哺乳动物体外受精技术进展论文
试论牛卵母细胞体外受精技术
试论牛卵母细胞体外受精技术牛卵母细胞体外受精是指在脱离母体的情况下，人为创造母牛体内繁殖条件，在牛体外完成精卵结合，培育出受精卵并在体外培养至桑椹胚或是囊胚阶段，将胚胎移植到母牛体内孕育胎儿。
体外受精是繁育犊牛的重要技术，在牛繁殖领域应用普遍，涉及到的技术有牛卵母细胞的采集、成熟培养与判断，牛精子的筛选、获能，以及具体的受精操作等。
针对技术应用关键节点及技术参数、操作细节的分析研究，最终达到获取高质量胚胎的目的，助力于养牛业的高质量发展。
1 牛卵母细胞体外采集与培养技术1.1 牛卵母细胞体外采集技术1.1.1 采集方式常用的动物卵母细胞采集方式如下：（1）直接采集成熟的卵母细胞，采用超排技术从动物的输卵管采集，但不适用于牛这种大型动物；（2）活体采卵，选择繁殖性能优秀的母牛，借助腹腔镜直接采集，对采集母牛的繁殖性能影响较小；（3）从屠宰场获取，宰杀母牛后直接采集牛卵巢。
该采集方式简单、直接、成本低，可大批量采集。
1.1.2 采集技术在从屠宰场获取牛卵巢后，将其放入保温瓶中，瓶中事先装入用生理盐水稀释的硫酸庆大霉素，温度大约是30 ℃，用于保持牛卵巢的新鲜度。
在1 h 内完成卵泡的收集，在实验室环境下，使用生理盐水清洗干净牛卵巢，然后使用注射器直接吸取卵泡，获取卵泡液，准备进行体外成熟培养。
1.2 体外成熟培养使用体视显微镜筛选质量好的卵母细胞用于体外成熟培养，将筛选出的卵母细胞放入培养液中，培养液中含有17-E2 的中央记忆型T 细胞1.5 μg/mL；胎牛血清10%，促黄体生成素20%；卵泡刺激素20 μg/mL。
将培养液放入经过温度校正后的培养箱中，温度调整至38～39 ℃，气象条件为5%的CO2，培养时间22～24 h，需根据牛卵母细胞采集时的成熟情况，适当延长1～2 h，但不可超过26 h，一旦超过牛卵母细胞将进入老化期。
1.3 体外成熟判定在培养24 h 后进行牛卵母细胞的成熟检查，当其进入第二次减数分裂中期则判定为成熟。
牦牛卵母细胞体外成熟与体外受精技术研究进展
972023.8·0 引言牦牛生活在青藏高原及其邻近的地区，是世界上唯一能在平均海拔3 km 高海拔地区生存的牛种[1]。
由于能显著地适应恶劣的高原环境，并为当地牧民提供丰富的生产和生活材料，使其在高原地区具有不可替代的社会、生态和经济作用[2-4]。
与平原地区的普通牛相比，牦牛的性成熟较晚，发情率和繁殖力较低[5-6]。
与体内胚胎相比，体外成熟后的牦牛卵母细胞在体外受精后卵裂率和囊胚率较低，这一缺陷限制现代育种技术在牦牛中的推广和应用[7-8]。
牦牛卵母细胞是重要的生殖细胞，其成熟过程涉及许多基因转录的调控。
在发育过程中积累的母体mRNA 及其编码蛋白可以支持卵母细胞发育为受精卵，参与受精卵基因组的激活，并促进早期胚胎发育。
本文围绕牦牛卵母细胞来源、采集、体外成熟、体外受收稿日期：2023-05-21基金项目：国家自然科学基金（32272852）；财政部和农业农村部—现代农业（肉牛牦牛）产业技术体系建设专项（CARS-37）；中国农业科学院科技创新工程牦牛资源与育种（25-LZIHPS-01）作者简介：张犇（1997-），男，陕西宝鸡人，硕士，研究方向：动物繁殖原理与技术。
*通信作者简介：郭宪（1978-），男，甘肃庆阳人，研究员，博士生导师，研究方向：动物遗传育种、动物繁育原理与技术。
张犇，郭宪．牦牛卵母细胞体外成熟与体外受精技术研究进展[J]．现代畜牧科技，2023，99（8）：97-101． doi ：10.19369/j.cnki.2095-9737.2023.08.026． ZHANG Ben ，GUO Xian ．Advances in In Vitro Maturation and In Vitro Fertilization of Yak Oocytes[J]．Modern Animal Husbandry Science & Technology ，2023，99（8）：97-101．牦牛卵母细胞体外成熟与体外受精技术研究进展张犇，郭宪*（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，农业农村部青藏高原畜禽遗传育种重点实验室，甘肃省牦牛繁育工程重点实验室，甘肃 兰州 730050）摘要：随着生物技术和胚胎工程的不断发展，在牦牛体外受精、胚胎生物技术等方面不断探索，为牦牛资源的育种、保护、基因改良提供有利条件。
牛卵母细胞体外成熟与体外受精的研究
牛卵母细胞体外成熟与体外受精的研究牛卵母细胞体外成熟与体外受精的研究引言：牛卵母细胞体外成熟与体外受精是现代生殖技术中的重要研究方向之一。
通过研究牛卵母细胞的体外成熟及体外受精，可以加深我们对生殖过程的理解，推动畜牧业的发展，为生物医学领域提供重要的实验基础。
本文将介绍牛卵母细胞的体外成熟与体外受精的研究进展，以及相关的方法和应用。
一、牛卵母细胞的体外成熟研究卵母细胞的成熟是生殖过程中的关键步骤之一，体外成熟是指将卵母细胞从卵巢中取出培养至成熟的过程。
牛卵母细胞的体外成熟研究，旨在解决牛卵母细胞体外成熟率低、受精能力不佳等问题。
目前，研究者主要通过调节培养基及培养条件，来提高牛卵母细胞的体外成熟率。
例如，添加合适浓度的激素和营养物质，可以促进卵母细胞的成熟。
同时，控制培养温度和氧含量，以及添加适当的生长因子，也对体外成熟起到积极的作用。
此外，研究者还通过体外成熟介质的改良来提高成熟率。
体外成熟的牛卵母细胞在形态上与体内成熟的卵母细胞相似，但功能仍有所差异。
因此，研究者也关注体外成熟卵母细胞的功能性评估，以验证其受精能力。
利用体外成熟的牛卵母细胞进行人工受精实验，可以通过观察卵子的受精率和胚胎发育情况，来评估体外成熟的效果。
二、牛卵母细胞的体外受精研究牛卵母细胞的体外受精是指将成熟的卵母细胞与精子在培养皿中进行受精，从而获得胚胎。
体外受精是一项重要的生殖技术，可以用于种畜改良、胚胎移植、遗传研究等方面。
体外受精的主要难点在于受精成活率和胚胎发育能力。
针对这些问题，研究者进行了大量的实验和探索。
例如，改良培养基成分和培养条件，控制精子-卵母细胞的接触时间和培养时间，可以提高受精成活率和胚胎发育能力。
此外，通过精子质量评估和优化、胚胎质量评估和筛选等方法，也对体外受精的效果进行了有效改善。
应用：牛卵母细胞体外成熟与体外受精的研究，不仅对畜牧业具有重要的推动作用，也在生物医学领域具有广阔的应用前景。
在畜牧业上，通过体外受精可以实现良种畜禽的繁殖，提高繁殖效率，改良品种。
哺乳动物精卵融合机制及研究进展
哺乳动物精卵融合机制及研究进展郭璇06级生物技术00611057摘要哺乳动物受精是一多步骤的复杂过程，包括精子获能、精子识别卵子透明带及发生顶体反应、精卵质膜相互勃附与融合、卵母细胞第二极体的排除、两性原核的形成与融合等。
最近基因打靶研究揭示出了参与精卵结合和融合的各种分子。
精子中ADAMs 因子(是含有裂解蛋白和金属蛋白酶结构域蛋白质家族)，包括繁殖因子α、繁殖因子β以及cyritestin，经过研究已经发现它们对精卵结合有重要作用，而对精卵的融合不重要。
通过研究推测出其受体为卵母细胞整合蛋白，其对精卵交互作用是必需的。
最近，一些研究表明CD9 和卵母细胞上GPI 锚定蛋白(glycosyl phosphatidyl inostol,糖基磷脂酰肌醇)，以及精子上的附睾蛋白DE 均是精卵融合过程中的侯选因子，如果缺乏这些蛋白质分子或其作用受到干扰将导致精卵融合机制紊乱。
综述重点讨论了参与精卵相互作用的相关分子机制。
关键词精卵融合分子机理；CD9；GPI；DE；ADAMs作为受精过程的重要一步，长期以来，人们试图找到精卵融合过程中的相关分子。
到目前为止，精卵融合的详细分子机制还没有搞清楚，但是最近的研究已揭示出特定的分子与精卵融合反应有关[2]。
下面就探讨一下与精卵融合相关分子在此交互作用中所起的作用。
1 卵母细胞CD9CD9 是跨膜四超蛋白家族的一个成员，这种蛋白质家族成员有4 个跨膜区域和2 个胞外环态[1]。
第二个环比第一个环大并且有高度保守氨基酸残基[2]。
四超家族与胞膜上相关因子形成多分子复合体，这一复合体与细胞连接、运动、增殖和分化有关[3]。
CD9 对细胞运动和分化的调节可能是通过其调节信号传导功能决定的。
其中包括细胞内钙离子水平的调节、酪氨酸磷酸化以及PKC 的依赖功能。
CD9 对细胞运动、转移和生长的影响部分与CD9 调节细胞的粘附有关。
首先是从抗CD9 的实验中发现了CD9 能在受精中产生作用的。
哺乳动物人工辅助生殖技术的研究和应用
哺乳动物人工辅助生殖技术的研究和应用哺乳动物人工辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology, ART)是指通过各种技术手段帮助乳腺动物及其它生物完成人工辅助生殖，包括体外受精技术、卵子捐献、胚胎移植、代孕等。
其研究和应用近年来在人类医学和畜牧生产中日益重要。
一、体外受精技术体外受精技术(In Vitro Fertilization, IVF)是指将女性多个成熟卵子与男性精子体外受精，然后将得到的胚胎移植到女性子宫内生长发育的技术。
该技术对于女性排卵障碍、输卵管不通等原因引起的不孕不育问题有较好的治疗效果。
目前，体外受精技术已经在人类医学领域被广泛应用，呈现出技术先进、成本下降等特点。
在畜牧生产中，也有大量研究从事体外受精技术的应用。
例如，在奶牛、猪、羊等畜牧生产中，通过超声检查发现母畜的生殖周期，确定最佳受孕时间，对母畜进行人工采精和体外受精等技术，提高生殖效益。
二、卵子捐献卵子捐献是指不孕夫妻或需要协助生育的家庭通过受赠者接受另一位女性捐献的卵子，形成胚胎后进行移植治疗的方法。
该技术可用于女性因多种原因导致卵巢萎缩或功能减退的情况，为这些女性提供生育的机会。
卵子捐献技术在现代医学中应用广泛，为不孕不育症患者带来了新的希望。
同时，卵子捐献技术也受到了广泛的关注和讨论。
一些人表示担心卵子捐献的风险和道德问题，有一些地区也存在着德国或法律上规定的卵子捐赠问题。
