核酸分子杂交-七年制

2．印迹方法 Mechanics of transfer
Blot DNA to membrane
✓虹吸印迹法（Capillary） ✓真空转移法（Vacuum） ✓电转移法（Electrophoretic）
Capillary Blotting (upward) no special equipment required!
Migration
blocksubstrate probe
第二节 核酸探针
probe：带有可检测标记的已知DNA或RNA片段， 用于检测待测样品中的靶核酸序列。
➢ 核酸探针的类型 ➢ 核酸探针的标记方法 ➢ 核酸探针的检测
核酸探针的类型
按化学本质分：DNA探针 RNA探针
按标记物分：放射性标记探针 3H、32P、35S、125I等 优点：高特异性，高灵敏度 缺点：存在放射性污染，半衰期短 非放射性标记探针 生物素，地高辛、荧光素等
Southern blotting hybridization
提取DNA
检测靶分子为DNA, 检测靶分 子是否含有目的基因。
可用于 基因组基因的定性及定量分析、 克隆基因的酶切图谱分析、 基因突变分析等。
限制性内切酶消化 琼脂糖凝胶电泳 碱变性
转移到NC膜，高温烘烤
预杂交
与DNA或RNA探针杂交
放射自显影
•Southern印迹杂交的应用：
➢ 检测靶分子为DNA, ➢ 检测靶分子是否
含有目的基因。 ➢DNA指纹图谱
Northern blotting hybridization
检测靶分子为RNA
RNA极易被 RNase 降解 RNA酶抑制剂
0.1%DEPC处理水 (焦碳酸二乙酯)
Northern blotting hybridization
优点 吸附力强（共价结合）、机械性能好（不易破碎、可重复使用）
缺点 对蛋白具有高度亲和力，不宜使用于非同位素探针；
杂交信号的本底也高。
3、PVDF膜（聚二氟乙烯）： 1. 与尼龙膜相似 2. 其疏水性碳氟化合物可加强与核酸中磷酸成分的
离子反应，而比尼龙膜结合力更强 3. 且在预杂交中很容易被封闭 4. 杂交本底低 5. 结实耐用，可多次杂交。
应用：同一种样品经不同倍数的稀释, 可以得到半定量的结果； 核酸粗提样品的检测效idization
直接将不同的探针点印并固定在膜上，再将待测 的DNA样品与探针杂交，这样一次杂交反应就可以判 断DNA是否含有这些探针的同源序列。
第一节 核酸分子杂交的基本原理
一、变性（denaturation） 二、复性（renaturation） 三、杂交（hybridization） 四、预杂交（prehybridization）
基本原理：DNA变性、复性与分子杂交
Hybridization
Tm ：50%DNA解链的温度，又称融解温度。 （G、C含量）Tm = 69.3 + 0.41*(G +C) %
pancreas kidney skeletal liver lung placenta brain heart
muscle
Southern blotting hybridization
Dot and slot blotting hybridization
将变性后的DNA或RNA直接点样与膜上
优点：简单、迅速（直接点样）； 可在同一张膜上进行多个样品的检测；
磷酸基团以共价键结合。
（2）酶促标记法： 将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利用酶学的 方法将标记物掺入到探针分子上。 缺口平移法、随机引物法、末端标记法等
32P或35S同位素标记 的单核苷酸
dig-dUTP的结构
（1）缺口平移法（nicktranslation）
由DNA酶Ⅰ和大肠 杆菌DNA聚合酶Ⅰ 共同完成。
固相杂交
液相杂交
膜上印迹杂交
核酸原位杂交
一、膜上印迹杂交
指将待测核酸序列结合到一定的支持物上，然后与 存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程。 印迹技术：将凝胶中待测的核酸分子转移到一定
的固相支持物上的方法。
1．固相支持物的选择
特点： 较强的结合核酸的能力（>10μg/cm2）;
与核酸分子结合后，不影响核酸与探针的杂交反应; 与核酸分子的结合稳定、牢固，能经受杂交、洗膜等； 非特异性吸附少，经洗膜能将非特异性吸附的探针洗脱掉; 具有良好的机械性能，柔软性好、韧性强，便于操作。
常用的固相支持物
硝酸纤维膜、尼龙膜、PVDF膜等
1、硝酸纤维膜：
①是目前使用最多的固相支持物，对单链DNA具有较强的吸附作用， RNA经过一些特殊的变性剂处理后，也易于结合到此膜上
②在高盐浓度下，其结合能力80-100μg/cm2 ③吸附的单链DNA或RNA在真空干烤后依靠疏水作用而吸附在膜上
优点 杂交信号本底较低 缺点 ①由于是靠疏水作用结合DNA，这种结合并不十分牢固，随杂交
影响核酸分子杂交的因素
•探针的浓度、长度、复杂性 •离子强度 •温度与变性剂（甲酰胺） •杂交条件的严谨性
