蛋白质工程在医药工业中应用

单克隆抗体
• 当抗原进入体内，在机体中就会 诱导出针对不同抗原决定簇的多 种抗体，如果要把这些抗体一一 分开，用现有的生物化学Байду номын сангаас物理 化学方法是根本办不到的。1975 年科勒和米尔斯坦将小鼠免疫细 胞与肿瘤细胞融合，培养出既能 迅速生长繁殖又可分泌特异性抗 体的杂交瘤细胞。从而获得针对 某一特殊抗原决定簇的单克隆抗 体。
噬菌体表面展示系统(phage surface display system )
1990年Mc Cafferty等成功地建立了噬菌体表面展示系 统，通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于fd噬菌体基因3 的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，利 用亲和层析，两轮富集达106倍。该技术的成功给抗体基 因的筛选工作带来了革命性的变革。
Hollinger等巧妙地将Ａ抗原抗体的轻链可变区 基因(VLA)与抗Ｂ抗原抗体的重链可变区(VHB)通过 短肽连接子连接;同样地,将VHA与VLB连接,将两组 嵌合基因置于双顺反子的表达质粒中,构建成双链 抗体的表达质粒,目前报道的表达质粒均为双顺反 子。表达后,VLA VHB与VHA VLB交叉连结,形成双特 异性抗体。
蛋白质工程的应用
第一节 抗体工程
• 抗体(antibody)是抗原刺激人或动物机体 的免疫系统后，由B淋巴细胞转化为浆细 胞产生的、能与抗原特异性结合的免疫 球蛋白。
• 抗体可与细菌、病毒或毒素等抗原结合， 并通过特定的方式清除异物。
第一节 抗体工程
• 抗体工程(antibody engineering)是通过对 抗体分子结构和功能关系的研究，有计 划地对抗体蛋白序列进行改造，改善抗 体某些功能的技术。
2 鼠单抗可变区的人源化
尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时 它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗 体的鼠源成分，发展出CDR移植技术。 CDR即互补决定区。Ig超变区氨基酸残基的种类和 顺序特别多变，这些部位与识别抗原直接相关，为 Ig分子的抗原结合部位，故称为互补决定区。
CDR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的 可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗
噬菌体表面展示文库技术的要点: 从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段
随机克隆入相应载体形成组合文库
将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因 g3或 g8 的先导系列的紧靠下游
外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端
用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、 方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗 体噬菌体库。
PCR技术; 免疫球蛋白Fab片段在大肠杆菌中的成功表达; 噬菌体表面展示文库技术。
初期的抗体库技术是从淋巴细胞中提取总RNA， 反转录成cDNA或直接用总DNA为模板，用PCR技术建 立轻、重链文库，在大肠杆菌中表达后筛选。
噬菌体抗体库技术
它是在PCR技术和Phage Display的基础上实现的。 其过程是把用PCR法得到的抗体基因插入丝状噬菌 体的DNA，与噬菌体外壳蛋白的基因相连，在辅助 噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体 分子通过与P Ⅲ或PⅧ相连，在噬菌体表面的一端 或分散分布，然后可直接对噬菌体表面的抗体分子 进行筛选。
所以双特异性抗体与既往肿瘤免疫治疗相比, 除了能特异性识别肿瘤细胞外,还能将循环血液中 的免疫效应细胞再导向至肿瘤细胞处,从而使效应 细胞的抗肿瘤活性增强,发挥免疫导向作用,这是 肿瘤治疗的新突破。
5 抗体库技术
抗体库技术是用基因工程方法把人或其他动物的 全部抗体的轻、重链可变区基因克隆出来，在原核 载体上表达，然后筛选出所需的特异基因和抗体。
经过CDR移植，抗体的免疫原性极低， 而其抗原结合能力保持不变，结合半抗原 及全抗原(如细胞表面受体、病毒等)的改 形抗体都已有报道，到现在已有数百种人 源化抗体。（美国正式上市的11种治疗性 单抗中多数是改型抗体）
人源化抗体的构建可用全合成法或定点突变法。
全合成法是以人抗体序列为骨架，以鼠抗体的 CDR置换人抗体的CDR，将整个可变区序列的两条链 分解成若干片段，并使相邻的片段具有彼此互补的 粘性末端。合成所有DNA片段，每组片段分别退火， 然后逐组连接成完整的可变区基因，插入质粒中， 进一步即可用于构建和表达改形抗体。
3 小分子抗体
小分子抗体包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最 小识别单位等几种。
小分子抗体有很多优点:
可以用细菌发酵生产，成本低; 分子小，穿透力强; 不含Fc，没有Fc带来的效应; 在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出; 易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或 酶标抗体等。
单区抗体
构建重组表达载体
克隆鼠单抗的可变区基因，可从基因组文库中分 离，也可用PCR技术分离。
人抗体恒定区可根据需要选择，不同的恒定区会 带给嵌合抗体不同功能。为避免人抗体的恒定区产 生不需要的副作用，可通过点突变来修饰调整其效 应。
人一鼠嵌合抗体与鼠单抗相比，免疫原性大大降 低，利于在人体内应用，所以目前已制备出上百种 抗各种抗原(包括肿瘤相关抗原)的嵌合抗体。
6
南京农业大学 生命科学学院
