利用Caco-2和THP-1共培养模式分析卡拉胶的致炎作用【开题报告】

毕业论文开题报告生物技术利用Caco-2和THP-1共培养模式分析卡拉胶的致炎作用一、选题的背景与意义：卡拉胶（也称鹿角藻胶或鹿角菜胶，英文名Carrageen）是存在于海洋红藻纲的麒麟菜属、角叉菜属、杉藻属和沙菜属等细胞壁中硫酸多糖，因硫酸基团和内醚键位置不同，现已分为七种类型卡拉胶：κ-、λ-、ι-、µ-、θ-、ξ-和ν-型，其中κ-、λ-和ι-卡拉胶的应用最为广泛。

它具有独特的生物学性质，可以制成亲水胶体、凝胶、增稠、乳化、成膜、稳定分散剂等，因此受到食品、日用化工和医药等行业的青睐。

近年来，我国已将卡拉胶列入食品添加剂目录，且它也已列入联合国粮农组织和世界卫生组织食用标准用量说明书，其应用前景非常广阔。

但是，有研究表明卡拉胶可以引起动物的致炎致癌反应，并能促进结肠上皮细胞产生炎症因子。

但由于卡拉胶的致炎机制尚不确定，导致它的使用安全性在国际上存在很大争议。

本试验利用Caco-2和THP-1细胞体外共培养模式，作为肠道炎症研究的细胞模型的基础上，通过ELISA试验检测免疫因子的分泌变化，初步判断能引起免疫反应的卡拉胶的在体内发挥免疫反应的过程。

阐明这类物质的使用限度及非安全性来源。

研究领域将成为目前国际上关于卡拉胶的致炎模型使用、食品安全评价和海洋藻类多糖应用前景的焦点。

本实验的研究结果对推动卡拉胶在食品添加剂行业的重新定位提供帮助，对确定卡拉胶在食品添加剂中的使用种类、使用剂量具有参考价值；而炎症机理的初步探索将为今后进一步研究卡拉胶致炎机理提供新的依据；同时，也给海藻寡糖或多糖在医药领域的应用提供了可开拓的空间和安全性的指导。

二、研究的基本内容与拟解决的主要问题：1、建立Caco-2和THP-1细胞共培养模型在体内肠系统中，分布着结肠上皮细胞和人巨噬细胞，当肠道受到致炎物质刺激时，首先表现为肠上皮单层细胞完整性的破坏并导致细胞因子IL-8的分泌增加，IL-8是一种强而有力的中性粒细胞趋化和活化因子，是介导由TNF-α引发炎症的主要因子。

在炎症因子IL-8的刺激下巨噬细胞分泌TNF-α增加，TNF-α可诱导结肠上皮细胞凋亡及增加炎症因子表达的作用，从而进一步引发肠道的炎症反应；当在TNF-α抗体或消炎药物的作用下，检测到IL-8和TNF-α的分泌受到抑制。

本研究利用Caco-2和THP-1细胞共培养模型模仿在体内的肠道炎症，用来研究卡拉胶的致炎作用。

2、以炎症相关因子——肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素-8(IL-8)的产生和变化为指标，细胞经不同卡拉胶处理后：1）利用ELISA试验（酶联免疫吸附试验)定量检测THP-1细胞分泌TNF-α因子的能力和Caco-2细胞分泌IL-8因子的能力；2）综合分析不同结构的卡拉胶处理后，各因子的变化，评判其致炎机理。

3、拟解决的主要问题：卡拉胶致炎作用的方式三、研究的方法与技术路线：（一）研究方法1. Caco-2和THP-1细胞共培养模型在millicell上培养Caco-2细胞，是Caco-2细胞生长成片，形成致密的膜状结构。

下层细胞培养板上培养THP-1细胞。

构建成如下模型：空白对照组：上层millicell上培养Caco-2细胞，下层细胞培养板上饲养THP-1细胞，不用卡拉胶样品处理，用ELISA检测上层细胞分泌IL-8的情况和下层细胞分泌TNF-α的情况；实验组：上层millicell上培养Caco-2细胞，下层细胞培养板上饲养THP-1细胞。

用卡拉胶样品处理上层Caco-2，用ELISA检测上层细胞分泌IL-8的情况和下层细胞分泌TNF-α的情况；阴性对照组：上层millicell上培养Caco-2细胞，下层细胞培养板上没有细胞，用卡拉胶样品处理上层Caco-2，用ELISA检测上层细胞分泌IL-8的情况。

2.用共培养模型分析卡拉胶致炎作用：以各炎症相关因子的产生和变化为指标，细胞经不同卡拉胶处理后：1）以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养液中肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素-8(IL-8)来检测THP-1和Caco-2细胞分泌因子的能力；2）综合分析不同结构的卡拉胶处理后，各因子的变化，评判其致炎情况；3）确定易引起炎症损伤的卡拉胶的致炎方式。

