引物设计实例分析PPT课件
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最新 引物设计实验课课件
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10、低头要有勇气，抬头要有低气。2021/5/152021/5/152021/5/155/15/2021 8:22:52 PM
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11、人总是珍惜为得到。2021/5/152021/5/152021/5/15May- 2115-M ay-21
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12、人乱于心，不宽余请。2021/5/152021/5/152021/5/15Saturday, May 15, 2021
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15、一个人炫耀什么，说明他内心缺 少什么 。。2021年5月 *21.5.15*May 15, 2021
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16、业余生活要有意义，不要越轨。* *5/15/2021
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17、一个人即使已登上顶峰，也仍要 自强不 息。*** 21.5.15
谢谢大家
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9、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定 。2021/5/152021/5/15Saturday, May 15, 2021
• 引物分析软件（ Oligo 、Primer、Blast等）
Primer Premier 5.0 简介
主要功能：
1. 引物设计 2. 限制性内切酶位点分析 3. DNA基元（motif）查找 4. 同源性分析
• 此外，该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设计 简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的 互换、 语音提示键盘输入等等。
简并引物设计
• 获得序列未完全清楚的核酸的一种引物设计方案，特 点是所设计的引物序列某位置的核苷酸可以是两个或 者两个以上不同的碱基，结果所合成的引物是该位置 上不同序列的混合物。
• 为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同 生物的碱基使用偏好，减少简并性。
• 核苷酸链中除出现正常的A、T、G、C四种碱基符号 外还出现如R、Y、M、K等其他字母（其中 R=A/G,Y=C/T,M=A/C,S=C/G,W=A/T,H=A/C/T,B=C/ G/T,V=A/C/G,D=A/G/T,N=A/C/G/T）。
引物设计ppt
PCR引物设计
辅助软件：DNASIS
•回顾PCR原理
PCR的六大要素
• • • • • • 引物 DNA聚合酶 dNTPs 模板 缓冲液 Mg2+
DNA的表示方法
DNA有方向性，5’-------3‘ 大肠杆菌基因组大小：460万碱基对(bp)
基因的表示方法
• CDS:complement(4189888..4190658)‘板书 • CDS: (4189888..4190658)
原则4
预测引物自身的二级结构，3‘末端必须游离
在DNA聚合酶和dNTP存在的情况下，引物以自身为模 板，沿着3‘末端延伸
允许
允许
原则5
正反向引物之间不能互补配对
正向引物与正向引物也不能互补配对
反向引物与反向引物也不能互补配对
如何检查正反向互补配对
• 取正向引物的3’末端的四个碱基，反向互补 后，在正反向引物中查找 • 若查找得到说明有互补配对的情况存在， 引物要重新设计(删减或增加3’碱基数量）
基因是有方向性的，有时在这条链上，而有时在反向互补链上
起始密码子atg,编码甲硫氨酸
终止密码子：taa,tag,tga,不编码氨基酸
引物设计软件介绍
• DNASIS的功能：
• • • • 1.获得反向互补序列 2.搜索限制性内切酶位点 3.翻译情况 4.预测二级结构
• 引物：
