HPLC外内标法测定含量
药物含量的测定方法总结
药物含量的测定方法总结药物的含量是指药物中所含主成分的量，是评价药物质量的重要指标。
药物的含量测定可分为两大类，即基于化学或物理学原理的“含量测定”和基于生物学原理的“效价测定”。
其中，效价测定法（包括生物检定法、微生物检定法、酶法）的方法建立与验证过程各具特殊性，本章将主要探讨基于化学或物理学的“含量测定”。
药物含量测定的分析方法主要包括：容量分析法（滴定法）、光谱分析法和色谱分析法。
其中，容量分析法操作简便，结果准确，方法耐用性高，当方法缺乏专属性，主要适用于对结果准确度与精密度要求较高的药品测定；光谱分析法简便快速，灵敏度高，并具有一定的准确度，但方法专属性稍差，主要适用于对灵敏度要求较高、样本量较大的分析项目；色谱分析法则具有高灵敏度与高专属性，并具有一定的准确度，但其结果计算需要对照品，本法主要使用于对方法的专属性与灵敏度要求较高的复杂样品的含量测定。
一、容量分析法容量分析法（也叫滴定法），是将已知浓度的滴定液（标准物质溶液）由滴定管滴加到被测药物的溶液中，直至滴定液中的标准物质（常称为滴定剂）与被测药物反应完全（通过适当方法指示），然后根据滴定液中滴定剂的浓度（一般称为滴定液浓度）和被消耗的体积，按化学计量关系计算出被测药物的含量。
（一）容量分析法的特点与使用范围1.容量分析法的特点（1）方法简便易行：本法所用仪器价廉易得，操作简便、快速。
（2）方法耐用性高：影响本法测定的试验条件与环境因素较少。
（3）测定结果准确：通常情况下本法的相对误差在0.2%以下，适用于对准确度要求较高的试样的分析。
（4）方法专属性差：本法对结构相近的有关物质或其他干扰测定的杂质缺乏选择性，故一般适用于主成分含量较高的试样的分析。
2.容量分析法的使用范围由于容量分析法具有以上特点，被广泛应用于化学原料药物的含量测定，而较少应用于药物制剂的含量测定。
（二）容量分析法的有关计算1.滴定度指每1ml规定浓度的滴定液所相当的被测药物的质量，《中国药典》用毫克（mg）表示。
药物的含量测定方法与验证-色谱分析法
标示量(%)=(C供×D ×V平/V ×B)×100% V平为单位制剂的标示装量 V为供试品的量取体积 B为制剂的标示量
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三、色谱分析法—GC
标准溶液加入法
t
t
C供=△CX/[（AIS/A供）-1] △CX为所加入的已知浓度的待测成分
对照品的浓度
AIS为加入对照品后组分的色谱峰面积
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二、色、光谱分析法
※原料药
含量（％）＝（C供×D/ W）×100% D—稀释体积； W—供试品取样量
※固体制剂：
标示量(%)=(C供×D ×W平/W ×B)×100% W平为单位制剂的平均重量（或装量） B为制剂的标示量
(1)色谱柱的理论板数（n) n=5.54(tR/Wh/2)2
(2)分离度: R=2(tR2-tR1)/(W1+W2) R应大于1.5
(3)重复性：同一样进5次 RSD≤2.0%
(4)拖尾因子：T=W三、色谱分析法—HPLC 3.测定法
(1)外标法 含量：
C供＝（A供/ A对） C对
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用外标法测定某胺类药物的含量。对照品溶液的制备： 精密称取对照品50.0mg，置50mL量瓶中， 加甲醇溶解并稀释至刻度，精密量取上述溶液5mL， 置25mL量瓶中，加流动相稀释至刻度。 供试品溶液的制备：取本品20片，精密称定10.034g， 研细，精密称取本品0.2034 g 置100 ml量瓶中，加流动相适量，充分振摇使溶解， 再加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取 续滤液10 ml，置50 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度， 摇匀。用0.45 µm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品 溶液。取对照品溶液和供试品溶液各10μL进样， 测得对照品溶液中，对照品的峰面积分别为1350， 供试品溶液的峰面积分别为1313。 按外标法以峰面积计算供试品中的含量
