生化实验技术离子交换总结

2、思考题（选作） （1）应用那些方法能够降低样品溶液中盐的浓度，各种方 法的优缺点及适用范围。 （2）离子交换Hale Waihona Puke Baidu析与蛋白质的等电点有无关系，试分析说 明。
本实验注意事项
1. 所有层析过程和样品处理要用蒸馏水，管路、试 管、容器先用自来水洗干净后，再用蒸馏水冲一 下。 2. 实验结束以后，清洗所有用过的器皿、回收凝胶、 清洗管路、台面擦干净。 3. 值日生清扫。
3. 离子交换层析法纯化抗体：在线检测并收集（第2天） 4. SDS-PAGE法检测各收集管中的抗体 （第3天）
离子交换层析的基本条件：
离子交换剂：DEAE-Sepharose Fast Flow 洗脱方式：盐浓度梯度洗脱（NaCl浓度从0 到1 mol/L） 洗脱液的pH： 8.8（在此条件下，抗体带负电）
生化实验技术课安排
时间： 根据实验内容和学生时间安排
实验报告： 根据实验内容确定
生化实验技术课成绩评定
① 平时成绩：占50分，包括出勤情况，课 堂表现（态度、动手能力和实验结果）， 实验报告等。 ② 期末考试：占50分，以口试方式，在实 验室进行，学生按抽签，分别到指定教 师处考试。考试内容为本课程所涉及的 实验原理、实验设计、动手操作、结果 分析、注意事项等。
平衡离子与带电基团的电荷相反。靠静电引力与带电基团结合. 结合是可逆的，可以被其它离子所取代。
3、离子交换层析过程和原理
1 平衡 2 上样和吸附 3 洗脱（弱） 4 洗脱（强） 5 再生/平衡
平衡离子
待分离的两种物质
低盐洗脱
高盐洗脱
3、离子交换层析过程和原理 — 洗脱曲线
再生 上样 A 280 nm 梯度洗脱 1.0
用途：分析和制备各种极性物质（例如蛋白质、 核酸、多糖、及其单体和寡聚物）
1、种类
强阳离子交换 阳离子交换 离子交换 阴离子交换 弱阳离子交换 强阴离子交换 弱阴离子交换
2、离子交换剂 (Ion Exchanger)
组成 ： 固体支持物 (insoluble matrix) 带电基团 (charged groups) 平衡离子 (counter-ions)
平衡
平衡 0 洗脱体积
NaCl浓度
4、影响分离效果的因素
• 离子交换剂
• 层析条件的选择
样品缓冲液和洗脱液的pH 洗脱方式 流速 平衡离子 层析柱 样品体积 ……
4、影响分离效果的因素 — pH对蛋白质层析的影响
蛋白质是两性电解质，pH影响其带电状态
4、影响分离效果的因素 — pH对蛋白质层析的影响
1 90 80 70 吸光值（相对值） 60 50 40 30 20 10 0 2 3 0.6 0.5 0.4 NaCl浓度（mol/L） 0.3 0.2 0.1
280 nm
0
0 10 20 30 洗脱液体积（ml） 40 50 60
-0.1
实验报告要求
1、层析和电泳写一份实验报告。先写层析，然后写电泳。 层析部分包括原理及层析过程、简要操作、层析结果 （包括洗脱曲线并注明洗脱体积、实验条件写在洗脱曲线 的边缘）、分析实验结果。
280 nm
抗体的检测 – SDS-PAGE
IgG重链50k IgG轻链25k
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
从各收集管中取出 20 l 用SDS-PAGE 方法检测。
泳道2：标准分子量蛋白 泳道3：不结合的蛋白 （峰1），不含抗体蛋白 泳道4-10：结合的蛋白（峰2），含抗体蛋白 泳道11-15和泳道1：结合的蛋白（峰3），不含抗体蛋白
生物化学实验技术
生化实验技术课安排
1、层析技术（台桂花） 离子交换层析分离纯化抗体（2天） 2、电泳技术（台桂花） SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（可用于抗体 分离纯化过程的检测）（1天） 3、免疫检测技术（王桂云） 酶联免疫和双向免疫扩散（2天） 4、多糖分离和鉴定技术（周义发、魏民） 中草药多糖的分离提取和理化性质研究 （2-4周，）