需要进一步完善相关的道德、法律和监管制度，确保卵子捐献的安全和合理性。
三、胚胎移植胚胎移植技术是指将体外受精后形成的胚胎植入患者子宫内进行治疗的方法。
该技术可用于某些原因引起的不孕不育，如输卵管疾病、子宫内膜异位症等。
现代医学中，胚胎移植技术已经被广泛应用。
在畜牧生产中，也有广泛的研究和应用。
胚胎移植技术可用于畜牧生产中选育繁殖优良的母畜，提高畜牧生产效益。
四、代孕代孕是指女性代替另一位女性孕育并将新生儿出生后交给委托的家庭抚养。
大鼠体外受精技术研究进展
大鼠体外受精技术研究进展张春燕1, 2，刘丽均2，徐平2，芮荣1*1南京农业大学动物医学院，南京210095；2中国科学院上海实验动物中心，上海201615摘要：目前，体外受精技术在多种哺乳动物已取得成功并获得广泛应用。
大鼠由于其本身的特殊性，体外受精及随后的胚胎培养一直比较困难，国内关于大鼠体外受精方面的研究更是少有报道。
文章主要从卵母细胞体外培养、精子获能、受精、受精卵体外培养及胚胎移植等方面着手，对国外大鼠体外受精的研究现状作一简要综述。
关键词：大鼠；体外受精；胚胎培养；胚胎移植体外受精（IVF）是指在体外环境完成精卵结合的过程。
体外受精研究的深入开展，不仅加深了人们对受精机制的认识，也为动物繁育、治疗人类不孕症提供了有力的手段。
目前，该项技术在小鼠、兔、山羊、猪和牛等动物及人类已日趋成熟，并得到广泛应用；但在国内少有大鼠体外受精的报道。
现将该领域的研究现状作一综述，以供参考。
1. 大鼠体外受精研究简史事实上，大鼠是较早用于体外受精研究的实验动物之一。
早在1968年，Toyoda 和Chang 就开始了大鼠体外受精技术的研究，但只能使去除透明带的卵子和精子在体外受精[1]。
1973年，Miyamoto和Chang利用从交配雌鼠子宫内收集的精子进行体外受精时发现，子宫内收集的精子可以使透明带完整的卵子受精[2]。
从而用实验证明，以前的体外受精之所以不成功，关键是精子在体外培养时没有获能，不具备穿过透明带使卵子受精的能力。
1974年，Toyoda 等研制出适合于大鼠精子体外获能的培养液，由此逐步建立起大鼠体外受精技术[3]。
近年来，研究者在精子获能液、胚胎培养液及提高体外受精胚胎质量方面做了大量研究，目的是尽量模拟体内受精和胚胎发育环境，探索大鼠体外受精的最适条件，以提高其胚胎体外生产效率。
2. 研究方法及进展完整的体外受精技术包括：卵母细胞的体外成熟（IVM）；精子获能；体外受精；早期胚胎培养和移植。
哺乳动物体外受精研究进展及其在家畜育种中的应用_孙少华
哺乳动物体外受精研究进展及其在家畜育种中的应用孙少华 桑润滋 师守(河北农业大学,动物科技学院,071001) (中国农业大学,动物科技学院,100094) 摘 要 体外受精技术是由卵母细胞成熟、精子获能、受精、受精卵体外培养、胚胎移植等程序组成的完整系统,本文较详细地综述了该技术近年来的研究现状、进展等,并对影响该技术的主要原因、今后研究方向,以及胚胎体外生产技术在家畜育种中的应用和前景预测等进行了探讨。
关键词 体外受精 胚胎体外生产 家畜育种引言体外受精技术(In V itro F ert ilizatio n,IV F)是继人工授精、胚胎移植技术之后,家畜繁殖领域的第三次革命。
特别是近十年来,随着一系列高新生物技术的发展,如DN A图谱的构建,转基因技术、细胞核移植、胚胎干细胞的建立和克隆动物的产生,人们对生殖生物学领域的认识更加深入,推动了此项技术的快速发展。
在有些家畜,例如牛,已从实验室走向商业化生产。
该新技术的发展和成熟不仅为研究动物配子的成熟、受精机理和早期胚胎发育控制等带来方便,同时也为现代生物工程技术如细胞核移植、胚胎早期性别鉴定、基因转移等提供丰富的实验材料和基本技术保证。
此项新技术与动物选种技术相结合将会大规模生产出优秀家畜,为人类带来无比丰盛的优质动物产品。
另外,此项新技术与超低温保存技术相结合,可为珍稀动物和优良基因库的保存突破时间、地域的限制。
因此体外受精技术的研究具有广阔的发展、应用前景和重大现实意义。
本文以牛为代表就近年来家畜体外受精研究进展作一综述。
1 体外受精研究概况哺乳动物体外受精研究已有一百余年的历史。
早在1878年,澳大利亚科学家Schek就用兔进行过实验,此后O nao ff(1893年),Pincus(1930年)等科学家报导过用家兔和小鼠做过体外受精。
直到1957年,张民觉和A ustin在实验中发现受精前的试管小兔。
随着使体外受精方法的不断完善,已先后在山羊(Danzir,1959)、绵羊(T hibanlt,1961)小鼠(Whitting ha m,1968)、猫(Hamner,1970)、猪(M ey er和Smidt,1973)、牛(Br egnlla,1974)、狗(M ahi等,1976),猕猴(K ret mann等,1982)黑猩猩(G ould,1988)等许多哺乳动物体外受精相继获得成功,其中移植的获得试管后代家畜有牛(Br akett,1982)、山羊(花田京,1985)、猪(M attioli 等,1989)、绵羊(Cheng,1986)等。
浅谈哺乳动物体外受精技术的研究进展
浅谈哺乳动物体外受精技术的研究进展【摘要】哺乳动物体外受精是哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。
长期以来，国内外学者对哺乳动物体外受精技术做了大量研究，取得了突破性进展。
本文分别对哺乳动物体外受精技术的研究历史、现状及方法进行探讨，以期通过本文的阐述对该技术发展进行总结。
【关键词】哺乳动物；体外受精；卵母细胞；精子获能1.哺乳动物体外受精技术研究历史和现状哺乳动物体外受精技术的研究在世界科学史上已有100余年的历史了。
德国科学家Scnenk在1878年就开始对家兔和豚鼠进行研究实验，在实验中他对哺乳动物受精进行了大胆的研究，开始了哺乳动物体外受精的探索。
但在此期间哺乳动物的体外受精研究并没有长足的进步，该技术进入科研的新纪元是在1951年美籍华人张明觉和澳大利亚人Austin发现了哺乳动物的精子获能现象以后。
1959年，张明觉和Austin以家兔为实验材料，在受体外进行受精，接着把受精卵移植到母兔体内，最后母兔产出健康正常的兔仔，而且产出的兔仔发育正常。
张明觉进行哺乳动物体外受精研究的成功，这只兔仔成为世界上第一个试管哺乳动物。
20世纪60年代初至8O年代中期，界内科研工作者在进行了大量的基础研究后，取得了长足的进步，对今后体外受精技术的应用奠定了基础。
研究从最初的精子在同种或异种雌性生殖道内完成体内获能过程，发展到用化学成分明确的溶液培养获能。
这一系列的研究成果大大推动了体外受精技术的发展并获得成功。
20世纪80年代中期以后，以牛为代表的家畜体外受精技术迅速发展，研究从理论向实践应用发展。
此后，牛的卵母细胞体外成熟和胚胎培养体系逐步趋于成熟，胚胎体外生产效率得到很大提高。
20世纪8O年代后期，体外受精技术成为发展畜牧业的重要手段，利用此技术保留了良种家畜的遗传基因，在欧美等发达国家中得到了广泛的应用并且在效益上取得了显著的效果。
2.哺乳动物体外受精的研究方法及进展2.1卵母细胞的采集卵母细胞的来源及质量如何直接影响了体外受精的成功率，在进行卵母细胞的采集上我们通常采用3种方法，先对这三种方法进行如下介绍：（1）超数排卵直接获得成熟卵母细胞。
体外受精技术的研究进展
体外受精技术的研究进展摘要：哺乳动物体外受精技术主要包括卵母细胞的采集和体外成熟、精子获能、体外受精及早期胚胎培养。
本文阐述了动物体外受精技术的研究进展,存在问题及应用前景。
关键词：体外受精；卵母细胞；体外成熟；精子获能；体外受精；胚胎培养Abstract: The technology of the IVF on mammals mainly comprised picking up ovum and maturation culture in vitro, sperm capacitation, in vitro fertilization and early embryonic development.This article briefly reviewed the technology of the IVF and proposed the presence and prospects of mammals in vitro fertilization technology.Key words: IVF; oocyte; in vitro maturation; sperm capacitation; in vitro fertilization; early embryonic development体外受精（In Vitro Fertilization,IVF）是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术[1]。
1982年，美国学者Brackett等培养出世界第一胎体外受精牛，此后，多种动物的体外受精都在不断研究并相继取得一定的成果[2]。
近年来，研究者在不断改良培养液、培养条件等，尽量模拟体内受精和发育环境, 以提高胚胎体外生产效率。
但到目前为止，体外受精技术还存在一定的局限性，在完全体外化的条件下生产胚胎还有很多问题尚待解决。
体外受精技术的完善可以实现胚胎移植技术在生产上的广泛应用；加快良种进化；为胚胎工程技术提供研究材料和技术支持，具有广阔的发展和应用前景。
牛体外胚胎生产技术研究进展
扩大卵母 细胞 来源 、 提高 卵母细胞成熟率 和体外受精率 的同
时， 许 多学者重点研究 了如何提 高体外受精胚胎 的体 外发育
率 。其 中， 我国的卢 克焕 等在 １ ９ ８ ７—１ ９ ８ ９年间 ， 利用 绵羊输 卵管作为 中间受体 ，进行 了大量的体外受精卵发育研究 ， 并
获得高达 ６ ０ ％ 的 桑 椹 胚 一囊 胚 发 育 率 。 花 田 章 等 （ １ ９ ８ ６ — １ ９ ８ ９ ） 以兔输 卵管 为中间受体也获得 了 ４ ９ ％的囊胚发
育率 。 但 这种 中间受体培养法费用高 ， 技术过程复杂 ， 胚胎 回
