增强免疫力功能试验

增强免疫力功能试验

一、实验目的与要求

1熟悉动物实验的操作技术与要求；

2掌握保健食品增强免疫力功能检验与评价的方法。

二、实验原理

1免疫力是人体免疫系统进行自我保护的一种能力，主要的作用之一是指身体抵抗细菌或病毒等感染的能力。健全的免疫系统主要有三大功能：

1)防御功能——保护机体不受损害，帮助机体消灭外来的细菌、病毒以及避免发生疾病；

2)稳定清洁功能——不断清除衰老死亡的细胞，保持体内的净化更新；

3)监控功能——及时识别和清除染色体畸变或基因突变的细胞，防止肿瘤和癌变的发生。

2机体的免疫力功能包括细胞免疫功能、体液免疫功能、单核巨噬细胞功能和NK细胞活性4个方面，通过检测动物实验后免疫系统的变化来判断样品是否具有增强免疫力的功能。

三、实验仪器与试剂

仪器试剂

（1）200目筛网

（2）24孔培养板

（3）96孔培养板（平底）（4）玻片架

（5）微量血凝实验板（6）血色素吸管

（7）手术器械

（8）打孔器

（9）计时器

（10）二氧化碳培养箱（11）超净工作台

（12）恒温水浴

（13）离心机

（14）酶标仪

（15）721型分光光度计（16）显微镜（1）生理盐水

（2）丙酮

（3）甲醇

（4）盐酸

（5）异丙醇

都氏试剂（碳酸氢钠 1.0g，高

铁氰化钾0.2g，氰化钾0.05g，

加蒸馏水至1000mL）

（9）Na2CO3

（10）RPMI1640培养液

（11）小牛血清

（12）2巯基乙醇（2ME）

（13）青霉素

（14）链霉素

（15）刀豆蛋白A（ConA）

（16）Hank’s液

（17）PBS缓冲液（pH7.2~7.4）

（18）SA缓冲液

（19）琼脂糖

（20）印度墨汁

（21）SRBC

（22）鸡红细胞

（23）Y AC-1细胞

（24）补体（豚鼠血清）

（25）MTT

（26）Giemsa染液；

（27）乳酸锂或乳酸钠；

（28）硝基氯化四氮唑（INT）

（29）吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）

（30）NAD

（31）0.2mol/L的TrisHCl缓冲液（pH8.2）

（32）1%NP40或2.5%Triton

四、实验方法与步骤

1样品处理与给予方式

（1）对于水溶性样品，用蒸馏水配制成溶液或悬浮液灌胃给予动物；对于脂溶性样品，用调和油配制成溶液或悬浮液灌胃给予动物。

（2）受试样品推荐量较大，超过实验动物的灌胃量、加入饮水或掺入饲料的承受量等情况时，可适当减少受试样品中的非功效成分的含量。

（3）对于含乙醇的受试样品，原则上应使用其定型的产品进行功能实验，其三个剂量组的乙醇含量与定型产品相同。如受试样品的推荐量较大，超过动物最大灌胃量时，允许将其进行浓缩，但最终的浓缩液体应恢复原乙醇含量。如乙醇含量超过15%，允许将其含量降至15%。调整受试样品乙醇含量应使用原产品的酒基。

（4）液体受试样品需要浓缩时，应尽可能选择不破坏其功效成分的方法。一般可选择60~70℃减压进行浓缩。浓缩的倍数依具体实验要求而定。

（5）对于以冲泡形式饮用的受试样品（如袋泡剂），可使用该受试样品的水提取物进行功能实验，提取的方式应与产品推荐饮用的方式相同。如产品无特殊推荐饮用方式，则采用下述提取的条件：常压，温度80~90℃，时间30~60min，水量为受试样品体积的10倍以上，提取2次，将其合并浓缩至所需浓度。

（6）必须经口给予受试样品，首选灌胃。如无法灌胃则加入饮水或掺入饲料中，计算受试样品的给予量。

（7）以载体和功效成分（或原料）组成的受试样品，当载体本身可能具有相同功能时，应将该载体作为对照。

2动物实验

（1）动物选择：推荐用近交系小鼠，20g±2g，单一性别，每组10~15只。

（2）剂量分组：实验设三个剂量组和一个空白对照组，以人体推荐量的10倍为其中一个剂量组，另设两个剂量组，必要时设阳性对照组。

（3）样品给予时间：所有试验动物均食用全价营养配合饲料，动物自由摄食、摄水。给予受试物的灌胃体积为20ml/（kg·Bw）。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天，免疫模型动物实验可适当延长。

3指标检测

A ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验（MTT法）

1)试剂配制

i完全培养液：RPMI1640培养液过滤除菌，用前加入10%小牛血清，1% Pen/Strep/Glutamine (100×, liquid)及5×10-5mol/L的β-巯基乙醇，用无菌的1mol/L的

HCl或1mol/L的NaOH调pH至7.0~7.2，即完全培养液。

ii ConA液：用双蒸水配制成100μg/ml的溶液，过滤除菌，在低温冰箱（-20℃）中保存。

iii无菌Hank’s液：用前以3.5%的无菌NaHCO3调pH7.2~7.4。

iv MTT液：将5mg MTT溶于1ml pH7.2的PBS中，现配现用。

v酸性异丙醇溶液：96ml异丙醇中加入4ml 1mol/L的HCl，临用前配制。

2)脾细胞悬液制备：无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，

制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，或用4层纱布将脾磨碎，用Hank’s液洗2次，每次离心10min（1000r/min）。然后将细胞悬浮于1ml完全培养液中，用台酚蓝染色计数活细胞数（应在95%以上），调整细胞浓度为3×106个/ml。

3)淋巴细胞增殖反应：将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，一孔加75μl ConA

液（相当于7.5μg/ml），另一孔作为对照，置5% CO2，37℃ CO2孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT（5mg/ml）50μl/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混