大鼠急性脑缺血及缺血再灌注中ERK5的表达情况

大鼠急性脑缺血及缺血再灌注中ERK5的表达情况

摘要】目的：观察大鼠脑皮质中细胞外信号调节激酶5(ERK5)在缺血及缺血再灌的不同表达，探讨其在脑缺血再灌注损伤中的意义。方法：采用线栓法建立大脑中动脉闭塞( MCAO) 模型，所有大鼠随机分为假手术组、缺血梗死组和缺血再灌组。对各组大鼠行神经功能评分，TTC染色测定脑梗死体积，免疫组织化学法测

定ERK5表达。结果：缺血再灌注组大鼠的神经功能缺损和脑梗死体积均比缺血

梗死组大鼠严重。ERK5在缺血梗死组和缺血再灌组都表达，后者明显多于前者。结论：ERK5可能参与脑缺血再灌注损伤过程并起着重要作用。

【关键词】脑缺血；缺血再灌注损伤;细胞外信号调节激酶5(ERK5);表达

【中图分类号】R742 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）10-0172-02

Expression of ERK5 in rats cortex afer cerebral ischemia and reperfusion TAN Zhongxu1,SONG Yuqiang2,LV Jinglei3,YU Liqun1,SHI Shenggui11Qingdao University Medical College,Qingdao 266021,China.2Department of Neurology,the Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003,China .3 The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,Qingdao 266003,China 【Abstract】Objective To observe the different expression of ERK5 in rats cortex in response to cerebral ischemia and ischemia/reperfusion, and investigate the significance in ischemia/reperfusion injury.Methods Blocking middle cerebral artery with intraluminal thread was used to build cerebral middle artery infarction model ( MCAO).All rats were randomly divided into sham operation group,ischemia groupand ischemia/reperfusion (I/R)group.The Longa score was used to evaluate revived rats and TTC staining was used to determine the infarct volumes.we investigated the activation and expression of ERK5 by immunohistochemistry.Results 24 hours after MCAO, neurological function scores were significant increased in I/R group compared with ISCH group. the infarct volume was in I / R group was larger.The activation of ERK5 was rapidly induced by ischemia, and I/R group were significantly higher than Ischemia group.Conclusion We hypothesize that ERK5 might participate in the pathogenesis of isehemic/reperfusion and play an important effect during

ischemia/reperfusion injury.

【Key words】 Cerebral ischemia ;Ischemia/reperfusion injury; Extracellular signal regulated protein kinase(ERK5); Expression

1.前言

治疗急性脑缺血患者的最佳办法是能及时恢复脑组织血液供应, 然而恢复血

流灌注给脑组织带来新的损伤, 即缺血再灌注损伤。目前研究证明，丝裂原活化

蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）参与脑缺血再灌注损伤的

过程[1]。其中，细胞外信号调节激酶5（ERK5）是新发现的成员[2]。本实验通过采用线栓法构建大脑中动脉闭塞(MCAO) 模型，观察大鼠脑皮质ERK5在缺血及缺血再灌24h的不同表达情况，探究其在缺血再灌损伤中的可能作用。

2.材料与方法

2.1 动物

选择8周龄成年健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠50只，体重220～260g, 由青岛市药物检验所实验动物中心提供。实验前将动物置于实验室1周适应环境,均自由饮水、进食,实验室室温(25±2)℃,相对湿度65%,自然光照。

2.2 方法

2.2.1动物模型的建立和分组大鼠制备局灶性脑缺血再灌注模型，采用Zea-Longa等的大脑中动脉线栓法[3]。具体步骤如下：采用2.0鱼线为栓线，以10％

水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧固定，分离并暴露右侧颈总动脉（common carotid artery,CCA）、颈内动脉（internal carotid artery,ICA）和颈外动

脉（external carotid artery,ECA），结扎并切断ECA及其分支，沿根部结扎ICA颅

外分支翼腭动脉。由ECA残端插入一根鱼线，沿ECA、CCA分叉部和ICA轻轻推进，至ICA颅内分叉处时可阻断流入大脑中动脉（middle cerebral artery，MCA）

的血流，进线长度为18～20mm。假手术组大鼠只暴露动脉，不进行插线操作。

所有麻醉大鼠苏醒时间要求在术后2小时之内，未苏醒者剔除。待神经功能评分后，将符合实验要求的大鼠（即建模成功）随机分为缺血再灌组（I/R组）和缺

血梗死组（ISCHE组）。缺血再灌组：大脑中动脉阻闭2h后，抽出约10mm鱼线，恢复血流灌注24h；缺血梗死方法：大脑中动脉阻闭2h后不拔鱼线，继续阻塞

24h。最后心脏灌注取脑，用4％的多聚甲醛灌注固定，制备石蜡切片。

2.2.2神经功能评分和脑梗死体积的测定参照Zea-Longa[3]、谢惠芳等[4]TTC

染色法分别进行神经功能评分和测定脑梗死体积。

2.2.3免疫组织化学法（SABC法）检测ERK5蛋白表达石蜡切片脱蜡至水，0.01M PBS溶液洗2min×3次；3%H202室温lOmin灭活内源性酶；微波修复抗原；滴加5%BSA封闭液,室温孵育20min；滴加羊抗大鼠ERK5单克隆抗体（1: 200）,4℃过夜；滴加生物素化二抗,37℃反应30min；用SABC免疫组化试剂盒染色，DAB

显色。所有切片均在同一放大倍数下进行观察，每张切片先在低倍镜下随机选择

梗死灶周围区4个象限视野，然后在高倍镜下(400倍)选择缺血灶周围5不连续的视野观察，计数阳性细胞，取其平均值。

2.3 统计学处理

采用SPSS 18.0软件包进行统计处理,数据均采用均值±标准差(x-±s)表示,各组

间差异比较用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3.结果

3.1 神经功能评分和梗死体积测定

模型组老鼠均出现严重的神经功能缺失,且两组间评分差异具有统计学意义(P

＜0.05，t=3.623)。假手术组大鼠脑组织未见梗死灶,脑组织呈粉红色；模型组均

见不同程度的梗死灶,梗死灶呈白色；梗死组体积小于再灌组，两者间差异具有统

计学意义(P<0.05，F=1.433)。

3.2 ERK5的表达

假手术组大鼠皮质区神经细胞内ERK5蛋白几乎不激活表达。然而，模型组

大鼠缺血侧皮质区均可见ERK5阳性细胞分布，在细胞浆和细胞核内呈棕黄色着色。其中，再灌组的阳性细胞数明显高于梗死组 (P<0.05，t=8.876)。

注：与假手术组比，*P＜0.01;与缺血梗死组比，#P＜0.05

4.讨论

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated proteink inases, MAPKs)家族在哺乳动物细胞内广

泛表达，是一个介导细胞反应的重要信号系统，参与介导各种细胞过程。ERK5 是新发现的一

个成员，在许多组织细胞中都有表达,最高表达水平被发现在大脑[2]，参与不同病理生理过程：缺血性损伤、肿瘤细胞的增殖、分化、动脉粥样硬化以及细胞凋亡等，可被低氧、缺血、高

渗溶液、层流剪切应力等多种细胞外刺激激活；神经营养因子（BDNF）、生长因子(VEDF、EGF)和特定的炎症因子也可激活ERK5表达[5-6]。在脑缺血和缺血再灌时,ERK5在堵塞的大脑