• 要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核 苷酸引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA 序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离 决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩 增产物的两个5’末端位置。由于引物是决定 PCR扩增片段长度、位置和结果的关键， 因此，引物设计也就更为重要。
Tm值的计算
辅助软件：DNASIS
•回顾PCR原理
PCR的六大要素
• • • • • • 引物 DNA聚合酶 dNTPs 模板 缓冲液 Mg2+
DNA的表示方法
DNA有方向性，5’-------3‘ 大肠杆菌基因组大小：460万碱基对(bp)
基因的表示方法
• CDS:complement(4189888..4190658)‘板书 • CDS: (4189888..4190658)
原则4
预测引物自身的二级结构，3‘末端必须游离
在DNA聚合酶和dNTP存在的情况下，引物以自身为模 板，沿着3‘末端延伸
允许
允许
原则5
正反向引物之间不能互补配对
正向引物与正向引物也不能互补配对
反向引物与反向引物也不能互补配对
如何检查正反向互补配对
• 取正向引物的3’末端的四个碱基，反向互补 后，在正反向引物中查找 • 若查找得到说明有互补配对的情况存在， 引物要重新设计(删减或增加3’碱基数量）
基因是有方向性的，有时在这条链上，而有时在反向互补链上
起始密码子atg,编码甲硫氨酸
终止密码子：taa,tag,tga,不编码氨基酸
引物设计软件介绍
• DNASIS的功能：
• • • • 1.获得反向互补序列 2.搜索限制性内切酶位点 3.翻译情况 4.预测二级结构
• 引物：
• 要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核 苷酸引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA 序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离 决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩 增产物的两个5’末端位置。由于引物是决定 PCR扩增片段长度、位置和结果的关键， 因此，引物设计也就更为重要。
Tm值的计算
《PCR引物设计》课件
04
pcr引物的应用与案例分 析
pcr引物在基因克隆中的应用
01
pcr引物用于基因克隆的目的是为了获得目的基因的序列信息， 进而进行后续的基因功能和表达研究。
02
设计特异性引物，通过pcr技术，从基因或基因组中筛选出目的基因。
引物设计需考虑基因序列的特异性、扩增效率和避免非特异性
03
扩增等因素。
引物特异性优化
避免引物间的互补
引物之间不应存在互补序列，以避免形成引物二聚体或发夹 结构。
避免引物与模板扩增 和产物。
引物扩增效率的优化
引物与模板的匹配度
引物的3'端应与模板完全匹配，以提 高引物的扩增效率。
引物之间的匹配度
两个引物之间应有良好的匹配度，以 保证PCR反应的顺利进行。
引导合成
引物作为合成子链的起点，通过与 DNA聚合酶的结合，引导合成与 模板互补的DNA链。
决定产物长度
引物的设计决定了PCR产物的长度 ，通过选择合适的引物，可以控制 产物的大小和特异性。
pcr引物设计的基本原则
特异性
长度和序列
引物应与模板DNA具有高度的特异性，避 免与其他非目标DNA序列发生非特异性结 合。
pcr引物的未来发展方向与挑战
引物设计的自动化
随着生物信息学的发展，未来引物设计 可能更加自动化，减少人工干预和误差
。
标准化和质量控制
建立引物设计的标准化流程，加强引 物设计的质量控制，确保实验结果的
可靠性和可重复性。
新型引物设计策略
针对特定需求，开发新型引物设计策 略，提高PCR反应的特异性和灵敏度 。
引物灵敏度测试
03
测试引物在不同模板浓度下的扩增效率，选择灵敏度较高的引
PCR引物的设计公开课获奖课件
引物设计
引物 引物旳主要性 引物设计旳原则 引物与PCR 引物设计软件 怎样使用Primer Premier 5.0 引物同源性分析
引物（primers)
引物是人工合成旳两段 寡核苷酸序列，一种引 物与感爱好区域一端旳 一条DNA模板链互补， 另一种引物与感爱好区 域另一端旳另一条DNA 模板链互补。
改为vspace=PU便能够使用全部功能。
Oligo primer 3 The Primer Generator NetPrimer
怎样使用Primer Premier 5.0
引物设计
– 一般引物设计 – 5’带酶切位点引物设计 – 巢式PCR引物设计 – 多重PCR引物设计
探针设计 引物评析
引物同源性分析
用Blastn软件进行同源性比较
– 尽量选择与非目旳基因同源性小旳序列作为 引物
– 选择3’端与非目旳基因不同源旳序列作为引 物
