；4．离心，弃上清，加入1mL YEPD后，于30℃、200rpm培养2h；5．离心得菌体后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板进行涂板。

说明：该方法可直接采用50或100mL体系的一步法，即直接挑单菌落于YEPD中培养至预定菌浓，也可采用试管摇菌收集菌体制备感受态。

设计方案二：感受态制备：1.挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜；2.取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养约16-18h(OD:1.3-1.5)；3.于4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤后，细胞重悬于8ml处理液中（处理液配方：100 mM LiAc，10 mM DTT，0.6 M山梨醇，10 mM Tris-HCl，pH 7.5），室温静置30min；4.4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用1.5mL 1mol/L预冷的山梨醇洗涤三次，离心条件一样；5.每管用100ul山梨醇溶解（以黄枪头能吸取为宜，菌浓低时可适量少加入山梨醇），最后以80 ul的终体积转移至EP管中（菌体太多可适当放弃部分），置于-70℃冰箱保存。

毕赤酵母表达系统（学习资料）

毕赤酵母表达系统前言：所用表达质粒有pPIC3.5K,pAO815用于胞内表达，而pPIC9K用于分泌表达，所有载体均利用AOX1启动子来诱导高水平表达。

抗性选择：最有效的筛选遗传霉素抗性及高抗性克隆的程序需要先对HIS＋转化子进行选择，再进行不同水平遗传霉素抗性筛选。

毕赤菌株表型：毕赤酵母菌GS115 及KM71 在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变,因而不能合成组氨酸，所有表达质粒都有HIS4 基因可与宿主进行互补，通过不含组氨酸的培养基来选择转化子。

GS115 及KM71都可在复合培养基如YPD（YEPD）及含组氨酸的最小培养基中生长。

转化之前，GS115 及KM71 都不能在最小培养基中生长，因为它们是His-。

培养温度：毕赤酵母生长温度为28-30度（液体、平板、斜面）。

在32 度以上诱导生长时，对蛋白表达有害，甚至会导致细胞死亡。

贮存：贮存细胞几周或几月，用YPD培养基或YPD 琼脂斜面1 挑取所需菌株单克隆在YPD 平板上划线生长；2 挑取单克隆转移至YPD进行穿刺培养，30 度2 天；3 细胞在4 度可放几周几月或几年，存于－80度1 挑取所需菌株单克隆在YPD 中过夜培养；2 收集细胞，在含15%甘油的YPD 中悬浮至终OD600 为50-100（大约2.5-5.0×109细胞/ml）；3 细胞先用液氮或干冰/酒精浴中冰冻再贮存于-80 度。

注意：在4 度或－80 度长期保存后，用之前建议在MM、MD 或MGY 平板上划线培养以检测His+转化子的表型是否正确及其活力。

以质粒pPIC9K，酵母Pichia pastoris GS115为例说明做法。

载体pPIC9K酶切为点线性化质粒DNA：建议使用下列方法线性化载体以获得Mut+及Muts重组子，可能其中一个会比另一个更利于表达多拷贝重组子。

如果只想得到Muts重组子，使用KM71 菌株。

单个十字交换事件可比双重十字交换更容易、更有效地获得Muts重组菌（例如：插入A OX1或his4 而不是取代AOX1）。

山梨醇注射液说明书

山梨醇注射液说明书【药品名称】通用名: 山梨醇注射液曾用名：商品名：英文名: Sorbitol Injection汉语拼音: Shanlichun Zhusheye本品主要成分及其化学名称为:主要成分山梨醇，化学名称为D-山梨糖醇。

其结构式为:分子式: C6H14O6分子量: 182.17【性状】本品为无色的澄明液体。

【药理毒理】山梨醇单糖为甘露醇的异构体，作用与甘露醇相似但较弱，静脉注入本品浓溶液(25％)后，除小部份转化为糖外，大部以原形经肾排出，因形成血液高渗，可使周围组织及脑实质脱水而随药物从尿液排出，从而降低颅内压，消除水肿。