[讨论]内标法与外标法的应用
![[讨论]内标法与外标法的应用](https://img.taocdn.com/s3/m/71c318f4f5335a8103d2207b.png)
[讨论]内标法与外标法的应用内标法：选择适当的物质作为内标物质，定量加入被测样品中，跟据被测组分和内标物质的峰面积之比，乘以校正因子，对映内标物质加入量所进行含量测定方法。
内标法的优点：色谱条件对结果影响不大，准确度、精度较高；缺点：选择合适的内标物质比教困难。
外标法：又称标准曲线法，依照测量标准品所绘制的曲线来计量被测样品的含量的方法。
外标法的优点：简单，适和大量样品分析。
缺点：每次色谱条件很难相同，容易出现误差。
请问大家在做含量测定时依照什么原则来选定方法的？我们一般作体外药物分析时均采用外标法，体内药物分析，因提取步骤烦琐，都采用内标法进行校正，但如果仪器稳定、方法的重现性好，也可使用外标法，国外体内药物分析用外标法的也有不少，但本人认为最好使用内标法。
实际样品检测用外标法的更多。
原因：1.内标物难获得，特别是同位素标记的有相近行为的内标物；2.操作步骤多、计算烦琐如在新药报批中使用内标物，则需报送内标物的结构确证资料，在报生产的同时还要报送此内标物对照品。
所以现在连SDA的专家都不推荐使用内标法。
最初使用内标是因为进样器进样不准确，采用内标可以校正进样误差。
现在的HPLC用定量环进样准确度很高，加了内标有时候因为操作的误差反而降低准确度。
在药物质量检验中，如果是原料药，或者制剂的成份不很多，用外标法即可，不一定非要用内标法，而且现在越来越多的标准都放弃了用内标法。
对于体内药物分析，分析方法的误差反而不是那么的重要，而在样品处理的过程中引入的误差要引起足够的重视，所以，一般在处理过程中加入内标以校正误差。
这个时候，回收率的高低又不是绝对的要求很高，虽然要求绝对回收率在70%或者80%以上，但是，有时候低一些也无所谓，关键是回收率的稳定性，测定的重现性。
欢迎行家指点：）--------------------------------------------------------------------------------却是如此，我刚刚做完体内药物分析，内标法却是比较麻烦--------------------------------------------------------------------------------个人认为体内分析应该用内标法，否则结果不准确。
HPLC定量原理及方法
液相色谱实用技术(一) HPLC定量原理及方法液相色谱定量分析的基本原理❀在定性的基础上定量,需有纯物质作为标准物❀液相色谱定量是相对定量的方法:即由已知量的纯被测物标样推算混合物中被测物的量❀液相色谱法定量的依据是:✎被测组分的量与响应值(峰高或峰面积)成正比✎由已知量的标样可求得定量校正因子✎定量校正因子:是定量计算公式中的比例常数,其物理意义是单位响应值(峰面积)所代表的被测组分的量✎测定未知组分的响应值,通过定量校正因子即可求得其含量液相色谱定量分析的基本步骤❀开发一个适合定量分析的色谱方法:确认被检测组分峰,并达到分离度(R)大于1.5确定被测组分色谱峰的一致性确定方法的检测限及定量限;灵敏度及线性范围❀用不同浓度的标准样品建立校正曲线❀考查定量方法的准确度及精密度❀用M32色谱管理系统实施样品采集,数据处理及报告结果鉴别需定量的色谱峰(定性)❀定性鉴别每个要定量的色谱峰✎通过比较保留值(通常是保留时间)的方法,找到各色谱峰所对应的组份✎大多数情况下用与标样比较保留时间来定性❀即所谓：➀保留时间相同，可能是同样的组份➁保留时间不同，肯定不是同样的组份用保留时间定性❀用“标样”的保留值定出被测组份的位置0.000.050.100.150.200.250.300.350.400.000.