收率也较低 ， 不适合 大批 量生产 牛胚胎 。在完全体外培养条
右 。２ ０世纪末期 ， 我 国牛的体外受精方面有重大 突破 ， １ ９ ８ ９ 年 以来 ， 旭 日干等 （ １ ９ ８ ９ ） 、 范必 勤 （ １ ９ ８ ９ ） 、 朱裕鼎 （ １ ９ ８ ９ ） 、 卢 克焕 等（ １ ９ ９ ０ ） 、 秦 鹏春 （ １ ９ ９ ０ ） 、 石德顺 （ １ ９ ９ ２ ） 等相继 获得 了
１ 体 外 受 精 基本 流 程
育， 再移植到 １ ９头牛受体牛子宫 角， 结果 １ ４头牛妊娠。１ ９ ８ ８
年 ， Ｇ Ｏ Ｔ Ｏ 等 和 卢 克 焕 等 分 别 获 得 牛 卵 泡 卯 母 细 胞 Ｉ ｖ Ｍ— Ｉ Ｖ Ｆ — Ｉ Ｖ Ｃ试管犊 牛。 １ ９ ８ ９年 ， Ｌ ｕ 等将 ３ ８ 枚 Ｉ ＶＭ — Ｉ Ｖ Ｆ胚 胎（ 其 中 ２枚 为 Ｉ Ｖ Ｃ胚 胎 ， ３ ６枚为 绵羊异体 发育胚 胎 ） 移植
牛体外受精步骤一是卵母细胞的采集 ， 其 中腹腔镜和超
卢扫描 活提取卵泡法 是 自活体 卵巢 内获取卵母 细胞 的常用
家畜体外受精技术的研究进展
母畜用促卵泡素和促黄体素处理后 ， 从输卵管中冲取
成 熟 卵子 并可 以与 获能 的 精子 受 精 。在 一些 大 的家 畜 中 由于超 数排 卵操作 程序 复杂 ， 成本 较高 ， 一般 很少 使用 ， 该 技 术 的关 键是 掌 握 卵子 进 入输 卯 管和 卵 子在 输 卵管 维持
１ ． １ ． １ 超数排 卯
采集 到 的 卵母 细胞 绝 大部 分 与 卵丘 细胞 形 成 卯丘 卵
母 细胞 复 合体 （ ｃ ｏ ｃ ｓ ） 。不论 用何 种 方法 ， 采 集 到的 Ｃ Ｏ Ｃ Ｓ 要 求 卵母 细 胞 形态 规则 ， 细 胞质 均 匀 ， 外 围有 多 层 卯丘 细 胞 紧密包 围 。根 据家 畜体 外受精 多年 的研 究 ， 可将 未成 熟 的 卯母 细胞 分 为 Ａ、 Ｂ、 Ｃ 、 Ｄ四个 等级 。Ａ级 卯母 细胞 要 求 有 三层 以上卵 丘细胞 紧 密包 围 ， 而且 Ａ 级 的颗 粒层 细胞 扩 张 充分 ； Ｂ 级 要 求 卵母 细 胞 质均 匀 ， 卵 丘 细胞 低 于 三层 或
１ ． １ 家畜 卵母 细胞的 采 集
确定母畜的系谱闲难 ， 并且受季节影响较大。
１ ． ２ 家畜 卵母 细胞 的选择
季 节不 同 ， 家畜 的卵 巢机 能 活动 不 同 ， 家 畜 卵母 细胞 的采集 应该 在家畜 繁殖 季节 ， 这 时 卵巢 的机能 活动 最为活 跃， 卵 巢上 卵泡 生长 发育好 ， 卯母 细胞质 量好 ， 卵母 细胞体 外 成熟 率高 ， 卵母 细胞 的采 集方 法通 常有 ｊ种 。
体 外受 精技 术 ， 但 一 直没有 获 得成 功 。直 到 １ ９ ５ １ 年， 美籍 华 人 张 明觉 和 澳 大利 亚人 Ａ ｕ ｓ ｔ ｉ ｎ 同 时发 现 了 哺乳 动 物精 子 获能 现象 ， 这一 领域 的研 究 才获得 突破性 进 展 。从 其产
哺乳动物卵母细胞体外成熟的研究进展
成熟分裂的核网期 、 Ａ Ｉ ＴＩ Ｍ Ｉ、 、 和第 ２次成熟分 们将处于这一时期的卵母细胞称为前期停滞 的卵母
裂 的 间期 而达 到 ＭⅡ。 着卵母 细胞 的发育 ， 随 生发 泡 细胞 （ｒｐａｅｂｏｋｄｏｃｔｓ， ｐｏｈｓ— ｌ ｅ ｏｙｅ） 自卵巢 表 面 卵泡 中 ｃ
增大 ， 由中央移 向质膜 ， 紧靠 脂膜 下 。核膜 打褶 而 抽 取 的卵 母 细 胞 就 处 于 这 个 时 期 （ 发 泡 期 ， Ｖ 并 生 Ｇ
达 ９ ％以上 。 ０ 然而 ， 体外成 熟 卵母 细胞 的质量 和 发育 空泡 ， 线粒 体 由小 嵴 、 圆形或 椭 圆形转 变 为带 帽线 粒 潜 能 与体 内成 熟 的卵母 细胞 相 比仍 有 较 大 差距 ， 这 体 ， 是卵母 细胞 成熟 的另一 重要 标志 。 粒体 先移 这 线
到完全 成熟 。 此后 ， 卵母 细胞 的体外 成熟培 养得 到 了 中皮质 颗粒排 列 到质膜 下 被认 为是 哺乳 动物 卵母 细 迅 速发 展 。目前 ， 卵母 细胞 的体 外成 熟技术 己被 广泛 胞成 熟 的一个 重要 标志 ｝ １ ｊ 。随着 卵母 细胞 的退 化 ， 皮 应 用 于科 学研 究 、 畜牧 生 产 和 医学 生殖 工 程 中 ， 、 质颗粒 则成 堆分 布 ， 牛 并有 许 多排到 卵周 隙 中。 电镜 在 羊 未成 熟卵母 细 胞经 体外 培养 ，排 出第 １ 体率 可 下 ， 极 线粒 体 由近核 区移 向皮 质膜 下 区 ， 一端 出现大 在
不完 全成熟 是 造成体 外 受精胚 胎 生产效 率低 的主要 断定 的 。卵 丘细 胞扩展 常 用作 判 断卵母 细 胞体 外成
原 因。
熟 的特 征 。
２ 卵母 细胞 的成 熟 过程 卵母 细胞成 熟是 指 充分生 长 卵母 细胞 向成 熟 卵
哺乳动物胚胎体外培养的研究进展
哺乳动物胚胎体外培养的研究进展丁芳(综述);周红林(审校)【摘要】Glucose has inhibitory effect on embryos development in cleavage stage ,but it is unnecessary to add glucose in early embryos development in vitro, embryos before stage of 8-cells need non-essential amino acid,embryos of and after stage of 8-cells need all amino acids.Low concentration of essential amino acids can promote the embryonic development, while high concentration of essential amino acids inhibit embryonic development.Bovine serum albumin and other macromolecules can supply nutrition to the embry-os,as well as promote cellgrowth,proliferation,differentiation,and eliminate the adverse effects of serum, which makes them very good protein substitutes.Many growth factors also have positive effects on embryonic development.Coculture and sequential culture can improve the status of embryonic development, although there are also some negative effects.%葡萄糖对卵裂阶段胚胎的发育有抑制作用，但早期胚胎体外发育中添加葡萄糖并不是完全不必要的，8-细胞前需要非必需氨基酸，8-细胞及以后利用所有氨基酸。
牛体外受精技术研究进展_黄志坚
%卵母细胞的体外成熟%)%卵母细胞的获取自卵巢获取卵母细胞的方法主要有*种。
机械分离法，系自屠宰场废弃的卵巢表面获取卵母细胞的常用方法，主要有抽吸法、切割法和剥离法。
抽吸法操作迅速，但易损伤卵丘细胞，取卵数量较少；切割法在最短时间内获卵数量较多，但易出现裸卵和损伤卵丘细胞；剥离法操作繁琐，但对卵丘细胞损伤较小。
机械分离和酶消化结合法，系自屠宰场废弃的卵巢内获取卵母细胞的常用方法，可克服机械分离时间长的特点，又减轻了酶消化过程中对细胞细微结构的破坏。
腹腔镜和超声扫描活体取卵法，系自活体卵巢内获取卵母细胞的常用方法，取卵数量多，母畜可持续利用，但操作方法复杂，且受条件限制。
哺乳动物卵巢中有腔卵泡细胞所占比例很少，绝大多数是属于腔前卵泡。
随着胚胎体外生产技术的发展，对卵母细胞需求量日益增多，如何建立腔前卵泡的培养体系，最大限度获取大量的具有成熟和受精能力的卵母细胞，将极大地促进体外受精等胚胎工程技术的应用和发展。
腔前卵泡的分离方法有：机械分离法、胶原酶消化直接分离法、酶消化振荡分离法和酶消化,机械分离法，后者以回收腔前卵泡最多，故常用于啮齿动物、猪和牛等动物的卵巢中腔前卵泡的分离。
%)#卵母细胞的体外成熟培养系统卵母细胞体外成熟培养系统的建立是按照母体要求模拟的，如依照输卵管液和子宫液成分而定，这样可为卵母细胞创造一个与母体相似的体外营养环境，以利细胞生长发育。
%)#)%基础培养体系：以合成培养液如-./%00应用最多，牛、猪等卵母细胞应用这种培养液的体外成熟率均达到1$2以上。
它的缓冲体系以34546或碳酸氢盐缓冲系789:(4;6<9(=6>为好，而磷酸盐缓冲系739?@;6>较差。
培养条件是!2.A#、0!2空气和饱和湿度，多采用微滴法7%$$!%，%$B%!个卵母细胞>培养。
在基础培养液中添加其它成分可提高卵母细胞的体外成熟率。
不同研究者目前常添加成分也不同。
在基础培养液中添加犊牛血清、发情牛血清、胎牛血清、发情山羊血清或牛血清白蛋白7C<D>等，血清中可能含某种促进卵母细胞成熟和在体外受精的成分，可阻止透明带硬化和促进受精发生。
哺乳动物卵母细胞体外成熟技术应用与研究
贵
达拉特旗 ０４０ ） １３ ０
摘要： 综述 了近 年 来 国 内外在 哺 乳动 物 卵母 细胞 采 集 方 法、 卵母 细胞 体 外成 熟培 养技 术 的研 究
进展 。 对影 响 卵母 细 胞成 熟 的 因素 以及 哺 乳动 物 卵母 细胞体 外成 熟在 家畜育 种 中的应 用进行 了 总结和 分析 。
卵 泡 腔 ， 卯 丘—— 卵母 细胞 的复 合体 （ Ｏ ｓ 冲 出 ， 将 Ｃ Ｃ） 于 实 体 显微镜 下 检 卵 ］ 。 将 切 剖后 的 卵巢 ， 除黄 体及 多 余 的脂 肪 ， 门部 去 从 纵 切卵 为半 ，然 后 置于 盛 Ｐ Ｓ １ ｇｍ Ｂ ＋ ０Ｉ ／ Ｌ肝 素 的表 面或 ｘ 者 置 于 １ ０ｍ ｌ 的培 养皿 中 ，用 镊子 固定 卵巢 ， ０ ｍｘ ５ｍｍ 然后 用 单 面刀或 一组 特 制刀 片 （ ３ ５个 单 面刀 片或 双 有 ～