– 选择两个引物3’端与同一非目旳基因不同源 旳序列作为引物
– 假如3’端为富含G、C旳构造，只需3’端几种碱基 与模板互补结合，就可能引起延伸，造成假引起。
引物旳保守性与特异性
保守性：通用引物——检测同一类病原 微生物尽量多旳型别
特异性：防止非特异性扩增
扩增区域旳二级构造
模板DNA旳某些区域具有高度复杂旳二级构造， 在选择引物时，应使扩增区域尽量避开这些区 域。 – 扩增区域旳自由能（△G。）不大于 58.61kJ/mol
→ Sense primer
3’
5’
5’
← 3’
Antisense primer
引物旳主要性
在整个PCR体系中, 引物占有十分主要旳 地位。PCR旳特异性要求引物与靶DNA 特异结合，不与其他非目旳DNA结合， PCR旳敏捷性要求DNA聚合酶能对引物 进行有效旳延伸，可见引物设计好坏与 PCR成果亲密有关。
引物 引物旳主要性 引物设计旳原则 引物与PCR 引物设计软件 怎样使用Primer Premier 5.0 引物同源性分析
引物（primers)
引物是人工合成旳两段 寡核苷酸序列，一种引 物与感爱好区域一端旳 一条DNA模板链互补， 另一种引物与感爱好区 域另一端旳另一条DNA 模板链互补。
改为vspace=PU便能够使用全部功能。
Oligo primer 3 The Primer Generator NetPrimer
怎样使用Primer Premier 5.0
引物设计
– 一般引物设计 – 5’带酶切位点引物设计 – 巢式PCR引物设计 – 多重PCR引物设计
探针设计 引物评析
引物同源性分析
用Blastn软件进行同源性比较
– 尽量选择与非目旳基因同源性小旳序列作为 引物
– 选择3’端与非目旳基因不同源旳序列作为引 物
– 选择两个引物3’端与同一非目旳基因不同源 旳序列作为引物
– 假如3’端为富含G、C旳构造，只需3’端几种碱基 与模板互补结合，就可能引起延伸，造成假引起。
引物旳保守性与特异性
保守性：通用引物——检测同一类病原 微生物尽量多旳型别
特异性：防止非特异性扩增
扩增区域旳二级构造
模板DNA旳某些区域具有高度复杂旳二级构造， 在选择引物时，应使扩增区域尽量避开这些区 域。 – 扩增区域旳自由能（△G。）不大于 58.61kJ/mol
→ Sense primer
3’
5’
5’
← 3’
Antisense primer
引物旳主要性
在整个PCR体系中, 引物占有十分主要旳 地位。PCR旳特异性要求引物与靶DNA 特异结合，不与其他非目旳DNA结合， PCR旳敏捷性要求DNA聚合酶能对引物 进行有效旳延伸，可见引物设计好坏与 PCR成果亲密有关。
《引物设计教程》课件
退火温度调整
适当提高退火温度有助于减少引物二 聚体的形成，因为较高的温度下二聚 体形成的概率降低。
引物特异性不高的解决策略
引物特异性验证
在引物设计完成后，应通过实验验证其特异性，确保引物只对目标序列有反应。
避免引物间的交叉反应
在设计引物时，应确保引物之间不存在交叉反应，避免与非目标序列的结合。
引物3’端的选择
Primer Premier
一款功能强大的引物设计软件，支持 多种PCR方法，可进行多参数搜索和 灵活的筛选功能。
Oligo
提供多种类型的寡核苷酸合成和设计 功能，包括引物、探针、适配体等。
GeneFisher
适用于已知序列的基因片段设计通用 引物。
BatchPrimer3
在线引物设计软件，支持多参数搜索 和灵活筛选功能。
02
引物设计的步骤
确定目标基因序列
目标基因序列的来源
可以是基因组、转录组、cDNA等。
目标基因序列的选择标准
选择基因序列时应考虑其功能、表达水平、变异程度等因素。
目标基因序列的获取方法
可以通过基因数据库、文献报道、实验测序等方法获得。
选择合适的引物序列
引物序列的设计原则
引物序列应具有特异性，避免与基因组其他序列发生非特 异性结合；长度一般在18-30bp之间；GC含量应适中， 一般在40%-60%之间。
引物长度一般在15～30碱基之间，过短可 能降低引物特异性，过长则可能导致引物 结合温度升高，不利于引物的特异性。
碱基分布均匀原则
避免二级结构原则
引物序列中的G+C含量在40%～60%之间 ，避免出现连续的4个以上的G或C。
引物自身及引物之间不能形成互补性二聚 体或发夹结构等二级结构。
适当提高退火温度有助于减少引物二 聚体的形成，因为较高的温度下二聚 体形成的概率降低。
引物特异性不高的解决策略
引物特异性验证
在引物设计完成后，应通过实验验证其特异性，确保引物只对目标序列有反应。
避免引物间的交叉反应
在设计引物时，应确保引物之间不存在交叉反应，避免与非目标序列的结合。
引物3’端的选择
Primer Premier
一款功能强大的引物设计软件，支持 多种PCR方法，可进行多参数搜索和 灵活的筛选功能。
Oligo
提供多种类型的寡核苷酸合成和设计 功能，包括引物、探针、适配体等。