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.507.00AUMinutesUracilEthylparabenPropylparaben进一步的确认(定性)❀标准加入❀同时用其他方法✎其他色谱方法（改变机理，如：用不同的色谱柱）✎其他检测器➠PDA，光谱图比较、谱库检索➠MS，质谱图解析、谱库检索✎其他仪器方法标准加入法举例❀废水样品中五氯苯（PCP）的分析梯度曲线梯度曲线PCP 4 ppm 3 ppm 2 ppm 1 ppm确认定量峰的一致性❀确认色谱峰的纯度✎保证每个色谱峰下只有一个被测的组份✎检查是否有共流出的物质（杂质）干扰❀色谱峰纯度确认的方法✎用光电二极管矩阵(PDA)检测器比较光谱图✎峰纯度鉴定,2487双波长RatioPlot✎996的纯度角理论色谱峰定性中常见问题❀鉴定色谱峰(定性)时常见问题如下:✎被鉴定峰丢失✎色谱图中出峰比预想的少✎色谱图中出峰比预想的多(鬼峰)色谱峰定性中常见问题分析❀被鉴定峰丢失✎保留时间改变✎数据处理系统中输入值不正确❀色谱图中出峰比预想的少✎样品分解✎色谱柱分辨率丧失✎用错流动相✎梯度洗脱时平衡不足(例如,过早将手动进样器扳至(Load)位置色谱峰定性中常见问题分析(续)❀色谱图中出峰比预想的多(鬼峰):✎样品分解或制样时导入了杂质✎流动相被污染,或用错流动相✎流动相中含有稳定剂或稳定剂发生变化✎前次进样的后流出物(某些RT值特大的组分)✎进样器被污染,洗针系统出问题或注射器脏✎未充分平衡进样器Loop管✎保护柱脏,色谱柱被污染,分辨率下降HPLC定量分析的常用术语(1)❀样品(Sample):含有待测物,供色谱分析的溶液❀样品类型(Sample Type)分为标样和未知两种:标样(Standard) : 浓度已知的纯品;未知样(Unknow):浓度待测的混合物❀样品量(Sample Weight):待测样品的原始称样量❀稀释度(Dilution):未知样品的稀释倍数❀组分(Componance):欲做定量分析的色谱峰,即含量未知的被测物❀组分的量(Amount):被测物质的含量(或浓度)HPLC定量分析的常用术语(2)❀积分(Integrity):由计算机对色谱峰进行峰面积测量的计算过程❀定量限:可以准确定量的样品最低量,一般要求色谱峰的S/N＞10:1❀校正曲线(Calibration Curve):组分含量对响应值的线性曲线,由已知量的标准物建立,用于测定待测物的未知含量常用的定量方法❀标准曲线法,分为外标法和内标法:❀外标法✎在液相色谱中用得最多❀内标法✎准确，但是麻烦✎在标准方法中用得最多外标法定量❀配制一系列已知浓度的标样储存标样工作标样01234增加溶质的浓度外标法定量（二）❀采集不同浓度标样的色谱图❀积分,按外标法定量计算,建立标准曲线05010015020025001,0002,0003,0004,0005,000样样样样响应值峰面积()标准曲线0.000.050.100.150.200.250.300.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00M in u t e s0.000.050.100.150.200.250.300.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00M in u te s 0.000.050.100.150.200.250.300.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00M in u t e s外标法定量（三）❀计算公式❀特点✎无需各组份都被检出、洗脱✎需要标样✎标样及样品测定的条件要一致✎进样体积要准确iX i i i X A RF C X R X C RF i i 样品响应值未知组分的浓度∶标样响应值标样浓度校正因子∶×==)()()()(内标法定量（一）❀配制一系列浓度的标样，其中加有内标样储存标样+ 储存内标样工作标样01234增加溶质的浓度内标样浓度不变内标法定量（二）❀采集不同浓度标样的色谱图❀积分,按内标法定量计算,建立标准曲线0.000.200.400.600.801.001.201.401.601.80 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00v o lts M in u te sM e th ylP a ra b e n E th y lP a ra b e n P ro p y lP a ra b e n B u ty lP a ra b e n 05010015020025001020304050样样样样标样峰面积内标样峰面积标准曲线内标法定量（三）❀计算公式：❀特点：✎无需各组份都被检出、洗脱✎需要标样，需要内标样✎结果与进样体积无关..)