常规液相： 洗脱液A 梯度混合器 洗脱液B
两种洗脱液，A和B，相同pH，不同盐浓度，B的盐浓度大于A, A和B按不同比例混合，B的比例逐渐增大
本实验课内容 《兔血清中抗体的分离纯化》
1. 盐析法将抗体从血清中分离：抗体可在33-50% 饱和 度的硫酸铵中沉淀（第1天） 2. 透析法除去抗体样品中的盐：透析到洗脱液A中（第1 天过夜）
非梯度洗脱（isocratic)： 洗脱液不变 梯度洗脱 （gradient)： 洗脱液的pH或盐浓度逐渐增加 或降低
4、影响分离效果的因素 — 洗脱方式的选择
连续梯度洗脱 不连续梯度洗脱
4、影响分离效果的因素 — 洗脱方式的选择
几种梯度组合
4、影响分离效果的因素 — 连续梯度的形成
高效液相： 洗脱液A 洗脱液B 泵A 混合器 泵B
注意：样品应透析到低盐缓冲液中（即洗脱液A）， 在低盐条件下，抗体能结合， 在高盐条件下，抗体不能结合。
洗脱过程和曲线
上样 A 280 nm
梯度洗脱
1.0 NaCl浓度
平衡（基线跑平） 0
洗脱体积
洗脱过程和曲线
1 90 80 70 60 吸光值（相对值） 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 洗脱液体积（ml） 40 50 60 0 -0.1 2 3 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 NaCl浓度（mol/L）
4、影响分离效果的因素 — pH对蛋白质层析的影响
阳离子交换层析常用缓冲液：
4、影响分离效果的因素 — pH对蛋白质层析的影响
阴离子交换层析常用缓冲液：
4、影响分离效果的因素
• 离子交换剂
• 层析条件的选择
样品缓冲液和洗脱液的pH 洗脱方式 流速 平衡离子 层析柱 样品体积 ……
4、影响分离效果的因素 — 洗脱方式的选择
带电基团决定了离子交换层析的种类： 阳离子交换 （强 / 弱） 阴离子交换 （强 / 弱） 带电基团决定了层析的基本性质： 哪种物质结合（type） 结合强弱 （strength） 结合多少（capacity）
（3）平衡离子（counter-ions)
阴离子 例如Cl-、OH（阴离子交换剂）
阳离子 例如K+、Na+ （阳离子交换剂）
（1）固体支持物（insoluble matrix)
固体支持物： 无机化合物，例如羟基磷灰石 合成树脂，例如聚苯乙烯二乙烯苯 合成高聚物，例如MonoBeads、SOURCER 多糖，例如葡聚糖、琼脂糖、纤维素
（1）固体支持物（insoluble matrix)
固体支持物决定了以下层析性质： 柱效（efficiency) 容量 （capacity) 回收率（recovery) 化学稳定性（chemical stability) 机械强度（mechanical strength) 流动性（flow properties)
（2）带电基团（charged groups)
阳离子电荷基团 例如CM、 SP、 S （阴离子交换剂）
阴离子电荷基团 例如DEAE、QAE、Q （阳离子交换剂）
电荷基团以共价方式联到固体支持物上。不能通过转型改变带电基团。
（2）带电基团（charged groups)
常见带电基团的化学结构：
（2）带电基团（charged groups)
层析（chromatography）简介
纸层析 种类
薄层层析 气相色谱 柱层析 液相色谱 （常规液相 / 高效液相） 离子交换层析 凝胶过滤 （分子筛层析）
亲和层析
疏水作用层析
等等
离子交换柱层析
离子交换层析 (Ion Exchange Chromatography) ： 一种吸附层析技术，根据分子极性的差异而进 行分离。