GeneFisher
适用于已知序列的基因片段设计通用 引物。
BatchPrimer3
在线引物设计软件，支持多参数搜索 和灵活筛选功能。
02
引物设计的步骤
确定目标基因序列
目标基因序列的来源
可以是基因组、转录组、cDNA等。
目标基因序列的选择标准
选择基因序列时应考虑其功能、表达水平、变异程度等因素。
目标基因序列的获取方法
可以通过基因数据库、文献报道、实验测序等方法获得。
选择合适的引物序列
引物序列的设计原则
引物序列应具有特异性，避免与基因组其他序列发生非特 异性结合；长度一般在18-30bp之间；GC含量应适中， 一般在40%-60%之间。
引物长度一般在15～30碱基之间，过短可 能降低引物特异性，过长则可能导致引物 结合温度升高，不利于引物的特异性。
碱基分布均匀原则
避免二级结构原则
引物序列中的G+C含量在40%～60%之间 ，避免出现连续的4个以上的G或C。
引物自身及引物之间不能形成互补性二聚 体或发夹结构等二级结构。
第五章PCR引物设计-精选.ppt
ΔG值反映了引物与模板结合的强弱程度
引物与模板应具有较高的结合能量，这 样有利于引物与模板序列的整合。因此， 5´端与中间段的ΔG值应较高，引物3’端
的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构 并引发DNA 聚合反应。
算法：邻近热力学
例：ACGG 和其互补 TGCC 结合的ΔG： ΔG(ACGG)= ΔG(AC)+ ΔG(CG)+ ΔG(GG)
同时应预测将扩增的片段单链是否形二 级结构。如这个区域单链能形二级结构， 就避开它。如这一段不能形二级结构， 那就可以在这一区域设计引物。
若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮 助的。
1、引物设计的原则
① 引物要跟模板紧密结合； ② 引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹
引物设计要点（3）
引物的Tm值。Tm值最好接近72℃。过高（>72℃）
或过低（<37℃）都不利于引发反应。上下游引物的 Tm 不能相差太大。
长度为25mer以下的引物：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
对于更长的寡聚核苷酸， Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) –
因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特 异性与效率。
引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性 影响不大。 引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、 地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入 突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列 等。
引物的GC含量一般为45-55%，过高或 过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC含量不能相差太大。
引物与模板应具有较高的结合能量，这 样有利于引物与模板序列的整合。因此， 5´端与中间段的ΔG值应较高，引物3’端
的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构 并引发DNA 聚合反应。
算法：邻近热力学
例：ACGG 和其互补 TGCC 结合的ΔG： ΔG(ACGG)= ΔG(AC)+ ΔG(CG)+ ΔG(GG)
同时应预测将扩增的片段单链是否形二 级结构。如这个区域单链能形二级结构， 就避开它。如这一段不能形二级结构， 那就可以在这一区域设计引物。
若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮 助的。
1、引物设计的原则
① 引物要跟模板紧密结合； ② 引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹
引物设计要点（3）
引物的Tm值。Tm值最好接近72℃。过高（>72℃）
或过低（<37℃）都不利于引发反应。上下游引物的 Tm 不能相差太大。
长度为25mer以下的引物：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
对于更长的寡聚核苷酸， Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) –