注射后2小时出现高效，明显地使脑水肿逐渐平复，紧张状态消失，脑脊液压下降，在体内不被代谢，经肾小球滤过后在肾小管内甚少被重吸收，起到渗透利尿作用。

(1)组织脱水作用。

提高血浆胶体渗透压，导致组织内(包括眼、脑、脑脊液等)水分进入血管内，从而减轻组织水肿，降低眼内压、颅内压和脑脊液容量及其压力。

（2）利尿作用。

利尿作用机制分两个方面。

①增加血容量，并促进前列腺素I2分泌，从而扩张肾血管，增加肾血流量包括肾髓质血流量。

肾小球入球小动脉扩张，肾小球毛细血管压升高，皮质肾小球滤过率升高。

②本药自肾小球滤过后极少（<10%)由肾小管重吸收，故可提高肾小管内液渗透浓度，减少肾小管对水及Na＋、Cl－、K＋、Ca2＋、Mg2＋和其他溶质的重吸收。

过去认为本药主要作用于近端小管，但经穿刺动物实验发现，应用大剂量山梨醇后，通过近端小管的水和Na＋仅分别增多10~20%和4~5%;而到达远端小管的水和Na＋则分别增加40%和25%。

提示亨氏袢重吸收水和Na+减少在山梨醇利尿作用中占重要地位。

此可能是由于肾髓质血流量增加，髓质内尿素和Na+流失增多，从而破坏了髓质渗透压梯度差。

由于输注山梨醇后肾小管液流量增加，当某些药物和毒物中毒时，这些物质在肾小管内浓度下降，对肾脏毒性减小，而且经肾脏排泄加快。

毕赤酵母表达实验手册

毕赤酵母表达实验手册（作参考）部分试剂中英文名称：小牛肠碱性磷酸酶（CIP）、AOX1（alcohol oxidase，醇氧化酶）10*YNB （含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基）500*B （0.02%生物素Biotin）、100*H （0.4%Histidine 组氨酸）10*D （20%Dextrose 葡萄糖）、10*M （5%Methanol 甲醇）10*GY （10%Glycerol 甘油）、100*AA （0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸）、1M 磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH6.0）Sorbitol (山梨醇)、磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer）YEPDM（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基）Minimal Glycerol Medium （最小甘油培养基）YPD培养基的配制：每（L）液体预混合物（50g/L）终浓度酵母提取物10g 250g 1%蛋白栋20g 500g 2%葡萄糖20g 500g 2%※注：配制YPD培养基时，20%（10×）葡萄糖溶液最好采用单独过滤除菌或高压灭菌（在灭菌后再加入到其他各种成分），以免在高压灭菌时培养基变黑并妨碍酵母菌的最佳生长。

※极限培养基{合成葡萄糖（SD）培养基}每（L）液体预混合物（50g/L）终浓度YNB-AA/AS 1.7g 68g 0.17% （NH4）2SO4 5g 200g 0.5%葡萄糖20g 800g 2% 注：这种极限培养基可以培养没有特殊营养要求的酵母菌，但更多时候这种培养基是作为一种待添加其他成分的极限培养基（见下文提到的CM省却成分培养基）。

完全极限（CM）省却成分培养基（每L中含）：省却成分粉剂 1.3g(见表13.1.1)YNB-AA/AS 1.7g（NH4）2SO4 5g葡萄糖20g*(另外，后3种成分可用27g极限培养预混合物代替)CM省却成分粉剂（CM dropout powder）即所谓的减少成分粉剂（minus powder）或删除成分粉剂（omission powder），它们缺少了表13.1.1中某一种营养成分但含其他营养成分。

原生质体制备和转化

收集原生质体液 4000r/min室温离心10min，收集原生质体沉淀去上清，沉淀用1mol/L 山梨醇溶液洗涤2次，每次4000r/min离心10min 弃上清将原生质体悬浮于5mL 1mol/L 山梨醇溶液中，-70℃冰箱冷冻保存备用
将制备好的原生质体溶液3200r/min，4℃离心10min；
经四层无菌镜头纸过滤，制成孢子浓度约为107个/mL的单孢子悬浮液
将上述制得的孢子悬浮液每1mL接种于一瓶盛有50mL菌丝培养基的三角瓶中，于30℃静止培养23~25h
6000r/min，离心10min收集幼嫩的菌丝体用无菌水洗涤菌丝体，4000r/min，离心5min收集菌丝体
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弃上清，沉淀重悬于预冷的STC溶液中，将原生质体浓度调整为5×106 ~ 5×107个细胞 /mL；
将约2~5µg质粒DNA(体积不超过10µL)与 100µL米曲霉原生质体置冰上轻轻混匀；
加入25µL PTC溶液，冰浴20min；
加入1 mL PTC溶液，室温放置15min；
最后加入2mL STC溶液，混匀。
文献汇报
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汇报人姓名
培养基成分高渗溶液（有机/无机）
缓冲液的pH（5.8-7.4）酶解条件（时间/各种酶的比例）
酶液用高盐还是高渗缓冲液配擦镜纸收集菌丝体or离心收集菌丝体
双层or单层培养基
高渗缓冲液：
《微生物学实验教程》周德庆（酵母）
1、接种于液体培养基上培养。
高渗缓冲液：
蔗糖0.5mol/L, MgCl2 10mmol/L,Tris-HCl(pH 7.4) 10mmol/L
2、取培养液10ml，4000r/min离心5min, 弃上清液，用TrisHCl(pH 7.4)、0.5mol/LEDTA、高渗缓冲液各洗涤一次。

