地鳖虫活性蛋白对人舌癌细胞Tea 8113的抑制作用

地鳖虫活性蛋白对人舌癌细胞Tea-8113

的抑制作用

（作者：________ 单位：___________ 邮编：____________ ）

【摘要】目的研究地鳖虫蛋白对人舌癌细胞Tea-8113增殖的抑制作用，探索地鳖虫蛋白质的抗肿瘤活性。方法采用MTT法测定地鳖虫蛋白质对人舌癌细胞Tea-8113增殖的抑制效果。结果地鳖虫蛋白质在体外能显著抑制人舌癌细胞Tea-8113的增殖，药物浓度0.0902 g • ml-1，药物作用72 h抑制率最高，达到92.96 %，并呈现明显的药物剂量依赖关系。结论地鳖虫蛋白质有较强的体外抗肿瘤活性。【关键词】地鳖虫活性蛋白Tea-8113细胞MTT法抗肿瘤活性Abstract : ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of

protein of Eupolyphaga on human tongue cancer cell line

Tea-8113.MethodsThe MTT assay was used to examine the proliferatio n in hibitory activity.ResultsThe protein of Eupolyphaga had obvious an ti-proliferati on activity on Tea-8113 in vitro in concentration and time dependent manners,

% for 0.0902 g/ml and 72

the inhibition rate was up to 92.96

hours.C on clusi on The prote in of Eupolyphaga has an obvious

inhibitory effect on the proliferation of Tea-8113 in vitro.

Key words: Protein of Eupolyphaga; Tea-8113 cell line ; MTT assay; Antineoplasmic activity

地鳖虫Eupolyphaga sinensis Walker 又名土元，土鳖，是《中国药典》记载的正品动物类药材，具有破瘀血、续筋骨、消肿止痛等药用功效［1］，临床主要用于治疗淤血阻滞，癥瘕积聚，跌扑损伤等症。中医处方亦用其治疗肿瘤，目前将其用于治疗消化道肿瘤的较为普遍］2］。本实验室前期工作已证实地鳖虫提取物（Extract from Eupolyphaga sinensis Walker ，EES 对肿瘤细胞有显著的细胞毒

性作用［3］。为了深入探讨EES的抑瘤作用，本文以新鲜地鳖为原料,采用硫酸铵分段盐析,离子交换和SDS-PAG电泳分析等方法，分离得到地鳖蛋白，探讨该蛋白质对舌癌Tea-8113细胞生长、增殖

的影响，为EES抗肿瘤临床应用及其作用机制的深入研究提供实验依

据。

1材料与仪器

1.1细胞株人舌癌Tea-8113细胞株由中山大学附属肿瘤医院细胞库提供，用含10%小牛血清、100U /ml青霉素和100 U /ml链霉素的

RPMI1640培养基，37C，5%CO2培养箱中，完全饱和湿度条件下培养，3〜4 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

1.2药物及试剂地鳖虫成虫（雌性）购自广州市花鸟市场，由广东工业

大学生药研究室鉴定。RPMI1640培养液、小牛血清均为美国

GIBC O公司产品，MTT（噻唑兰）、二甲基亚砜、胰蛋白酶均为美国AMRESC公司产品，超纯水自制，其余试剂均用国产分析纯。常规培养。

1.3仪器CO2培养箱为美国SHELLAB公司产品，倒置显微镜购自重庆奥特光学公司，超净工作台为苏净集团产品，680型酶标仪购自美国BIO-RAD公司。

2方法

2.1地鳖虫活性蛋白质（EES的制备取200 g新鲜地鳖虫剪碎，加

入200 ml预冷的0.01 mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.4）,匀浆，再加300 ml上述缓冲液，4C浸提过夜，4 000 r/min 离心20 min，弃沉淀，上清用sevag法提取蛋白质，收集40%- 65腕和度盐析组分］4］，透析除盐，层析分离并收集蛋白质组分，洗脱液为含 1.0 mol/L NaCl 的0.02 mol/L pH8.0 Tris-HCl 缓冲液梯度洗脱，恒流泵流速为40，

10 min收集1管。分别收集各蛋白峰液体，真空冷冻将蛋白质制成粉末备用。

2.2 SDS-PAGE电泳［5］采用SDS-PAG法分析制备蛋白质组成。浓

缩胶浓度5%分离胶浓度12%，考马斯亮蓝G- 250染色，甲醇/冰乙酸脱色。由低标准蛋白质绘制标准曲线，测定测试样品的迁移距离，计算相对迁移率（mR），由标准曲线求得测试样品的分子量。

2.3地鳖虫活性蛋白对人舌癌Tea-8113细胞的体外抑制作用（MTT 法）［6］用0.25%胰蛋白酶消化贴壁生长的Tea-8113细胞，将5.0 X

104/ml细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔100卩l，培养15 h 细胞贴壁后，分别加入PBS阴性对照）以及终质量浓度（0.010 1 ,

0.030 2，0.050 1，0.070 2 和0.090 2 g/ml ）的EES各20 卩I , 每组均设4个复孔。置饱和湿度、37C、5%CO培养箱中培养24,48, 72 h,结束前4〜6 h各培养孔分别加入5mg/ml MTT 20卩I,继续培养4 h，弃培养上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO200卩l溶解液，用酶联免疫检测仪检测各孔吸光度（A）值，测定波长为490 nm, 用不含细胞培养液而同样作其他处理组作本底，校正测量值，取4孔A 值平均数,按以下公式计算抑制舌癌细胞的生长抑制率。

细胞增殖抑制率（％）= : 1-（OD实验组-OD空白组）/（OD对照组-OD

空白组门X 100%

2.4统计学处理统计学分析采用SPSS10.0软件，结果以士s表示。实验均重复3次。

3 结果

3.1地鳖虫活性蛋白质（EES的分离纯化地鳖虫经匀浆、盐析、透析得到EES粗提物，将该粗提物上DEAE-32纤维素离子交换柱层析，介质经预处理后装柱，柱预先用0. 05 mol/L，pH7. 8的PBS平衡，上柱后用含 1.0 mol/L NaCl 的0.02 mol/L pH 8.0 Tris-HCl 缓冲液梯度洗脱至在280 nm波长无光吸收。洗脱液出现3个蛋白峰（见图1），分别收集各峰蛋白质，经检测峰1和峰2蛋白质含量较低，峰3 蛋白质含量较高。进