()()()().(s i i X i i i X A A RF C X C X R S I R RF i i 内标峰面积样品峰面积未知组分的浓度∶标样浓度标样响应值内标样响应值校正因子∶×=×=内标法定量（四）❀对内标物的要求✎化学结构与待测组分相似(同系物、异构体)✎在样品中不存在✎不与样品中组份发生任何化学反应✎保留值与待测组分接近✎浓度（响应值）与待测组分相当✎其色谱峰与其它色谱峰分离好定量分析的数据处理方法❀Millennium 32包含外标和内标法计算的程序❀处理结果自动存贮至Project 的Result 中❀M 32定量处理的程序如下:✎调用标样(Standard Standard)的色谱图,在“向导”(Wizard Wizard)的指引下建立一个处理方法(Processing Method Processing Method),将欲定量的峰填入组分表中✎在Project 的Channal 菜单中,选中欲进行定量计算的有关数据文件(按标准standard 在前,未知Unknown 在后的顺序),给标样组分表中的各组分填入Amount 值并存贮Save 之✎按动工具条中的Process 处理器,则软件自动处理并保存结果定量分析的数据处理方法(续)打开一个最低浓度的标样(类型为Standard)色谱图,建立处理方法(Processing Method)定量分析的数据处理方法(续)用建立的处理方法计算欲定量的样品定量分析的数据处理方法(续)在Project的Result标签下,观察并报告定量结果液相色谱定量的精密度❀测量的精密度好的精度不好的精度精密度的衡量❀ 测量精密度的计算)100(X%12)(X σσ=−å−=å=CV N X i X Ni X 变异系数∶标准偏差∶平均值∶液相色谱定量的准确度❀误差∶✎E = O - T➠O∶观测到的值➠T∶真值准确度的衡量❀色谱方法是相对定量方法，如不考虑损失及杂质干扰等因素，其结果同“标样”的准确程度密切相关❀一般的衡量方法是做回收率实验或不同方法之间的比较：相关系数❀相关系数：➠其中，X 及Y 分别代表不同方法的实验值及平均值åå−−−−=22)()())((Y Y X X Y Y X X r i i i i准确度的影响因素❀峰面积的测量精度(积分误差)❀校正因子的测量精度(标准曲线的r2)❀样品的稳定性和代表性,均匀性(样品是否溶于流动相)❀进样器的准确度,进样技术❀色谱方法的可靠性(保留时间的重现性)❀色谱泵的精确度（GPC的影响更大）❀检测器的灵敏度,线性范围,检测限进样技术对定量结果的影响❀固定体积定量管（loop）的进样器精度最好，其准确度取决于进样器的结构❀可变体积进样器的精度取决于操作者的技术，准确度通常更高，因为进样用的注射器结构的准确度高，操作者的技术水平也有影响，但不大❀717及2690自动进样器精确度及准确度都可达到定量管进样器的水平，因为其每一微升分27步以上。
高效液相色谱外标法含量计算注意事项
高效液相色谱外标法含量计算注意事项除鉴别和有关物质检查外，HPLC法在化学药物中的应用就是含量测定了，另外在制剂的含量均匀度、溶出度、释放度检验项目中，HPLC法也发挥着越来越重要的作用，但其本质与含量测定一样，都是准确定量的测定方法，因此，含量测定也包括含量均匀度、溶出度、释放度等定量检测项目。
HPLC法应用于含量测定时哪些需要注意的问题？外标法含量计算方式有哪些注意事项是必知的？01、HPLC法应用于含量测定时需要注意的问题在建立一个新的HPLC法含量测定方法时，方法建立以及方法学验证方案需要特别考虑下述多种因素对分析结果的影响。
（1）流动相缓冲盐的pH值流动相缓冲盐的pH值对药物的保留行为有影响，甚至会显著改变某些碱性药物的保留行为。