用 含 有 ０３ ／ Ｌ硫 酸 庆 大霉 素 的 生 理 盐水 洗 净 ， ． ｍｇｍ ２ 然
后 进 行 采 卵 ［。 ６ ３
科 研 工作 者 在卵 母细 胞 的体 外 成 熟 上做 了大 量 的
工 作 ． 以通 过体 外培 养使 小 鼠 、 可 绵羊 、 、 、 、 、 猴 猪 牛 人 山
用 废 弃 卵巢 采集 卵母 细 胞 一 般 采 用 机械 分离 法 ， 郭 宪等 研究认 为主要 有 以下几 种 方法 ： 吸法 、 抽 切剖 法 、 剥离 法 。 １１１１ 抽 吸法 ：用 ５ｍＬ或 １ ．．． ０ｍＬ的 一 次性 注 射 器从
羊 …、 犬 、 ［、 熊 猫 等 哺 乳 动 物 的 卵母 细胞 在 体 外 马 ３大 ］ 获 得成 熟 。随着 卯母 细胞 体外 成熟 技 术 的不 断提 高 ， 体 外 成熟 的 卵母 细胞将 广泛 应用 于 体外 受精 、显 微 受精 、
哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟的研究进展
中国畜牧兽医 2024,51(3):1171-1182C h i n aA n i m a lH u s b a n dr y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟的研究进展李有为1,程亚倬2,商继勇2,张廷龙1,孙铭菊2(1.青岛农业大学海都学院,莱阳265200;2.青岛农业大学动物医学院,青岛266109)摘 要:体外成熟是哺乳动物胚胎工程获得成熟卵母细胞的主要途径,卵母细胞质量直接影响早期胚胎发育,妊娠的建立及维持,胎儿的发育等㊂哺乳动物卵巢表面数量众多的小卵泡可以作为胚胎工程卵母细胞的来源,但从哺乳动物卵巢获取的卵母细胞成熟差异较大,存在处于发育各个时期的卵母细胞,小卵泡卵母细胞体外成熟质量差,发育能力不足㊂如何提高小卵泡卵母细胞体外成熟的发育能力以充分挖掘优良母畜的遗传资源,提高胚胎工程效率成为研究热点㊂基于此,文章概述哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟的研究进展,比较大㊁小卵泡卵母细胞物质积累差异㊁卵泡的卵泡液成分及含量差异以及卵泡颗粒细胞和卵丘细胞的差异,分析哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟质量差的原因,分析总结提高哺乳动物小卵泡体外成熟卵母细胞发育能力的措施,包括抑制核成熟㊁成熟前培养㊁颗粒细胞及卵丘细胞与卵母细胞共培养,期望能够为小卵泡卵母细胞发育调控机制的研究及发育能力的提高提供理论指导㊂关键词:哺乳动物;小卵泡;卵母细胞;体外成熟中图分类号:S 814.6文献标识码:AD o i :10.16431/j .c n k i .1671-7236.2024.03.029 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2023-08-12基金项目:山东省自然科学基金项目(Z R 2020Q C 193);重庆市妇幼保健院开放课题(2020K F K T 005);青岛农业大学高层次人才科研基金(663/1120012)联系方式:李有为,E -m a i l :l i yo u w e i 008@163.c o m ㊂通信作者孙铭菊,E -m a i l :s u n 8911@163.c o m R e s e a r c hP r o gr e s s o n i n v i t r o M a t u r a t i o no f S m a l l F o l l i c l e -d e r i v e dO o c yt e s i n M a m m a l i a n L IY o u w e i 1,C H E N G Y a z h u o2,S H A N GJ i y o n g 2,Z H A N G T i n g l o n g 1,S U N M i n g ju 2(1.H a i d uC o l l e g e ,Q i n g d a oA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,L a i y a n g 265200,C h i n a ;2.C o l l e g e o fV e t e r i n a r y M e d i c i n e ,Q i n g d a oA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,Q i n g d a o 266109,C h i n a )A b s t r a c t :I nv i t r o m a t u r a t i o ni st h e m a i n w a y f o r m a m m a l i a ne m b r y oe n g i n e e r i n g too b t a i n m a t u r e o o c y t e s .T h e q u a l i t y o f o o c y t e s d i r e c t l y a f f e c t s e a r l y e m b r y o n i c d e v e l o pm e n t ,e s t a b l i s h m e n t a n dm a i n t e n a n c eo f p r e g n a n c y ,a n df e t a ld e v e l o p m e n t .T h e l a r gen u m b e ro f s m a l l f o l l i c l e so n t h e s u r f a c e o f m a m m a l i a n o v a r i e s c a n p r o v i d e o o c y t e s t h a t a p p l y t o e m b r y o e n g i n e e r i n g ,b u t t h eo o c y t e so b t a i nf r o mt h eo v a r y a r ea td i f f e r e n ts t a g e st h a ts h o w sd i f f e r e n t m a t u r e c a p a c i t y ,a n d t h e q u a l i t y o f i n v i t r o m a t u r a t i o n o f o o c yt e s f r o ms m a l l f o l l i c l e s a r e p o o r a n d d e f i c i e n t i nd e v e l o p m e n t a l a b i l i t y .H o wt o i m p r o v e t h e i n v i t r o m a t u r a t i o n a b i l i t y o f s m a l l f o l l i c l e o o c y t e s t of u l l y t a p i n t ot h e g e n e t i cr e s o u r c e so fe x c e l l e n tf e m a l ea n i m a l sa n di m pr o v et h e e f f i c i e n c y o fe m b r y o e n g i n e e r i n g h a s b e c o m e ar e s e a r c h h o t s p o t .B a s e d o n t h i s ,t h er e v i e w s u m m a r i z e s t h e r e s e a r c h p r o g r e s so f i n v i t r o m a t u r a t i o no f s m a l l f o l l i c l eo o c yt e s i n m a m m a l i a n ,c o m p a r e s t h e d i f f e r e n c e s i n a c c u m u l a t i o n o f o o c y t em a t e r i a l ,t h e d i f f e r e n c e s i n t h e c o m po s i t i o n a n d c o n t e n t o f f o l l i c u l a r f l u i d ,a n d t h e d i f f e r e n c e s b e t w e e n f o l l i c u l a r g r a n u l o s a c e l l s a n d c u m u l u s c e l l si n l a r g e a n d s m a l l f o l l i c l e s ,a n a l y z e s t h e r e a s o n s f o r t h e p o o r q u a l i t y ofm a m m a l i a ns m a l l f o l l i c l e中国畜牧兽医51卷o o c y t e s i n v i t r o m a t u r a t i o n,a n a l y z e s a n d s u m m a r i z e s t h em e a s u r e s t o i m p r o v e t h ed e v e l o p m e n t a l a b i l i t y