毕赤酵母培养基大全

毕赤酵母表达的培养基配制2.1 LB(Luria-Bertani)培养基：Trypton l%Yeast Extract 0.5%NaCl l%PH 7.0制作平板时加入2%琼脂粉。

121℃高压灭菌20min。

可于室温保存。

用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。

2.2 LLB(Low Salt LB)培养基：Trypton l%Yeast Extract 0.5%NaCl 0.5%PH 7.0制作平板时加入2%琼脂粉。

121℃高压灭菌20min。

可于室温保存数月。

用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2周。

2.3 YPD (又称YEPD)Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基) Trypton 2%dextrose (glucose) 2%+agar 2%+Zeocin 100 μg/ml液体YPD培养基可常温保存;琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。

加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。

2.4 YPDS + Zeocin 培养基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)：yeast extract 1%peptone 2%dextrose (glucose) 2%sorbitol (山梨醇)1 M+agar 2%+ Zeocin 100 μg/ml不管是液体YPDS培养基，还是YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。

2.5 MGYMinimal Glycerol Medium (最小甘油培养基)(34%YNB;1%甘油;4*10-5%生物素)。

毕氏酵母(Pichia_pastoris)感受态细胞制备及转化 (1)

毕氏酵母（Pichia pastoris）感受态细胞制备及转化1、毕氏酵母氯化锂转化法（1）试剂1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；（2）感受态毕氏酵母的制备接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD 值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；按50ul/管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；（3）毕氏酵母的转化煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350 240ul1M LiCl 36ul2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；30℃水浴孵育30min；42℃水浴热休克20～25min;6000～8000rpm离心收集酵母菌体；重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定；2、毕氏酵母PEG1000转化法（1）试剂缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene glycol 缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存注：缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;（2）待转化毕氏酵母的制备接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d;挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0.5～0.8；室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷冻，-70℃保存（3）毕氏酵母的转化将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率；37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次；取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀；30℃水浴孵育1h；室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中；离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中；将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定；3、毕氏酵母电转化法（1）E.coli TOP10F’感受态细胞的制备取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。

山梨醇溶液(1molL,无菌)

北京雷根生物技术有限公司
山梨醇溶液(1mol/L,无菌)
简介：
山梨醇(Sorbitol)又称山梨糖醇、己六醇、D －山梨醇等，是一种不挥发多元糖醇。

CAS 号为50-70-4，分子量为182.17。

用于日化行业作为保湿剂、防冻剂等；用于食品行业作为保鲜剂、甜味剂等；用于医药行业作为维生素C 的生产原料等。

Leagene Sorbitol solution 用于染色剂的衬染剂、分离细胞核等，经高压灭菌处理。

组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、根据实验具体要求操作。

注意事项：
1、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期： 6个月有效。

相：
编号名称 CS0151 Storage Sorbitol solution(1mol/L,无菌) 100ml 4℃ 使用说明书 1份编号名称
CC0007 磷酸缓冲盐溶液(10×PBS,无钙镁)
CS0001 ACK 红细胞裂解液(ACK Lysis Buffer)
CZ0063 改良台氏液(Tyrode's solution)
DG0005 糖原PAS 染色液
NA0030 Tris-乙酸电泳缓冲液(50×TAE)
NH0043 SSC 缓冲液(20×,pH7.0)
TO1013 丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA 比色法)。

酵母电转化——精选推荐

酵母电转化(2006)1)将划线培养的毕赤醉母GS115单菌落接种于3mLYPD培养基中，280度,250r/min 摇荡培养24-48h,2)取培养物100uL转接种于20mLYPD培养基中，28℃摇荡过夜，OD600=1. 3-1. 5，4'C 1500r/min离心5min收获细胞3)细胞依次用100mL, 50mL冰预冷水和20mL冰预冷的1moI/L山梨醇洗涤，4度,1500g离心5min,最后用0. 8mL冰预冷的lmol/L山梨醇悬浮菌体，置冰浴。