见下图1，当流动相中缓冲溶液的pH为3.0时，出峰顺序为利多卡因、苯甲酰胺、酮洛芬，当流动相中缓冲溶液的pH为10.0时，三种药物的出峰顺序为酮洛芬、苯甲酰胺、利多卡因二即使是梯度洗脱，流动相中缓冲溶液的pH值仍然对药物的保留行为产生影响。
(2)色谱柱色谱柱的差异也会影响药物的保留行为，即使是柱长、内径、粒径相同的色谱柱，由于填料性质的差异，药物的保留时间、峰型有时会有较大差异。
(3)流动相组成以多元维生素制剂的含量测定为例，某制剂中含有4种维生素：烟酰胺、维生素B6、维生素B2和维生素B1。
如图2所示，当流动相中己烷磺酸钠和庚烷磺酸钠的相对比例由1:1变为4:6时，不仅各组分的保留时间、峰形有变化，甚至峰3、峰4没有实现分离。
02、含量的计算方式HPLC的定量方法可以分为内标法和外标法。
在仪器发展的初期，由于进样重复性差。
为了保证测定结果的准确采用内标法较多。
随着自动进样装置的发展，进样的重复性已经足够精密，从90年代开始，大部分的内标法已经被外标法取代。
但是，在药典制剂品种中还有一定数量的HPLC含量测定方法采用内标法。
除了尚未修订以外，以前担心的进样重复性已经不是采用内标法的原因，主要是因为药品制剂含量测定中样品回收率或样品制备方法的回收率影响，供试品溶液在萃取、离心处理或其他样品溶液制备过程中不能保证样品的完全提取，以及辅料对低含量药物的吸附作用，采用内标法可避免因供试品前处理及进样体积误差对测定结果的影响。
HPLC法测定头孢克洛的含量
HPLC法测定头孢克洛的含量(讨论)2010级临床药学2班1组2010157061刘晓妍讨论:1.所用试剂的配制：填充剂：十八烷基硅胶键合硅胶流动相：磷酸二氢钾溶液-乙腈（88:12）（磷酸二氢钾13.6g加水溶解并稀释至2000ml，磷酸调pH=3.4）检测波长：254nm流动相：磷酸二氢钾-乙腈(88:12)，磷酸二氢钾的极性比乙腈的大，如果增加乙腈的比例，则流动相的极性降低，头孢克洛是易溶于极性小的物质，所以保留时间就会降低，与极性相接近的杂质就不易分开，有可能发生主成分和杂质峰的重叠。
所以流动相极性不宜太低。
2.对照品及样品的配制：对照品：精密称取对照20mg于100ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度。
样品：取本品10片，精密称定，研细精密称取适量（相当于头孢克洛0.25g）加流动相溶解并定量稀释至0.2mg/ml。
称取：应该选用减量法。
如果用加重法，就要用称量纸，在转移到容量瓶中无法保证称量纸上是否会有残留，所以无法保证所配溶液是否为准确浓度。
3.系统适应性试验：分离度：用头孢克洛对照品和头孢克洛δ-3-异构体对照品的混合液首先，测混合液的色谱；然后，测头孢克洛对照品的色谱；最后，测头孢克洛δ-3-异构体对照品的色谱。
对照三个谱图看头孢克洛对照品与异构体对照品是否存在重合，如果有重合，则分离不合格，如果不重合，在看分离度是否大于1.5，如果大于则分离度合格，如果小于则不合格，不合格要从新调节试验条件。
重复性：连续注入头孢克洛对照品3次于色谱仪计算相对标准偏差。
连续测出3次对照品的峰面积，利用峰面积计算RSD.RSD=SD/x(平均)RSD小于2%4.含量测定：测定两次样品的含量并计算精密度。
精密度：考验测量结果是否可信，操作是否可信，要做平行样，平行样{从开始操作就要保持一致，及从称取药品的时候就要一致，所以要称取两份平行样}精密度=（x1-x2）/(x1+x2)5.测定结果：标示量（%）在90.0%~110.0% 合格如果测定结果是89.9%或110.1%就要出示报告，加以说明。
HPLC、GC中的含量与纯度有什么区别
HPLC中的含量与纯度有什么区别
GC中的含量与纯度有什么区别
这里有点资料参考一下吧：（综合仪器信息网论坛的相关解答，共同了~~~）
1、“纯度一般指化合物物的分面积归一法测得面积百分比
含量使用容量分析法（滴定）或者色谱外标法、内标法紫外分光光度法等等测得的质量百分含量。
补充一点:纯度往往指扣除水份或盐份后标的物的含量.含量指单位质量的物料中标的物的百分比(%)或体积比或绝对量(如**g/L).如75%酒精的乙醇含量为总质量的75%,但其纯度与除水以外的其他杂质有关,若你用一点杂质没有的乙醇来配制,则其酒精纯度为100%;,若你用含有5%甲醇的乙醇来配制,则其酒精纯度为95%.