o f m a m m a l i a ns m a l l f o l l i c l eo o c y t e s i nv i t r o m a t u r a t i o n,i n c l u d i n g i n h i b i t i o no fn u c l e a r m a t u r a t i o n,p r e-m a t u r a t i o n c u l t u r e o f o o c y t e a n d c o-c u l t u r e o f o o c y t e s w i t h g r a n u l o s a a n d c u m u l u s c e l l s,w h i c ha i m e s a t p r o v i d i n g t h e o r e t i c a l g u i d a n c e f o r t h e r e s e a r c ho f t h ed e v e l o p m e n t r e g u l a t i o nm e c h a n i s mo f s m a l l f o l l i c l e o o c y t e s a n d t h e i m p r o v e m e n t o f d e v e l o p m e n t a l c a p a c i t y. K e y w o r d s:m a m m a l s;s m a l l f o l l i c l e s;o o c y t e s;i n v i t r o m a t u r a t i o n家畜卵母细胞随着卵泡长大而生长成熟,获得发育能力,卵母细胞良好的生长成熟是决定雌性生产及繁殖能力的重要指征㊂卵母细胞体外成熟培养(I VM)是利用体外培养体系模拟体内卵母细胞成熟环境,将未成熟的卵母细胞培养至第二次减数分裂中期(MⅡ)的过程㊂卵母细胞体外成熟是研究哺乳动物卵母细胞成熟和胚胎发育的基础,是辅助生殖的关键,是保护和扩繁优良家畜的重要前提㊂进行体外成熟培养的卵母细胞取自卵巢表面卵泡,但卵巢表面大腔卵泡数量非常有限,不能满足科研和临床需求,数量众多的小卵泡作为卵母细胞来源受到更多学者关注㊂但小卵泡卵母细胞的体外成熟质量差,发育能力显著低于大卵泡卵母细胞[1-3]㊂研究者们试图探究小卵泡卵母细胞体外成熟质量差的原因及提高小卵泡卵母细胞体外成熟质量的措施,但这些问题仍未被完全阐明,也未见系统的论述㊂因此,作者系统论述哺乳动物小卵泡卵母细胞的利用现状及研究意义,从卵母细胞生长的卵泡微环境方面分析小卵泡卵母细胞体外成熟质量及发育能力差的原因,概述提高小卵泡卵母细胞体外成熟质量的措施,为改善哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟培养系统提供新思路,继而提升优良家畜繁殖利用效率,促进胚胎工程技术的发展和应用㊂1哺乳动物小卵泡卵母细胞的利用现状及研究意义哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟质量及发育能力显著低于大卵泡卵母细胞㊂研究表明,直径2.5~4.0m m的猪卵泡卵母细胞体外成熟质量及发育能力低于4.5~6.0m m卵泡卵母细胞[1];山羊卵巢上直径<3m m卵泡卵母细胞体外成熟质量及发育能力低于直径>3m m卵泡卵母细胞[2],且只有来自直径1.5m m以上山羊卵泡的卵母细胞才具有完成减数分裂的能力[4];在牛的研究中发现卵巢上直径<3m m卵泡卵母细胞体外成熟质量及发育能力低于直径>8m m卵泡卵母细胞[3,5]㊂人小卵泡(直径<10m m)卵母细胞体外成熟和发育能力显著低于大卵泡卵母细胞[6]㊂因此,哺乳动物胚胎工程利用的卵母细胞大都取自大卵泡进行体外成熟培养,如在猪上选取卵巢表面卵泡直径3~6m m的卵母细胞[7]㊂哺乳动物卵泡的生长经历原始卵泡㊁初级卵泡㊁次级卵泡㊁三级卵泡和成熟卵泡阶段,随着卵泡生长,卵母细胞生长成熟㊂胎儿期哺乳动物卵巢中存在数百万卵泡,但仅有少数卵泡能够发育成熟并排出成熟卵母细胞,其余大部分小卵泡在不同生长时期发生闭锁或退化㊂胚胎工程技术的研究和推广应用需要大量廉价和高质量的卵母细胞,卵巢表面大卵泡数量有限,因此需要高效利用数量众多的小卵泡㊂探究小卵泡卵母细胞体外成熟质量差的原因,提高小卵泡卵母细胞体外成熟的发育能力和利用率,能够充分挖掘优良母畜的繁殖潜能,为动物繁育技术的发展提供理论指导,促进畜牧业健康㊁稳定㊁持续发展;改良卵母细胞体外成熟培养体系,为相关科学研究提供大量廉价的试验材料,促进胚胎工程技术的发展;同时在指导人类辅助生殖小卵泡的利用,减少激素刺激的副作用,提高辅助生殖成功率方面有重要意义㊂2小卵泡卵母细胞体外成熟质量差的原因哺乳动物卵母细胞生长成熟依赖卵泡形成的微环境,卵泡外包卵泡膜,生长至有腔卵泡阶段,卵泡内形成卵泡腔,卵泡腔内含卵泡液,卵母细胞外包卵丘细胞位于卵泡腔中,卵丘细胞连接卵泡腔周围的颗粒细胞,卵泡内的卵泡液㊁卵丘细胞和颗粒细胞维持卵母细胞的生长成熟㊂因此,下文从卵母细胞自身生长程度㊁卵泡液成分和含量㊁卵丘及颗粒细胞功能三方面比较大小卵泡的差异,探究小卵泡卵母细胞体外成熟质量差的原因㊂2.1大、小卵泡的卵母细胞物质积累差异卵母细胞随着卵泡长大而生长,染色质逐渐凝集,转录活性逐渐减低,完成胞质物质的积累以获得成熟和发育能力,小鼠染色质凝集型卵母细胞无转录活性[8],直径>3m m猪卵泡中的卵母细胞转录27113期李有为等:哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟的研究进展逐渐沉默[9-10]㊂转录逐渐沉默过程中,卵母细胞完成转录物的积累,支持后期的成熟和胚胎发育,这是大㊁小卵泡卵母细胞体外发育能力差异的重要因素㊂高通量测序技术为卵母细胞生长成熟机制的研究提供技术支持,利用转录组测序分析不同大小卵泡的牛卵母细胞,发现在卵泡发生过程中重要差异表达基因,如调节转录的转录因子2(T A F2)㊁染色质重塑相关的蛋白磷酸酶1的催化亚基-β同工酶(P P P1C B)㊁能量代谢相关的溶质载体家族25-腺嘌呤核苷酸转运子成员31(S L C25A31),细胞内分子运输相关的N-乙酰葡糖胺-1-磷酸二酯酶(N A G P A)㊁半胱氨酸/组氨酸富含1(C Y H R1)和溶质载体家族39-锌转运子成员12(S L C3A12)[3]㊂来自人类原始卵泡和初级卵泡的卵母细胞在参与调节卵母细胞休眠和激活途径的基因表达上存在差异[11]㊂在小鼠中,染色质凝集的卵母细胞与弥散性染色质构型卵母细胞相比有380个差异表达基因,且大多数基因下调[12]㊂猪卵母细胞转录组数据分析差异表达基因显示,与小卵泡组相比,大卵泡卵母细胞中有60个基因上调,262个基因下调[13]㊂因此,大小卵泡卵母细胞基因表达的差异与卵母细胞成熟和发育能力的获得密切相关,但具体关系及起决定性作用的因子仍需要进一步探究㊂卵母细胞内成熟及发育相关因子的研究尚不充分,仅局限于特定因子的比较和分析㊂卵母细胞成熟促进因子(M P F)介导多种信号调控卵母细胞成熟㊂在猪小卵泡中M P F活性以及参与卵母细胞成熟的细胞周期依赖性激酶1(C D K1)㊁增殖细胞核抗原(P C N A)㊁细胞外信号调节激酶2(E R K2)的表达量显著低于大卵泡卵母细胞[14]㊂卵母细胞中原癌基因丝氨酸/苏氨酸激酶(c-MO S)参与维持减数分裂阻滞并具有调节M P F活性的作用[15-16],猪小卵泡生发泡(G V)期卵母细胞中c-M O S基因转录水平低[17]㊂猪小卵泡卵母细胞中调控卵丘扩展的基因(如骨形态发生蛋白(B M P15)㊁生长分化因子9 (G D F9)㊁透明质酸合成酶2(H A S2)㊁肿瘤坏死因子α诱导蛋白6(T N F I P6)等)表达量低,使卵丘扩展能力不足,同时引起表皮生长因子受体(E G F R)信号通路下调,卵母细胞发育能力低[18]㊂环磷酸腺苷(c AM P)是哺乳动物中保守且普遍存在的第二信使,在卵泡发育及卵母细胞成熟过程中发挥重要作用,卵母细胞减数分裂的阻滞和恢复依赖于c AM P㊂小卵泡卵母细胞c AM P含量低于大卵泡卵母细胞[19],小卵泡卵母细胞对c AM P的感应不如大卵泡,在体外成熟培养过程中添加c AM P 的类似物d i b u t y r y l c AM P(d b-c AM P),培养11h 时大卵泡c AM P含量是小卵泡卵母细胞的3倍[20]㊂卵母细胞旁分泌因子G D F9和B M P15具有调控卵泡生长[21],促进卵丘细胞和颗粒细胞的生长㊁分化,阻止卵丘细胞凋亡,促进卵母细胞成熟㊁排卵㊁受精和胚胎发育的作用[22-23]㊂G D F9和B M P15的表达模式在不同物种之间存在差异,绵羊㊁牛㊁负鼠和仓鼠在原始卵泡卵母细胞中开始表达,而大鼠㊁小鼠和人类在初级卵泡开始表达,发育至次级卵泡开始激增[24-25]㊂猪小卵泡卵母细胞中G D F9水平低于大卵泡卵母细胞,在经过体外成熟培养后大卵泡卵母细胞G D F9表达量仍显著高于小卵泡卵母细胞[26]㊂G D F9基因敲除后,卵泡生长阻滞在初级卵泡阶段,小鼠雌性不育[27],B MP15基因敲除(B MP15-/-)的小鼠生殖能力降低,排卵减少, G D F9+/-和B MP15-/-的小鼠卵泡发生㊁卵丘细胞和受精能力均出现异常[28-29]㊂另外,细胞内谷胱甘肽(G S H)是预测猪卵母细胞细胞质成熟的分子标志物,猪大卵泡卵母细胞内G S H含量显著高于小卵泡卵母细胞[30]㊂卵母细胞内脂滴等代谢物含量㊁表观遗传修饰的差异等都是导致大㊁小卵泡卵母细胞体外成熟发育能力差异的可能原因,需要更为系统的研究和阐述㊂以上研究揭示了大㊁小卵泡卵母细胞转录物㊁活性因子及调控成熟信号等的差异,表明卵母细胞内物质积累对卵泡卵母细胞生长㊁卵母细胞成熟及发育能力的获得㊁生殖的重要性,小卵泡卵母细胞物质积累不足是导致发育能力低的重要原因㊂2.2大、小卵泡的卵泡液成分及含量差异卵泡液是血清的超滤液,是穿过血滤泡屏障的血浆成分转移以及颗粒和卵母细胞分泌活动的产物,卵泡液成分包括激素㊁生长因子㊁活性氧㊁蛋白质㊁肽和氨基酸等㊂卵泡液中含有多种激素,在卵泡及卵母细胞的生长发育过程中起着关键调控作用,大㊁小卵泡内激素含量不同,卵泡对激素水平的感应不同是导致卵母细胞发育能力不同的重要因素之一㊂研究比较不同物种发现小卵泡内促卵泡激素(F