因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特 异性与效率。
引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性 影响不大。 引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、 地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入 突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列 等。
引物的GC含量一般为45-55%，过高或 过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC含量不能相差太大。
《引物设计教程》课件
引物长度：通 常为15-30bp， 过长可能导致 非特异性扩增
引物GC含量： 尽量控制在 40-60%，避
免形成二级结 构
引 物 Tm 值 ： 应接近目标序 列 的 Tm 值 ， 以提高扩增效
率
引物3'端：避 免形成发卡结 构，以免影响
扩增效果
引物特异性： 确保引物与目 标序列具有高 度特异性，避 免非特异性扩
增效率和稳定性
引物3'端：避免3'端 出现连续3个或以上 的碱基，以降低错配
率
引物二级结构：使用 软件预测引物二级结 构，避免形成发卡结 构，提高扩增效率
引物特异性：通过 BLAST比对，确保引 物特异性，避免非特
异性扩增
引物浓度：优化引物 浓度，以提高扩增效
率和稳定性
引物纯度：确保引物 纯度，避免污染和降 解，提高扩增效率和
引物GC含量：尽量保持 50%左右，避免过高或 过低
引 物 Tm 值 ： 确 保 引 物 Tm 值在55-65℃之间，以提 高扩增效率
引物特异性：确保引物与 目标序列具有高度特异性， 避免非特异性扩增
引物错配：避免引物内部 错配，以提高扩增效率和 准确性
引物设计软件：可使用 Primer3、OligoT等软 件辅助设计引物
引物设计不当导 致扩增失败
引物设计不当导 致非特异性扩增
引物设计不当导 致扩增效率低
引物设计不当导 致扩增产物长度 不均一
引物设计软件：选择 合适的引物设计软件， 如Primer3、Primer-
BLAST等
引物长度：确保引物 长度在18-25bp之间， 以提高特异性和扩增
效率
引物GC含量：保持 引物GC含量在4060%之间，以提高扩
《基因引物设计》课件
引物的长度一般在15-30bp之间，根据目 标基因序列的特性和实验要求选择合适的 长度。
选择合适的引物序列
避免引物二聚体和发夹结构
引物的序列应与目标基因序列完全互补， 且在3’端应有一个突出的单链区域，以便 于DNA聚合酶的结合和延伸。
引物自身不能形成二聚体或发夹结构，否 则会影响引物的结合和DNA聚合酶的延伸 。
2023
PART 03
基因引物设计的实践应用
REPORTING
基因克隆与表达
基因克隆
基因引物设计是基因克隆过程中的关键 步骤，通过设计特异性的引物，可以实 现对目标基因的特异性扩增，进而进行 克隆和表达。
VS
基因表达
在基因表达方面，基因引物设计可用于检 测基因的表达水平，通过设计特异性引物 ，对特定基因的表达产物进行扩增和检测 ，从而了解该基因的表达情况。
2023
PART 02
基因引物设计的基本步骤
REPORTING
选择合适的引物设计软件
总结词
选择合适的引物设计软件是基因引物设计的重要步骤，有助于提高引物设计的 效率和准确性。
详细描述
在选择引物设计软件时，应考虑其功能、易用性、准确性和可靠性。一些常用 的引物设计软件包括Primer3、Oligo、Beacon Designer等，这些软件可根据 用户需求提供不同的引物设计方法和功能。
基因引物设计的重要性
确保基因复制的准确性和完整性
基因引物是DNA复制的起始点，设计合理的引物能够确保复制的 准确性和完整性，避免出现突变或缺失。
提高PCR扩增效率
设计合理的基因引物可以提高PCR扩增效率，缩短扩增时间，提高 实验效率。
应用于基因克隆、测序等领域
NCBI基本功能与引物设计PPT课件
9
Blast简介
BLAST ： “局部相似性基本查询工具”(Basic Local Alignment Search Tool) 的 缩写，是由NCBI开发的一个基于序列相似性的数据库搜索程序。
主要的Blast程序：
程序名 Blastn
查询序列 核酸
Blastp
蛋白质
数据库 核酸
蛋白质
搜索方法 核酸序列搜索逐一核酸数据库中的序列
CCNGTNAAYGGNAAYGGNAARYCAR
下游 P V N G N G K Q
C or T/U
1. 根据密码子表建立引物系列
http://www.kazusa.or.jp/codon/
2. 谨慎使用次黄嘌呤
29