检测方法也有异:同样用液相色谱,面积归一法测得面积百分比是纯度,内/外标法测得的是含量.”
2、“纯度包含样品里各组分的含量（或者浓度），包括杂质的含量（或者浓度）。
含量基本上就是指主要成分的浓度。
”
3、“纯度是指：是指一种物质中除去杂质的量之后占总的量的多少
含量是指：是指一种物质中含有的物质的量”
另外，二者单位不一样，含量一般式XXmg/Kg ug/Kg；纯度就没单位，直接用xx%表示。
也可以这样理解：含量与收率应该有关，而纯度反应的是产品的质量。
含量测定
-相当于标示量%的计算公式片剂：V ×F ×T/W ×平均片重/标示量×100%针剂： V ×F ×T/W/标示量（g/ml ） ×100%-以重量/片计的计算公式：V ×F ×T/W ×平均片重=重量/片例1司可巴比妥钠胶囊含量测定：精密称取内容物0.1385g ，置碘量瓶中，加水10mL ，振摇使溶解，精密加溴滴定液（0.05mol/L ）25 mL ，再加盐酸5 mL ，立即密塞并振摇1分钟，暗处静置15分钟后，加碘化钾试液10 mL ，立即密塞，摇匀，用硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L ，F=0.992）滴定，至近终点时加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定结果用空白试验校正。
已知：样品消耗硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L ）17.05 mL ，空白试验消耗25.22mL ，每1mL 溴滴定液（0.05mol/L ）相当于13.01mg 的司可巴比妥钠。
计算本品相当于标示量的百分含量（规格0.1g ，20粒胶囊内容物重2.7506 g ）？ (p.90－生成物滴定法)司可巴比妥钠的滴定度计算1摩尔司可巴比妥钠与1摩尔溴相当T=MA ×mB ×a/b ＝260.2×0.05×1/1＝13.01mg/ml 计算：(25.22－ 17.05)× 13.01×0.992× 2.7506 /0.1385× 0.1× 1000× 20例2精密量取维生素C 注射液4mL （相当于维生素C 0.2g ），加水15mL 与丙酮2mL ，摇匀，放置5分钟，加稀醋酸4mL 与淀粉指示液1mL ，用碘滴定液(0.05mol/L)滴定至溶液显蓝色，并持续30秒钟不退。
已知：注射液规格2mL:0.1g ，消耗0.05mol/L 碘滴定液（F=1.005）22.45mL ，维生素C 的分子量为176.12，问：♦ （1）丙酮和稀醋酸分别起什么作用？C ？1摩尔维生素C 与1摩尔碘相当T ＝0.05×176.12×1/1♦ （3）求本品相当于标示量的百分含量？二、光谱分析（一）、UV 法1、标准对照法（一点法）–A样/A标= C样/C标，–样品%= A样/A标×C标×F/W×100%–F=稀释倍数–W=取样量2、百分吸收系数法（A= E1%cm×C×L）–C% = A / E1%cm–样品% = A / E1%cm ×F/W– F = 稀释倍数和浓度换算因子–W = 取样量3、标准曲线法（y=bx＋a）–由标准曲线或回归方程求出C样，再根据F，W求出样品%。
HPLC-ELSD和GC-FID测定中长链甘油三酯含量比较研究
HPLC-ELSD和GC-FID测定中长链甘油三酯含量比较研究刘蔓蔓;滕英来;汪勇;张宁;李爱军【摘要】采用间接法定量,建立了HPLC-ELSD外标法和GC-FID内标法测定中长链甘油三酯含量的方法,并对两种方法进行比较.结果表明:两种方法在各自的质量浓度范围内均具有良好的线性关系,HPLC-ELSD外标法测定辛癸酸甘油酯和大豆油的平均加标回收率分别为101.0％和99.5％,RSD分别为1.58％和1.62％,得到酯交换产物中中长链甘油三酯含量为72.8％±0.80％;GC-FID内标法测定辛癸酸甘油酯和大豆油的平均加标回收率分别为99.4％和99.6％,RSD分别为1.24％和2.03％,得到酯交换产物中中长链甘油三酯含量为72.5％±0.84％.说明两种分析方法均具有良好的精密度和重复性.HPLC-ELSD外标法的分析时间为43 min,GC-FID内标法分析时间仅需12.7 min.【期刊名称】《中国油脂》【年(卷),期】2015(040)010【总页数】5页(P78-82)【关键词】HPLC-ELSD;GC-FID;中长链甘油三酯【作者】刘蔓蔓;滕英来;汪勇;张宁;李爱军【作者单位】暨南大学食品科学与工程系,广东油脂生物炼制工程技术研究中心,广州510632;暨南大学-萨斯喀切温大学油料生物炼制与营养联合实验室,广州510632;暨南大学食品科学与工程系,广东油脂生物炼制工程技术研究中心,广州510632;暨南大学-萨斯喀切温大学油料生物炼制与营养联合实验室,广州510632;暨南大学食品科学与工程系,广东油脂生物炼制工程技术研究中心,广州510632;暨南大学-萨斯喀切温大学油料生物炼制与营养联合实验室,广州510632;暨南大学食品科学与工程系,广东油脂生物炼制工程技术研究中心,广州510632;暨南大学-萨斯喀切温大学油料生物炼制与营养联合实验室,广州510632;暨南大学食品科学与工程系,广东油脂生物炼制工程技术研究中心,广州510632;暨南大学-萨斯喀切温大学油料生物炼制与营养联合实验室,广州510632【正文语种】中文【中图分类】TS225.6;TQ646中长链甘油三酯(Medium-and long-chain triacylglycerol，MLCT)是一种同时含有中链脂肪酸(C6～C12)和长链脂肪酸(C14～C24)的结构脂质。