S H)含量高[8,19,31],同时小卵泡颗粒细胞高表达促卵泡激素受体(F S H R),促进小卵泡进一步生长[32]㊂F S H能够激活磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/叉头转录因子O亚族1(P I3K/A k t/F O X O1)信号通路,引起固醇元件结合转录因子2(S R E B P2)上调,促进3-羟3711中国畜牧兽医51卷基-3甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMG C R)表达调控卵泡内颗粒细胞合成胆固醇[33-35],F S H还具有增强表皮生长因子(E G F)诱导E G F R酪氨酸磷酸化的作用[36],F S H-E G F R能激活S MA D2/3信号通路,调控卵丘扩展和类固醇生成[37]㊂因此,F S H 在小卵泡中含量高,可促进小卵泡的进一步生长,在大卵泡内F S H主要是促进卵母细胞核成熟㊂抗缪勒氏激素(AMH)的表达仅局限于腔前和小腔卵泡颗粒细胞,通常在小腔前卵泡中出现表达高峰,伴随着腔前卵泡直径的增加,颗粒细胞和卵泡液中AMH水平降低,优势卵泡不再产生AMH[38-39]㊂AMH在调控卵母细胞发育中的作用是增加腔前卵泡中雄烯二酮的含量,抑制颗粒细胞增殖[40-41],另外通过抑制F S H诱导的芳香酶活性共同抑制雌二醇(E2)合成[42],表明AMH对优势卵泡的选择是必需的㊂大卵泡孕酮(P4)和E2含量均高于小卵泡,促黄体生成素受体(L H R)和雌激素,及类固醇合成酶,主要是细胞色素P450酶(芳香化酶和17α羟化酶)表达量高,其作用是为激素应答做准备[30,43]㊂E2可与卵母细胞分泌因子共同作用,通过调控钠肽通路促进卵丘细胞环磷酸鸟苷(c GM P)产生[44-45],高水平c GM P维持减数分裂的阻滞,促进卵母细胞胞质充分成熟㊂卵泡液中重要成分还包括卵母细胞及颗粒细胞分泌的重要生物活性因子,B i j t t e b i e r等[46]利用蛋白组学鉴定猪卵泡液和血清中与卵丘细胞扩展相关的蛋白因子,但因技术的限制仅鉴定了13种差异表达蛋白,精确度也较低㊂因此,仍需利用转录组及蛋白组学等技术系统研究猪卵泡液关键因子及相互作用,揭示卵泡因子之间的互作以及揭示卵母细胞成熟分子调控机制㊂2.3大、小卵泡颗粒细胞和卵丘细胞的差异卵泡生长过程的重要变化包括颗粒细胞数量的增加以及颗粒细胞和卵丘细胞的分化,猪小腔卵母细胞周围的卵丘细胞数量显著低于中等卵泡卵母细胞[47],小卵泡内颗粒细胞和卵丘细胞数量不足,发挥功能受限,必定会影响卵母细胞发育能力㊂卵丘细胞分泌因子包括过氧化氢酶㊁超氧化物歧化酶㊁血管内皮生长因子㊁G S H㊁特异性转录因子和环核苷酸(c AM P㊁c GM P)等,分泌因子在维持氧化稳态,抑制凋亡,调控细胞增殖和凋亡,以及卵母细胞减数分裂恢复中发挥关键作用,能够促进卵母细胞成熟发育[48]㊂常见的颗粒细胞分泌因子包括利钠肽(N P s)㊁类表皮生长因子(E G F-l i k ef a c t o r s)㊁前列腺素(P G E)等[49]㊂其中利钠肽家族成员C-型利钠肽(C N P)由卵泡壁粒细胞分泌,结合卵丘细胞表面的利钠肽受体2(N P R2)[50],诱导c GM P的表达,具有维持卵母细胞减数分裂阻滞的作用[51],利钠肽受体系统对卵巢生长和卵母细胞减数分裂的有序发生起重要作用,决定雌性生殖能力[52-53]㊂直径1~2m m 猪卵泡卵丘细胞内N p r2m R N A水平显著低于直径3~6m m卵泡卵丘细胞[19]㊂促黄体生成素(L H)和F S H作用的重要通路是通过转活化E G F信号通路在调控卵丘细胞增殖分化中发挥作用㊂已经在啮齿类动物[54-56]㊁人[57]㊁灵长类[58]㊁牛[59]和猪[60]颗粒细胞中证实类表皮生长因子的表达,如双调蛋白(A R E G)㊁上皮调节蛋白(E R E G)和β-细胞素(B T C)㊂这些类E G F生长因子以自分泌或旁分泌形式通过E G F R作用于壁颗粒细胞和卵丘颗粒细胞[55-56,60-61],在卵母细胞减数分裂恢复中发挥关键作用㊂E G F及类表皮生长因子能够提高体外成熟卵母细胞成熟率㊁受精和早期胚胎发育能力[8,62]㊂直径<3m m的山羊卵泡卵丘卵母细胞复合体(C O C s)中E G Fm R N A水平低于直径>3m m的卵泡[63],而缺少E G F类生长因子C O C s不会发生扩展[64-65],猪小腔卵泡卵母细胞对E G F类生长因子的反应能力及结合能力低[18,65]㊂P G E2水平的升高是调控卵丘扩展和卵母细胞成熟及排卵的关键㊂抑制P G E2的合成,卵丘细胞扩展㊁卵母细胞成熟和排卵率降低,缺少P G E2或P G E2受体表达的小鼠不能排卵[66-68]㊂利用前列腺素合成抑制剂也能阻断兔㊁奶牛和灵长类动物的排卵,将前列腺素合成抑制剂直接注射到猕猴的优势卵泡中,卵泡则不能应答L H的刺激进而不能排卵,注射抑制剂的同时注射P G E2会恢复排卵[69]㊂综上,大㊁小卵泡卵母细胞㊁卵泡液㊁颗粒与卵丘细胞存在显著差异(图1):①小卵泡内卵母细胞转录活性强;基因表达与大卵泡卵母细胞有差异;c AM P含量低;c-MO S㊁M P F活性低;旁分泌因子G D F9/B M P15少;G S H含量少;②小卵泡卵泡腔内卵泡液含量及成分与大卵泡卵泡液差异显著;F S H㊁AMH含量高;P4㊁E2含量低;③小卵泡内颗粒细胞和卵丘细胞数量少;N P㊁PG E2㊁E G F家族生长因子少;N P R2表达少㊂此外,大㊁小卵泡颗粒细胞㊁卵丘细胞㊁卵泡液以及卵母细胞之间的信息交流,促进支持卵泡和卵母细胞的生长成熟,它们之间47113期李有为等:哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟的研究进展的相互联系及结合程度不同都可能造成卵母细胞发育能力差异㊂卵泡和卵母细胞生长成熟极其复杂,人们对其认识极其有限,卵泡内生命活动及其调控机制仍需要进一步阐明㊂与大卵泡相比,ʏ表示小卵泡内物质含量多;ˌ表示小卵泡内相应物质含量少C o m p a r e dw i t hl a r g ef o l l i c l e s ,ʏi n d i c a t e da h i gh e rc o n t e n to fs u b s t a n c e si ns m a l lf o l l i c l e s ;ˌi n d i c a t e dl o w c o n t e n to f c o r r e s p o n d i n g s u b s t a n c e s i n s m a l l f o l l i c l e s 图1 哺乳动物大、小卵泡内物质差异F i g .1 D i f f e r e n c e s i n s u b s t a n c e s b e t w e e n l a r ge a n d s m a l lf o l l i c l e s i nm a m m a l s 3 提高小卵泡卵母细胞体外成熟发育能力的措施在体内卵泡环境,卵母细胞长时间停滞在第一次减数分裂前期,一旦置于体外成熟培养环境,卵母细胞很快自发恢复减数分裂,完成核成熟㊂哺乳动物卵泡长至大腔卵泡时期卵母细胞才生长完全,胞质完全成熟,体外成熟培养导致小卵泡卵母细胞在胞质未成熟之前提前恢复减数分裂,使得卵母细胞发育能力低㊂基于上述小腔卵泡卵母细胞发育能力不足的原因分析,体外成熟培养过程中,提高小腔卵泡卵母细胞发育能力的举措主要是在支持生长的培养基中进行前培养或者抑制卵母细胞的核成熟,保证卵母细胞足够的胞质成熟时间,以及卵母细胞与卵丘细胞或颗粒细胞共培养,弥补小腔卵泡卵母细胞生长的不足,以提高小卵泡卵母细胞质量㊂3.1 抑制核成熟提高小卵泡卵母细胞体外成熟发育能力很多研究在卵母细胞体外成熟培养的早期阶段利用抑制剂抑制生发泡破裂(G V B D )的发生,以提高猪卵母细胞胞质的成熟,但对卵母细胞发育能力的提高非常有限㊂抑制核成熟研究最多的是卵母细胞内c AM P -蛋白激酶A (P K A )-M P F 通路的调控,在猪和小鼠卵母细胞成熟过程中使用d b -c AM P ㊁利用抑制剂3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(I B M X )㊁西洛酰胺抑制磷酸二酯酶(P D E )进而抑制c AM P 的降解,添加毛喉素(F S K )激活腺苷酸活化酶,这些都能够维持卵母细胞内高水平的c AM P ,抑制细胞核过早发生成熟,提高猪小卵泡(1~2m m )卵母细胞发育能力[70-71]㊂添加C D K 抑制剂r o s c o v i t i n e 抑制M P F 的活化,能显著提高猪[72]㊁山羊[73]㊁水牛[74]小卵泡卵母细胞体外成熟的发育能力㊂相似的,添加b u t yr o l a c t o n eⅠ抑制C D K 1也能够提高牛卵母细胞成熟[75]㊂颗粒细胞产生的C N P 被用作天然的卵母细胞核成熟抑制剂㊂在小鼠㊁山羊㊁猪和牛的研究中证实5711中国畜牧兽医51卷C N P能够抑制卵母细胞减数分裂的恢复,体外成熟培养过程添加C N P可提高小卵泡卵母细胞体外成熟的发育能力[76-78]㊂添加C N P能够维持卵丘细胞间的通讯;诱导卵母细胞染色质结构的改变;增加卵母细胞直径㊁线粒体D N A拷贝数㊁线粒体活性和活性氧水平;降低G S H水平;增加卵丘细胞功能[44,79]㊂另外,在体外延迟减数分裂自发恢复的安全有效方法是培养体系中加入卵泡液或添加卵泡液因子,利用卵泡液成分抑制核成熟,同时支持卵母细胞胞质成熟和核成熟,猪的体外成熟培养体系大都添加卵泡液㊂添加卵泡液因子也是提高卵母细胞体外成熟质量的重要方法,体外培养直径2~4m