➢简并引物设计过程
传统方法（适用于保守度高序列） • 应用BLAST进行同源序列搜索 • 应用DNAMAN选择保守区域（氨基酸或核苷酸） • 简并引物设计原则 • Primer5和Oligo6进行引物分析 CODEHOP法（适用于保守度低序列）
蛋白质序列搜索逐一蛋白质数据库中的序列
Blastx Tblastn TBlastx
核酸 蛋白质
核酸
蛋白质 核酸 核酸
核酸序列6框翻译成蛋白质序列后和蛋白质数据 库中的序列逐一搜索。
蛋白质序列和核酸数据库中的核酸序列6框翻译 后的蛋白质序列逐一比对。
核酸序列6框翻译成蛋白质序列，再和核酸数据 库中的核酸序列6框翻译成的蛋白质序列逐一 进行比对。
1.登陆NCBI——Blast——Primer-BLAST: /
25
以文献报道鸡的MUC2的引物为例：
26
27
28
简并引物设计
Symbol Definition
Blast简介
BLAST ： “局部相似性基本查询工具”(Basic Local Alignment Search Tool) 的 缩写，是由NCBI开发的一个基于序列相似性的数据库搜索程序。
主要的Blast程序：
程序名 Blastn
查询序列 核酸
Blastp
蛋白质
数据库 核酸
蛋白质
搜索方法 核酸序列搜索逐一核酸数据库中的序列
CCNGTNAAYGGNAAYGGNAARYCAR
下游 P V N G N G K Q
C or T/U
1. 根据密码子表建立引物系列
http://www.kazusa.or.jp/codon/
2. 谨慎使用次黄嘌呤
29
➢简并引物设计过程
传统方法（适用于保守度高序列） • 应用BLAST进行同源序列搜索 • 应用DNAMAN选择保守区域（氨基酸或核苷酸） • 简并引物设计原则 • Primer5和Oligo6进行引物分析 CODEHOP法（适用于保守度低序列）
蛋白质序列搜索逐一蛋白质数据库中的序列
Blastx Tblastn TBlastx
核酸 蛋白质
核酸
蛋白质 核酸 核酸
核酸序列6框翻译成蛋白质序列后和蛋白质数据 库中的序列逐一搜索。
蛋白质序列和核酸数据库中的核酸序列6框翻译 后的蛋白质序列逐一比对。
核酸序列6框翻译成蛋白质序列，再和核酸数据 库中的核酸序列6框翻译成的蛋白质序列逐一 进行比对。
1.登陆NCBI——Blast——Primer-BLAST: /
25
以文献报道鸡的MUC2的引物为例：
26
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简并引物设计
Symbol Definition
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1. 引物的长度
一般为15-30bp，常用的是 18-27bp，但不能大于38，因为过 长会导致其延伸温度大于74℃，即 Taq酶(Taq酶是从水生栖热菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）中
分离出的具有热稳定性的DNA 聚合酶。 对于PCR的应用有里程碑的意 义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶， 使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量 应用，并逐步应用于临床。 与一般酶不同,用Taq酶扩增DNA时常使片
引物设计实例分析
引物设计基本原则
• 引物长度（primer length） • 产物长度（product length） • 序列Tm值 (melting temperature) • G+C含量（composition） • 引物二聚体及发夹结构
（duplex formation and hairpin） • 阅读框
LOCUS
NM_057143
1097 bp mRNA linear ROD
1 gtgccgagca cagttactgg aaggcttaac caaagttttg atgcctggga accgcgcagg 61 aaaaacacgc ggaacgtgct tcacagtggc ggctaactgc tctcgttcgc tgtgcagagc 121 cgtctggcag ggttgacctc ctaaagggat attccatctt tattaatcat tagtagtgtg 181 gtcagagact tagcaccatt ggtctccccc aacctggtcc agacatttca gcagtttatc 241 ggaacagcaa caacagcaac aaaaccttca aaatttacaa gtctttaaga aatagaaatg 301 gcatccaaaa gagctctggt catcctagcc aaaggagcag