4)取Sa 1 I线性化的重组载体l0ul (l0ug)与80gL毕赤酵母感受态细胞混匀，然后转移到冰预冷的0.2 cm的电转移杯中，冰上放置5mino(2)将电转移杯放在电穿孔仪上用脉冲电流电击一次，电击条件:电压1500V电容25uF，电阻200，时间5ms,温度O 'c(3)电击结束，立即加入1mL冰预冷的lmol/L山梨醉，混匀，取250uL转化物涂营养缺陷型MD培养基平皿，置28'C恒温培养2-4d，能在MD培养基上生长的菌落为His，转化子。

另一种方法:①从毕赤氏酵母GS115平板上挑取一单菌落，接种于10 mL YPD培养基中，30℃，250 r/ min,振荡培养过夜;②从上述过夜培养液中吸取1 ML，接种于200 mL YPD培养基中，30℃，250 r/min, 振荡培养至OD600为1.1-1.5;③500Xg离心培养液，沉淀细胞，用去离子水和1 m的山梨糖醇各洗两次;④加入1 ML预冷的1M的山梨糖醇重悬细胞，此即为感受态细胞;⑤把感受态细胞分装，每管100 uL，-70℃保存，备用.①将冻存于一70℃的GS115感受态细胞取出，冰浴融解;②分别将四种各10 uL线性化重组表达载体加入100 uL GS115感受态细胞中，用Tip头轻轻混匀;③将混匀的感受态细胞和重组表达载体混合物加入2 mm的电击杯底部，轻轻振荡，使混合物完全沉落于电击杯底部，冰浴5m in;④将JY2000-1B基因导入仪的电压调到1500 V，电阻调到200 ，电容调到25 uF, 电击10m s;⑤将1 mL 1 M冰浴的山梨糖醇加入电击杯，混匀，各吸出200 pL，分别涂于4个YP D+Zeocin平板上;⑥将平板置于30℃培养箱，培养2d至长出菌落。

酵母转化常用培养基及程序

酵母实验操作方案一．质粒酶切及线性化1）用维特洁日常型小量DNA纯化试剂盒抽提9KSF2，可得到较纯的质粒10μg/3ml菌液，终体积80ul。

2）线性化质粒使用80μl酶切体系9KSF2质粒70μl内切酶（SacI，SalI，BglⅡ）2μl10 x buffer 8μl3）酶切3－16小时，一般3小时即可；二．乙醇回收酶切质粒1）2倍体积无水乙醇和0.1倍体积的3M NaAC（PH 5.2），混匀，沉淀DNA；2）－200C数个小时（>2小时），13,200rpm离心10～20分钟，吸弃上清；3）300ul 70％乙醇洗一次，13,200rpm离心10分钟，吸弃上清（注意离心管位置，从含有DNA的离心管另一侧吸取）；4）37℃烘干水分和残留乙醇；5）用20μl ddH2O重溶；6）1ul样品电泳检测DNA量，计算DNA总量；三．电转化1．准备感受态细胞1）5ml YPD 接种GS115单菌落，250rpm，300C，摇菌24 hours；2）100ml YPD，接种百分之一，同时留1ml空白YPD，300C ，250rpm，7～8hours，直到OD600＝1.3～1.5；3）菌液转入500ml离心管，JA14，1500g，40C离心5 min，弃上清；4）100ml冰水重悬，同上离心，弃上清；5）80～90ml冰水重悬【50ml】，同上离心，弃上清；6）20ml冰1M sorbitol 重悬【5ml】，然后转移到50ml 离心管中，同上离心，弃上清；7）约150μl 1M sorbitol重悬【250ul】，40C备用，剩下的感受态细胞可以保存在－700C冰箱大约3周。

2．转化1)100μl GS115感受态细胞加入＋20μl 线性化质粒，用枪打匀；2)冰浴5min，加入0.2cm转化杯中，轻轻将液体震到杯底，立即冰浴；3) 电转化，参数设定：电压1500V 电容25μF电阻200欧姆，放电时间4～5ms4)立即加650μl 冰1M sorbitol 入转化杯，打匀；5) 迅速涂板，250μl/块MD板，共3块；6) 涂好的板放在300C培养箱中培养4～5天，至菌落直径1mm即可。