内标法及外标法方法、原理、优缺点
An internal standard should be used when performing MS quantitation. An appropriate internal standard will control for extraction, HPLC injection and ionization variability. In a plex matrix it is not unmon for two different standard levels in SRM integrated plots, at the lower end of the standard curve, to give nearly an identical response. It is only when an internal standard is used that the two points can be differentiated. Some researchers attempt to prepare standard curves and run samples without an internal standard and find moderate success. Often without an internal standard % RSDs of replicates can be as high as 20%. Using an internal standard the % RSDs can be brought down to approximately 2%. We run triplicates at each level of our standard curve.How do I choose an internal standard?The best internal standard is an isotopically labeled version of the molecule you want to quantify. An isotopically labeled internal standard will have a similar extraction recovery, ionization response in ESI mass spectrometry, and a similar chromatographic retention time. If you are performing non-clinical PK quantitation it may be difficult to justify such a standard since a special synthesis of an isotopically labeled standard can be expensive and time consuming. Often if you are working with medicinal chemists they will have a library of pound analogs that can be used as internal standards. These analogs were made in the evolution of the pound to be tested and will be similar to the pound to be quantified and more importantly will be slightly different by parent mass. Try to avoid using de-methylated (-14) or hydroxylated (+16) analogs as internal standards since these are the most mon mass shifts observed in naturally occuring metabolites of theparent pound. A mon internal standard is a chlorinated version of the parent molecule.A chlorinated version of the parent molecule will monly have a similar chromatographic retention time which is an important characteristic of an internal standard. We have found that one of the most important characteristics of an internal standard is that itco-elutes with the pound to be quantified.How do I use an internal standard?First of all an internal standard should be added at the beginning of the sample work-up, typically before the plasma crash or solid phase