（二）技术路线四、研究的总体安排与进度：2010年11月到2011年01月：查阅文献、资料，准备实验中要用的材料和仪器。

2011年01月到2011年02月：进行实验和外文文献的翻译。

2011年02月到2011年04月：完成毕业论文。

2011年05月：准备毕业论文答辩。

五、主要参考文献：[1] 周革非, 邢荣莲, 孙利芹,等. 不同分子量的角叉菜( Chondrus ocellatus ) λ-卡拉胶的抗氧化活性术[J]. 海洋与湖沼, 2009, 5(40): 545-549.[2] 何新益, 殷七荣, 张兴全. 卡拉胶的特性与应用[J].食品工业, 2002, 3:30-31.卡拉胶样品 ELISA 检测上层细胞分泌IL-8的情况和下层细胞分泌TNF-α的情况Caco-2和THP-1细胞共培养模型 引起炎症损伤的机理细胞毒检测 统计分析[3] 周卫国, 王文智. 卡拉胶的生产及应用[C].学术交流论文, 2006, 3: 162-164.[4] 胡亚芹, 竺美. 卡拉胶及其结构研究进展[J]. 海洋湖沼通报, 2005, 1: 95-103.[5] 袁华茂. 卡拉胶寡糖与衍生物的制备及生物活性研究[C]. 中国科学院海洋研究所, 博士论文,2005.[6] 徐强, 管华诗. 卡拉胶研究的发展及现状[J]. 青岛海洋大学学报, 1995, S1; 117-124.[7] 尚一平. 卡拉胶的性能及其在肉类工业中的应用[J]. 肉类工业, 2006, 12:31-32.[8] 梁国珍, 陈文谱. 卡拉胶特性及其在乳制品加工中的应用[J]. 怀化学院学报,2008, 2:53-55.[9] Aritoft, D.Ipsen, R.;Madsen, F.;et al. Interaction between carrageenans and milk proteins: Amicrostructural and Rheological Study. Biomacromo lecules[J]. 2007,8:729-736.[10] Izydorczyk,M.;Cui,S.W.;Wang,Q.Polysaccharides Gums:Structures,Functional Properties, a -ndApplication,In FOOD CARBOHYDRATES[M]. First ditioned,Cui,S.W,Ed; Taylor&Francis: New Tork,2006263-299.[11] 杨玉玲, 周光宏, 姜攀,等. 卡拉胶凝胶质构特胜的研究[J]. 食品工业科技, 2008, 10:220-223.[12] BeMiller,J.N.andWhistler,R.N.carbohydrate,In food chemistry[M].3rd ed.;Fennema,O.R.,Ed, Marcel Dekker,Inc: New York,1996;211-255.[13] 陶慧娜, 孙涛.卡拉胶及其衍生物的生物活性研究进展[A].安徽农业学,2008,19:7967-7968.[14] 王长云, 管华诗. 多糖抗病毒作用研究进展Ⅲ卡拉胶及其抗病毒作用[J].生物工程进展,2000,3:39-42,48[15] CHENG A C，CHEN Y Y，CHEN J C．Dietary adminisration of sodium alginate and K-eamageenanenhances the innate immune response of brown-marbled grouper Epinephelus fuscoguttatus and resistance against Vibrio alginolyticus[J].Veterinary Immunology and Immunopathology,2008,121:206-215.[16] 中华人民共和国国家标准.食品添加剂一卡拉胶[M].北京:中国标准出版社.1994[17] 吴剑锋, 吴晖,吴涛等. 几种亲水性胶体凝胶特性研究[J].广州食品工业科技.2004,4:4-6.[18] 黄来发. 食品增稠剂[M].北京;中国轻工业出版社,2000,70:83-84.[19] 胡坤, 赵谋明. 物理作用力对κ-卡拉胶凝胶体质构特性影响的研究[J].食品与发酵工业,2003,2:56-58.[20] 浮吟梅,王林山.卡拉胶在食品工业中的应用[A].开发应用中国食品添加剂,2009,4:160-162.[21] 胡茵, 黄宏光, 韦曲颖. 卡拉胶在彩条牙膏中的试验与研究[J]. 牙膏工业, 2006, 1: 32-34.[22] 宁发子, 何新益, 殷七荣等. 卡拉胶的特性与食品应用[J]. 食品科技, 2002, 3: 36-38.[23] 孟凡玲, 罗亮, 宁辉等. κ-卡拉胶研究进展[J]. 高分子通报, 2003, 10: 49-56.[24] 周皓. 5种酶制剂对κ-卡拉胶降解作用的研究[J]. 饮料工业, 2001, 5: 24-27.[25] Wilcox D K, Higgins J, Bertram T A. Colonic epithelial cell proliferation in a rat model ofnongenotoxin-induced colonic neoplasia. Lab Invest, 1992, 67: 405–411.[26] Calvert R J, Reicks M. Alterations in colonic thymidine kinase enzyme activity induced byconsumption of various dietary fibers. Proc Soc Exp Biol Med, 1988, 189: 45–51.[27] Arakawa S, Okumua M, Yamada S, et al. Enhancing effect of carrageenan on the induction of ratcolonic tumors by 1,2-dimethylhydrazine and its relation to β-glucuronidase activities in feces and other tissues. Nutr Sci Vitaminol (Tokyo), 1986, 32: 481–485.[28] 陈方. 小分子量硫酸多糖κ-卡拉胶衍生物的制备及抗流感病毒活性研究[C]. 福州大学, 硕士论文,2006.[29] Marcus S N, Marcus A J, Marcus R, et al. The pre-ulcerative phase of carrageenan-induced coloniculceration in the guinea-pig. Int J Exp Pathol, 1992, 73: 515–526.[30] Kitsukawa Y, Saito H, Suzuki Y, et al. Effect of ingestion of eicosapentaenoic acid ethyl ester oncarrageenan-induced colitis in guinea pigs. Gastroenterology, 1992, 102: 1859–1866.[31] Zhou G. F, Xin H, Sheng W X, et al. In vivo growth-inhibition of S180 tumor by mixture of 5-Fu andlow molecular λ-carrageenan from Chondrus ocellatus. Pharmacological Research, 2005, 51: 153-157.[32] 陈海敏, 严小军, 王峰等. 不同聚合度的卡拉胶降解物对人结肠上皮细胞的影响[J].中国食品学报,2009, 1:89-93.。