m猪卵泡卵母细胞添加c AM P㊁B M P15和G D F9的同时添加A R E G可提高卵母细胞体外成熟发育能力[18], B M P15㊁G D F9及E G F㊁胶质细胞衍生神经营养因子(G D N F)的组合均能提高卵母细胞发育能力[64,80-81]㊂除此,在培养恒河猴小卵泡(直径0.5㊁0.5~2.0m m)卵母细胞过程中发现添加人绒毛膜促性腺激素(h C G)[82]㊁A R E G[83]能够提高核成熟㊂3.2成熟前培养提高小卵泡卵母细胞发育能力成熟前培养是利用支持生长的培养基促进卵母细胞进一步生长,包括卵泡的培养和卵母细胞的前培养㊂卵泡培养能够实现早期初级卵泡甚至原始卵泡的生长,进一步完成体外卵母细胞的成熟培养,但成熟率不能达到要求㊁培养体系复杂㊁时间长㊁成本较高,并不适合于服务胚胎工程生产,在这里不做赘述㊂卵母细胞的成熟前培养常用的方法是低浓度的激素,如猪小卵泡卵母细胞在体外成熟的1/250浓度的F S H和L H的生长培养基中培养24h,随后在成熟培养基中培养20h可提高猪卵母细胞发育能力[84]㊂与抑制核成熟相似的是成熟前培养也是给予胞质充分的时间以促进其成熟,所以在前培养过程中一般在调控激素水平的基础上结合使用抑制核成熟因子㊂如在培养的前10h添加F S H㊁E2和I B M X,后10h添加P4㊁F S H㊁E2和I B M X,在随后的22h 培养过程中更换为L H㊁E G F和P4可提高猪小卵泡(3~5m m)卵母细胞发育能力[60]㊂前培养过程添加垂体腺苷酸环化酶激活多肽(P A C A P)刺激细胞产生c AM P,能够提高1~3m m猪卵泡卵母细胞发育能力[85]㊂绵羊小卵泡(2~4m m)卵母细胞添加C N P的培养基进行6h前培养,在添加A R E G和P G E2的培养基培养18h,能够提高卵裂率和囊胚率[49]㊂在临床上,将多囊卵巢综合征患者小卵泡(直径<6m m)添加C N P进行前培养,然后再利用体外成熟培养系统能够显著提高小卵泡卵母细胞成熟率和发育能力[77,86-87],同时避免了激素对患者的副作用㊂在此培养系统基础上添加A R E G则能够进一步提高多囊卵巢综合征患者小卵泡卵母细胞发育能力[88]㊂3.3颗粒细胞及卵丘细胞与卵母细胞共培养提高小卵泡卵母细胞发育能力为弥补小卵泡内颗粒及卵丘细胞数量及所分泌因子不足导致的卵母细胞发育能力降低㊂研究者通过共培养及添加相应分泌因子的方式或者改善培养方式来提高卵母细胞体外成熟的发育能力㊂用3~6m m卵泡卵母细胞颗粒细胞团与1~ 2m m卵泡卵母细胞共培养,能够提高猪小卵泡卵母细胞直径,同时促进卵母细胞的成熟[47]㊂在绵羊中研究发现,如果将来自小卵泡(0.5~1.0m m)的卵母细胞与直径3.0~4.0m m卵泡卵母细胞卵丘细胞共培养,则近48%的小卵泡卵母细胞能够恢复减数分裂并能够发育到MⅡ阶段[89]㊂山羊小卵泡(直径<3m m)卵母细胞与裸卵共培养也能够提高卵裂率和囊胚率[90]㊂这些研究表明,卵泡颗粒细胞㊁卵丘细胞以及卵母细胞自身对卵母细胞成熟和发育能力的获得都是有利的,同时,在共培养的基础上再添加其他因子也能提高卵母细胞体外成熟和发育能力㊂除上述措施外,提高小卵泡卵母细胞体外成熟的发育能力的措施还有很多,包括添加抗氧化㊁抗凋亡㊁增强线粒体功能㊁增强表观遗传修饰㊁促进卵丘扩展㊁自噬等作用的物质㊂褪黑素[91]㊁辅酶Q10[92]㊁血管内皮生长因子[93]能够提高卵母细胞体外成熟的发育能力,特别是质量差的小卵泡卵母细胞㊂亚麻酸能够提高山羊小卵泡(<2m m)卵母细胞减数分裂能力和发育至囊胚的能力[94]㊂培养猪小卵泡(1~3m m)卵母细胞时添加烟酸或烟酰胺,可改善卵母细胞体外成熟和发育能力[95]㊂促进胞质成熟,弥补小卵泡的不足能够部分提高小卵泡卵母细胞发育能力,但并不能达到大卵泡卵母细胞发育成熟的程度,还有很大的提升空间㊂4总结与展望卵母细胞生长成熟是一个异常复杂的生物过程,需要卵母细胞与邻近的颗粒细胞㊁卵丘细胞及卵6711。
牛卵丘卵母细胞体外成熟的研究进展
牛卵丘卵母细胞体外成熟的研究进展摘要：牛体外受精技术是胚胎生物工程技术研究的基础，其中牛卵丘卵母细胞体外成熟培养是体外受精技术的关键，也是重要环节。
自上世纪三十年代以来，国内外研究者们都付出了大量的研究工作，并取得了较大研究进展。
目前，牛卵丘卵母细胞体外成熟培养体系已经确立，但其中的卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育阻滞，卵母细胞的成熟调控机理等问题，还有待研究者们进一步深入探讨。
本文主要从牛卵丘卵母细胞的获得方法、体外培养条件、体外培养液及添加物、存在问题等几方面来综述其研究进展。
牛卵丘母细胞体外成熟是在牛体外模拟卵泡环境，进而诱发未成熟卵母细胞成熟的一项生物技术。
其是牛体外受精（IVF）的基础，也是重要环节之一，牛卵丘卵母细胞的体外成熟质量直接影响其体外受精效果，甚至是影响出生牛犊的质量。
本文就牛卵丘卵母细胞体外成熟研究现状、研究方法、体外成熟的判定和存在问题等进行论述。
1 研究现状有关专家于1935年利用兔卵泡中分离出来的卵丘卵母细胞进行体外培养，经成功减数分裂后，完成了兔卵丘卵母细胞的体外成熟过程。
此后，哺乳动物的卵丘卵母细胞体外成熟培养技术得到了迅猛发展。
目前，卵丘卵母细胞的体外成熟技术已被广泛应用于科学研究、医学生殖工程和畜牧生产中。
牛未成熟卵母细胞经体外培养，体外成熟率可达90%以上。
然而，体外成熟卵母细胞的质量和发育潜能与体内成熟的卵母细胞相比仍有较大差距，体外成熟的卵母细胞存在细胞质成熟差或者细胞核和细胞质成熟并不同步等问题。
针对目前牛体外受精研究中出现的问题，有关专家认为，牛卵丘卵母细胞在成熟过程中退化以及细胞质不完全成熟是造成其体外受精胚胎生产效率低的主要原因。
2 研究方法及進展2.1 牛卵丘卵母细胞的获得2.1.1 从废弃的牛卵巢中获得即运用切割法或抽吸法等机械分离法从屠宰场废弃的牛卵巢上获取未成熟的卵母细胞。
将收集卵巢置于25～35℃的生理盐水中，添加抗生素，3小时内运回实验室。
哺乳动物卵母细胞体外培养研究进展(发育生物学论文)
哺乳动物卵母细胞体外成熟研究进展生科1202班张文娅201224140212摘要：卵母细胞体外成熟培养已经成为现代胚胎生物技术的重要内容之一，是性别控制、体外受精、核移植和转基因等技术成功前提和关键[1]。
关键字：哺乳动物；卵母细胞哺乳动物卵巢内含有大量的原始卵泡，其数量因物种和发育阶段而不同，如出生小鼠大约为一万个，人和家畜约为几百万个。
到初情期后，小鼠约四千个，牛羊约十万个，猪约四十多万个，但大部分卵泡中途闭锁退化，在一个生殖周期中发生排卵的卵泡只有一个或几个[2]。
所以说，哺乳动物卵巢的开发潜力很大。
1 卵母细胞的获取卵母细胞体外成熟（in vitro maturation,IVM）是指从卵巢中获取未成熟卵，经过适宜的体外培养条件，卵母细胞发育成熟并具有受精和胚胎发育能力。
哺乳动物卵母细胞体外成熟质量对卵母细胞的激活、受精及其后继的胚胎发育均有重要影响[3]。
获取大量的优质卵母细胞是实现卵母细胞体外成熟培养的先决条件，也是胚胎生物技术研究的基础。
1.1 活体采集活体卵母细胞的采集主要有盲采法、内窥镜法和超声波法。
20世纪80年代初，Sirard首次将内窥镜用于牛卵泡卵母细胞的采集，同年Copata也以同样的方法获得成功；荷兰Pieterse等首次利用超声波技术通过子宫壁从活牛卵巢采集到卵母细胞。
盲采法由熟悉操作的人一只手通过操控采卵器进行阴道弯隆穿刺，另一只手直肠内配合引导采卵器并把握卵巢吸取含有卵子的卵泡液进行取卵[4]。
盲采法回收率达65%以上。
内窥镜法是在腹腔镜探头的观察下，通过操作杆和采卵针收集卵母细胞的方法。
内窥镜法对卵母细胞的回收率达40%-80%，超声波法回收率达60%。
盲采法是使用最多的一种方法。
活体采集对操作人员的技术要求比较高。
1.2 离体采集离体采集卵母细胞最大的优势在于取材方便，相比活体采卵技术，显著降低了卵母细胞的获取成本和对操作人员的技术要求，能够满足实验对大批量卵母细胞的需求。
家畜体外受精技术研究进展_孙剑锋
河北农业科学,2008,12(2):125-126Journal ofH ebeiAgricultural S ci en ces责任编辑 李布青家畜体外受精技术研究进展孙剑锋,岳文斌(山西农业大学动物科技学院,山西太谷 030801)摘要:综述了家畜卵母细胞的采集和体外成熟培养,体外受精及胚胎培养的研究进展,指出了家畜体外受精技术存在的问题和发展前景。
关键词:家畜;体外受精;胚胎培养中图分类号:S82113+4 文献标识码:A 文章编号:1008-1631(2008)02-0125-02Pr ogress on L ivestoc k i n V it ro Fertilization S UN Jian -feng ,YUE W en -bin(Anm i al Scie nce and T echnology College ,Sha nx i AgriculturalU niversity ,T ai gu 030801,Chi na)Abstract :The technology o f t he I VF on li vestoc k was briefly rev ie w ed ,especially so m e research progress on pic k i ng up ovum and m aturat i on c ulture in vitr o ,in vitro fertilizati on ,and e mbryo culture w ere su mm ari zed 1F i nally ,the presenceand prospects of li vestoc k in v itro fertili zati on technology w ere proposed 1K ey wor ds :L ivestock ;I n vitro fert ilizat i on ;Embryo c u lture收稿日期:2007-10-20作者简介:孙剑锋(1981-),山西大同人,硕士研究生,研究方向为动物遗传育种与繁殖调控。