aggagatgga gacagtgatt 361 cctgtggaca tcatgcggcg agctgggatt aaagtcaccg ttgcaggctt ggctgggaag 421 gaccccgtgc agtgtagccg tgatgtagtg atttgtccgg ataccagtct ggaagaagca 481 aaaacacagg gaccatacga tgtggttgtt cttccaggag gaaatctggg tgcacagaac 541 ttatctgagt cggctttggt gaaggagatc ctcaaggagc aggagaacag gaagggcctc 601 atagctgcca tctgtgcggg tcctacggcc ctgctggctc acgaagtagg ctttggatgc 661 aaggttacat cgcacccatt ggctaaggac aaaatgatga acggcagtca ctacagctac 721 tcagagagcc gtgtggagaa ggacggcctc atcctcacca gccgtgggcc tgggaccagc 781 ttcgagtttg cgctggccat tgtggaggca ctcagtggca aggacatggc taaccaagtg 841 aaggccccgc ttgttctcaa agactagaga gcccaagccc tggaccctgg acccccaggc 901 tgagcaggca ttggaagccc actagtgtgt ccacagccca gtgaacctgg cattggaagc 961 ccactagtgt gtccacagcc cagtgaacct caggaactaa cgtgtgaagt agcccgctgc 1021 tcaggaatct cgccctggct ctgtactatt ctgagccttg ctagtagaat aaacagttcc
4. 引物的GC含量
有效引物中(G+C) 的比例为40-60%，过高或过 低都不利于引发反应。上下 游引物的GC含量不能相差太 大。
5.碱基础随机分布
• 引物中四种碱基的分布最好是随机的， 不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′ 端不应超过3个连续的G或C，因这样会使 引物在G+C富集序列区错误引发。
10.密码子的简并
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密 码子的第3位，因密码子的第3位易发生简 并，会影响扩增特异性与效率。
11.引物的特异性
引物与非特异扩增序列的同源性不要 超过70%或有连续8个互补碱基同源。
任务
设计DJ-1蛋白表达引物
Plasmid 1:
Plasmid 2
第一步：检索DJ-1mRNA基本序列
的最适温度 段3'端凸出一个A,应注意)
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2.产物的长度
扩增片段长度为100~600碱基对.
3. Tm值
引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般 不超过2度. 如果引物中的G+C含量相对 偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一 定的退火温度.
Tm=2(A+T)+4(C+G)
8.引物的3′端
引物的延伸是从3′端开始的，不能进 行任何修饰。3′端也不能有形成任 何二级结构可能，
9.引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长 度，它对扩增特异性影响不大。因此，可 以被修饰而不影响扩增的特异性。引物 5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物 素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质 结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺 失突变序列和引入一启动子序列等。
6. 引物自身
引物间3’端的互补、二聚体 或发夹结构也可能导致PCR反应失败
引物自身不应存在互补序列，否则引物自 身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。 这种二级结构会因空间位阻而影响引物与 模板的复性结合。若用人工判断，引物自 身连续互补碱基不能大于3bp。
7. 引物之间
两引物之间不应不互补性，尤应避免 3′端的互补重叠以防引物二聚体的形 成。一对引物间不应多于4个连续碱基 的同源性或互补性。