5’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
预杂交prehybridization
概念：为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异 性结合，在杂交前用封闭物将这些非特异性位点封闭。 这一杂交前的处理过程称为预杂交。
Vacuum blotting 30~60分钟
–more efficient and quantitative than capillary –must apply vacuum evenly and not too strongly
3．印迹类型
• Southern印迹杂交 • Northern印迹杂交 • 斑点及狭缝印迹杂交 • 反向斑点杂交 • 菌落或噬菌斑杂交
与Southern blotting hybridization不同之处：
➢ 不需要限制性核酸内切酶酶切。 ➢ 变性方法不是碱变性，而是采用聚乙二醛和二甲基亚砜、
甲醛、甲基氢氧化汞等方法。
应用：
➢ 检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平。 ➢ 比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。
GEF mRNA
非放射性标记探针：偶联反应+显色反应
Dig：半抗原，可通过抗原抗体反应系统与显色体系偶联
Dig-DNA探针
+
抗Dig抗体-碱性磷酸酶（AP） 或辣根过氧化物酶（HRP）
+
底物 ：BCIP+NBT 蓝紫色 或 DAB 红棕色； TMB 蓝色
第三节 核酸分子杂交技术
核酸分子杂交的分类
核酸分子杂交 ↓
常用的固相支持物：
硝酸纤维膜（NC）、尼龙膜、PVDF膜（聚二氟乙烯膜）等
固相支持物的选择
良好的固相支持物应具备的条件：
➢ 具有较强的结合核酸分子的能力（>10μg/cm2） ➢ 与核酸分子结合后不影响其与探针分子的杂交反应 ➢ 与核酸分子结合牢固 ➢ 非特异性吸附少 ➢ 具有良好的机械性，柔软性好、韧性强，便于操作
➢检测对象: 克隆化的基因组DNA,、细胞总DNA、总RNA。 杂交方法不同，被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞 内杂交, 即细胞原位杂交。
➢核酸分子杂交特点：高度的灵敏性(pg) 、高度的特异性
➢应用：克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定 基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。目前核酸 分子杂交不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用, 而且在 临床基因诊断上的应用也日趋增多。
➢DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使 用仔细纯化后的DNA。
（2）随机引物法 （random priming）
随机引物（4-6nt）：含 有各种可能排列顺序的寡 核苷酸片段的混合物。
46=4096
DNA聚合酶ⅠKlenow片段：
5’→3’DNA聚合酶活性
弱3’→5’外切核酸酶活性
常用的探针标记法：
（1）化学标记法：光敏生物素标记法
（2）酶促标记法： 将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后
利用酶学的方法将标记物掺入到探针分子上。 切刻平移法、随机引物法、末端标记法等
（1）化学标记法：通过分子上的活性基团直接将标
记物结合到核酸分子上.
光敏生物素标记法:强光10-20分钟，光敏基团与核酸探针的
Tm=4 ℃ X（G + C）+ 2℃ X（A + T）
融解温度：50％杂 化核酸分子解链温 度称为寡核苷酸探 针的Tm值。
寡核苷酸探针的长 度、碱基的含量和 核酸的序列决定了 探针的Tm值。
实际操作中，常选 择低于Tm值5-10℃ 进行杂交。
杂交温度：
– Tm=81.5℃ + 161.6logM + 0.41（G + C）% - 500/n - 0.61（甲酰胺%）
甲酰胺是一种变性剂，能干扰碱基堆积力和氢键的形成，
– M为Na+摩尔浓降度低，核n酸为杂探交针的的T复m值杂，性50%的甲酰胺可以使Tm降低30℃
例如，一个长度为500bp的探针，（G+C）含量为 50%，杂交体系中含5 X SSC（0.75mol/L Na+）和50% 甲酰胺，则其Tm值为：
Tm=81.5℃ + (-2.07) + 20.5 – 1 – 30.5=68.4 ℃ –50%甲酰胺溶液, 温度一般选择低于 Tm值20-25℃ –杂交温度应:68.4 ℃ - 25 ℃=43.2 ℃
及洗膜过程DNA会慢慢脱离硝纤膜而使杂交信号下降 ②对小分子量的DNA片段（<200bp）结合能力不强 ③靠高盐与DNA结合，故不适用于电转移 ④易破碎
2、尼龙膜：