生物技术论文 滩羊卵母细胞体外成熟体系建立
滩羊卵母细胞体外成熟体系建立摘要在细胞核移植过程中，体细胞必须在卵母细胞内进行重编程以恢复其全能性，卵母细胞成熟度直接影响体细胞重编程，故卵母细胞体外成熟培养是体细胞核移植极其重要环节，而卵母细胞又受环境，培养液浓度，培养温度等影响。
本实验通过探讨不同浓度的 FSH 和 LH 及 HMG影响滩羊卵母细胞体外成熟因素的研究，建立滩羊卵母细胞体外成熟体系，为滩羊核移植及以后的优良育种奠定基础。
关键词：卵母细胞;FSH:LH;HMG;体外成熟；滩羊Reprogramming of somatic cell directly, so that oocytes in vitro maturation plays an extremely importomt role in nuclear transplantation of somatic cell. However ,oocytes are affected by environment, medium concentration, culture temperature and so on ; in the research we studied the effore of different density FSH and LH and mixture of FSH and LH, HMG density, on oocytes in vitro maturation in tan sheep and established a system of oocytes in vitro maturation in tan sheep, laying the foundation for advamced breeding and nuclear transplantation of tan sheepKeywords: vitro maturation; FSH ; LH ; HMG; tan sheep目录前言 (1)1实验材料与方法 (4)1.1实验材料 (4)1.2 主要仪器和耗材 (4)1.2.1主要仪器 (4)1.2.2 试剂 (4)1.3试验方法 (5)1.3.1 卵丘-卵母细胞复合体（cumulus oocyte complexes, COCs）的收集： (5)1.3.2 卵丘-卵母细胞复合体的体外成熟培养： (5)1.3.3 卵母细胞体外成熟效果判断： (6)2.实验分析 (6)2.1 FSH和LH对滩羊卵母细胞体外成熟的影响 (6)2.2 HMG对卵母细胞体外成熟的影响 (8)3 讨论与分析 (10)4结论： (11)参考文献 (11)谢词 (12)前言滩羊是我国独特的裘皮用绵羊品种，是国家二级保护品种，2001年被农业部列入第一批畜禽品种保护名录。
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浅谈哺乳动物体外受精技术的研究进展【摘要】哺乳动物体外受精是哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。
长期以来，国内外学者对哺乳动物体外受精技术做了大量研究，取得了突破性进展。
本文分别对哺乳动物体外受精技术的研究历史、现状及方法进行探讨，以期通过本文的阐述对该技术发展进行总结。
【关键词】哺乳动物；体外受精；卵母细胞；精子获能
1.哺乳动物体外受精技术研究历史和现状
哺乳动物体外受精技术的研究在世界科学史上已有100余年的历史了。
德国科学家scnenk在1878年就开始对家兔和豚鼠进行研究实验，在实验中他对哺乳动物受精进行了大胆的研究，开始了哺乳动物体外受精的探索。
但在此期间哺乳动物的体外受精研究并没有长足的进步，该技术进入科研的新纪元是在1951年美籍华人张明觉和澳大利亚人austin发现了哺乳动物的精子获能现象以后。
1959年，张明觉和austin以家兔为实验材料，在受体外进行受精，接着把受精卵移植到母兔体内，最后母兔产出健康正常的兔仔，而且产出的兔仔发育正常。
张明觉进行哺乳动物体外受精研究的成功，这只兔仔成为世界上第一个试管哺乳动物。
20世纪60年代初至8o年代中期，界内科研工作者在进行了大量的基础研究后，取得了长足的进步，对今后体外受精技术的应用奠定了基础。
研究从最初的精子在同种或异种雌性生殖道内完成体内获能过程，发展到用化学成分明确的溶液培养获能。
这一系列的
研究成果大大推动了体外受精技术的发展并获得成功。
20世纪80年代中期以后，以牛为代表的家畜体外受精技术迅速发展，研究从理论向实践应用发展。
此后，牛的卵母细胞体外成熟和胚胎培养体系逐步趋于成熟，胚胎体外生产效率得到很大提高。
20世纪8o年代后期，体外受精技术成为发展畜牧业的重要手段，利用此技术保留了良种家畜的遗传基因，在欧美等发达国家中得到了广泛的应用并且在效益上取得了显著的效果。
2.哺乳动物体外受精的研究方法及进展
2.1卵母细胞的采集
卵母细胞的来源及质量如何直接影响了体外受精的成功率，在进行卵母细胞的采集上我们通常采用3种方法，先对这三种方法进行如下介绍：
（1）超数排卵直接获得成熟卵母细胞。
因为是在雌性动物体内获得的成熟卵母细胞，所以在进行体外受精时，不再需要对卵母细胞进行成熟培养，可以直接与获能精子进行体外受精。
但此种方法的缺陷在于，我们可以获得的雌性动物体内的成熟卵母细胞数量有限，所以在实践中很少被采用。
（2）从屠宰后母畜卵巢上采集卵母细胞。
此方法是把未成熟的卵母细胞通过人为的方法进行培养，收集成熟的卵母细胞。
未成熟的卵母细胞我们可以在宰杀后的雌性家畜体内通过机械方法获取。
这种方法具有造价低廉，卵母细胞的来源广泛，成功率高等特点，但如果要进一步研究确定遗传系谱，此种方法就存在一定的不足。
对卵母细胞进行成熟培养的具体方法是将收集的卵巢置于30℃～37℃的生理盐水中，添加抗菌素，用装有18号针头的5ml注射器，从卵巢表面直径为2～6mm小卵泡中抽取卵母细胞，也可对卵巢进行切片，收集卵母细胞。
（3）从活体卵巢中采集卵母细胞。
利用超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。
它为充分利用良种母畜和珍稀动物提供了新思路。
采卵并不会母畜的生殖能力造成影响，母畜还可以继续繁衍后代。
2.2精子获能
在正常的受精过程中，精子受能是一个必经的生理过程。
经研究表明在精子受能的过程中，雄性动物的精子在离开生殖道后要想具备受精能力，其产生的精子就必须在雌性动物的生殖道内停留一定时间发生一系列的生理变化后，才能使精子具备受精能力，学术上我们称这样过程为精子获能。
此过程是在1951年由chang发现并发表的。
精子获能的过程可以发生在雌性动物生殖道的任何部位，其中以发生在输卵管峡部为常见情况。
精子获能的全部过程是一个多时序、多时相、多步骤的复杂变化过程。
此过程分为两个阶段。
获能的第一阶段在通常意义上被我们认为是精子把其表面的抗原物质和去能因子脱出的这一过程，通过精子在其的最外层出原生质膜以使得精子增强膜的通透性。
在这个过程中，精子的变化被认为是一个生理学的变化，而且此过程是可逆的。
第二阶段是精子细胞膜蛋白变化，即发生顶体反应，第二
阶段对比于第一阶段来说是结构上的获能，它是一个不可逆的过程。
雌性动物的输卵管内含有一种叫氨基葡聚糖的物质，它的存在可以加快顶体反应的发生起到诱导作用。
一个精子获能方法有两种，即体内获能和体外获能。
体内获能是把在雌性动物体内完成精子获能的精子从雌性动物子宫中取出，再进行体外受精。
体内受能的研究因为常受到某些条件的限制，从雌性生殖道内回收到的精子数量太少，不易检测获能精子化学成分的变化，因此，我们在研究精子获能的过程中常常选择体外获能的方法。
体外获能在精子进行获能处理之前，需要对精子进行一或多次的离心处理，对精子进行洗涤，目的是除去精液中的杂质、死精、精清等物质。
在精子的获能处理的过程是一个通过培养方法或化学诱导方法来实现的过程。
ca2+可以增加精子的活动能力和诱导精子发生顶体反应，使精子内部的酸碱环境发生改变，ph值升高，最终完成精子获能过程。
在选取精液时，有研究表明，附睾精子的获能和受精能力比射出的精子的能力更强。
在进行精子获能处理的方法上，本文介绍两种方法，分别是肝素处理法和钙离子载体处理法。
(l)肝素处理法。
前文我们提到加快精子顶体反应的活性物质氨基多糖，而肝素是硫酸化程度很高的氨基多糖。
用肝素可以对牛、绵羊、马、驴冻精及猪鲜进行精子获能处理。
肝素浓度以ro-20砂ml，处理时间5-15min为最宜。
(2)离子载体法。
此方法是利用钙离子载体与钙离子形成复合物，携带钙离子进人精子内。
经过大量体外试验证明，氨基多糖(gags)能诱导牛、兔精子体
外获能和顶体反应，不同类型gags对精子获能的作用程度不同，肝素是硫酸化程度最高的gags，其作用最强。
2.3精子注射法
精子注射法(icsi)是20世纪80年代后期发展起来的一种新型的体外受精的方法，它通过显微技术将精子直接注射到卵母细胞内使其受精。
iritani(1988)等报道将单个兔的附睾精子注射到卵母细胞质中，可以使卵母细胞受精并获得仔兔。
现在显微技术受精的基本操作方法包括透明带打孔、透明带下注射法、胞质内注射法。
利用精子注射的方法可将形态异常、运动不规则或不运动的精子注射到卵母细胞内进行受精。
此技术是生产转基因动物的方法之一，也可以解决多精受精问题，但是将精子直接注射入卵内，对卵子的损伤率较高；而且这一过程费时费力，有时还会损伤精子的遗传物质。
3.结束语
综上所述，我们可以看出，当前哺乳动物ivf的基本方法已经建立，但与体内受精结果相比，ivf结果尚有很大潜力可以挖掘，尤其是在减少多精受精方面，有希望在方法学上进行突破。
不完全的卵母细胞胞质成熟、异常透明带、高精子浓度、受精培养基中不适当的添加剂以及在受精过程中的其他一些异常因素都与多精受精有关。
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