抗体的分类
• 单克隆抗体：同一克隆的细胞可合成和 分泌在理化性质、分子结构、遗传标记 及生物学特性等方面都完全相同的均一 性抗体。
1 人一鼠嵌合抗体(Chimeric Antibodies)
人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒 定区融合而得到的抗体。
构建嵌合抗体的大致过程是，将鼠源单抗的可 变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因 及表达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择 标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤 细胞、CHO细胞)中表达。
Fab
最小识别单位
Fv
ScFv
(1)Fab
由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。 把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下 Fab进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的 活性。
(2)Fv 或 ScFv
Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。
Fv
连接肽
ScFv
Fv由VH与VL构成，由于其结合是非共价结合，故 Fv不稳定。
筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌，
使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体 片段，经过纯化即可获得目的抗体。
噬菌体抗体库技术的发展具有很大优越性。它简 单易行，筛选容量大，效率高，绕过了细胞融合及 免疫等步骤，而且在表型一基因型的统一和识别一 增殖过程上模拟了B细胞的成熟过程，从而在实际 应用上具有很大意义。
如果从杂交瘤细胞系构建单链抗体，可用PCR方 法扩增可变区基因，再组装到适当的表达载体上。
单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌，有2种 方式:
一是表达为包涵或非包涵体的不溶蛋白。产量高， 可达细菌蛋白总量的5%-20%，但需进行变性复性， 使其形成正确的立体结构，恢复抗体活性;
二是分泌型表达，将细菌的信号肽序列与单链抗 体的氨基端相连，单链抗体分子就可分泌到质周腔 和细菌体外，进行折叠后成为有活性的分子。但产 量不及前者，一般实验室培养条件下每升细菌的产 量仅在数毫克左右。
(3)单域抗体
即为VH，约为完整分子的1/12。它只由一个结构 域构成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所 降低，但仍保持着原单抗的特异性。
VH
(4)最小识别单位
约为完整分子的1/80-1/70大小，一般由一个CDR 构成，它也保持着抗体的特异性。
CDR
4 双特异抗体和多价抗体
双链抗体 （Diabody）一词最早由Hollinger等于 1993年创造。乃是一种小分子的双价双特异性抗体片段。
抗体的分类
• 根据抗体的制备方法和技术，将抗体分 为多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程 抗体三类。
抗体的分类
• 多克隆抗体：传统的抗体制备的方法是 将天然抗原经过各种途径免疫动物，因 为抗原性物质具有多种抗原决定簇，所 以刺激机体产生了多种B细胞克隆针对不 同抗原决定簇产生的混合抗体，并合成 和分泌各抗体到血清和体液中，这种用 体内免疫法所获得的免疫血清。
双特异性抗体(bispecific antibody,BSAb)是 指能同时识别2种抗原的抗体。1种为对应肿瘤相关 抗原。另1种为对应效应成分。
即能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性的效 应细胞,将效应细胞富集在肿瘤周围,而且可以模拟 天然配体的作用,与细胞表面引发分子结合,激活效 应细胞,实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。
在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL连成一 条单链，得到ScFv，即单链抗体。
连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，不宜太长 或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特 点。常用的连接肽是(GGGGS)3。
单链抗体的构建在已知亲本DNA序列时可用完全 人工合成法;
在具备亲本单抗可变区的cDNA克隆时，可用定点 突变法在其两端造成适当的内切酶位点，与人工合 成的连接肽编码序列连接，组装到表达载体中;
定点突变法是将人的可变区基因克隆，根据鼠抗 体的CDR 序列合成几种突变引物，用定点突变的方 法将人的可变区基因的CDR序列变为鼠抗体的CDR序 列，然后表达出改型抗体。
研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行CDR 替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此在构建 时还必需包括对影响抗原结合位点的空间结构的框 架序列进行操作。
定点突变法是将人的可变区基因克隆，根据鼠抗 体的CDR 序列合成几种突变引物，用定点突变的方 法将人的可变区基因的CDR序列变为鼠抗体的CDR序 列，然后表达出改型抗体。
研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行CDR 替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此在构建 时还必需包括对影响抗原结合位点的空间结构的框 架序列进行操作。