extraction. The internal standard should be added at the same level in every sample including the standards. An internal standard should give a reliable MS response. Care should be taken that the amount of the internal standard is well above the limit of quantitation but not so high as to suppress the ionization of the analyte. "How much internal standard should I add?", this is an important question. It pays to know roughly how much pound is in your sample. This can be acplished by making trial analyses of an early, middle and late time point with perhaps one or two standard points. This information will be very valuable whenbuilding an appropriate standard curve and in knowing how much internal standard to add. If you were trying to quantify samples in the range of 100 fg to 25 pg and the limit of detection was 100 fg you might add 5 to 10 pg of internal standard to every sample.A good rule of thumb is to target the internal standard to the lower 1/3 of the working standard curve. This is a range that will give a fortable response without interfering with the ionization of the analyte.--------------------------------------------------------------------------------中文：什么叫内标法?怎样选择内标物?内标法是一种间接或相对的校准方法。
制药工程专业基础实验-药物分析部分
制药工程专业基础实验《药物分析》部分氯霉素眼药水的HPLC分析一、实验目的1.学习内标法和外标法测定组分的含量。
2.了解高效液相色谱仪的结构及正确使用。
二、实验内容和要求（一）实验原理高效液相色谱是在经典液相色谱的基础上由于引入了气相色谱的理论而发展起来的。
以液体作为流动相，根据柱填料不同。
可分为吸附，分配，离子交换，凝胶渗透四种高效液相法、本实验采用ODS柱进行反相高效液相色谱。
通过本实验应掌握内标法，外标法定量的原理，方法及优缺点并加强高效液相色谱仪的操作技能训练。
内标物可以消除仪器与操作或制备样本时带来的误差，精密称取样品后，加入一定量的内标物，然后制成适当溶液进样分析。
根据样品和内标物的重量及其相应的峰面积比，求出某组分的含量。
外标法又称校正法或定量进样法。
本法要求能准确地定量进样，配制一系列已知浓度的标准液，在同一操作条件下，按同量注入色谱仪，测量其峰面积（或峰高），作峰面积（或峰高）与浓度的标准曲线.然后在相同条件下，注入同量样品溶液，测量待测组分的峰面积（或峰高），根据标准曲线，计算样品中待测组分的浓度。
氯霉素是抗生素类药物，微溶于水，且具苯环结构，所以可以用反相高效液相色谱法进行分离，并用UV254nm进行检测，甲醇-水作流动相。
三、实验主要仪器设备和材料试剂及仪器高效液相色谱仪，柱ODS柱（15cm×5mm），电子天平，100ml容量瓶，氯霉素标准品，2mg/ml对硝基苯酚（内标）标准贮备液，氯霉素眼药水样品，甲醇等。
氯霉素：广谱抗生素，原在土壤中。
1947年从南美洲委内瑞拉的委内瑞拉链霉菌中提取，1949年实现人工合成四、实验方法、步骤及结果测试（一）实验条件高效液相色谱仪柱ODS柱（15cm×5mm）流动相：内标法甲醇:水（60:40）；外标法甲醇:水（80:20）流速：0.7ml/min波长：254nm采样时间设置：5min进样量：10ul（二）标准贮备液的制备（待修改）1mg/ml氯霉素标准贮备液的配制：精密称取氯霉素100mg至100ml容量瓶中，以甲醇溶解，并稀释至刻度。
色谱分析中归一化法、外标法、内标法的区别
色谱分析中面积归一化法、外标法、内标法适用范围及优缺点简介在色谱分析中，即我们常用的高效液相色谱分析（HPLC）和气相色谱分析（GC）分析中,进行分析时,通常采用三种方法：面积归一化法、外标法、内标法.这三种方法的适用范围及各自的优缺点是什么呢？在这里简单做一介绍。
1、归一化法.即在一定分析条件下，样品经过直接溶解，过滤等操作以后，直接进分析仪器检测，得到色谱图。
通常用于粗略检查样品中的各出峰成分含量,用于定性和粗略的定量。
优点：与进样量准确度无关、与仪器和分析条件有关。
缺点：a。
在此条件之下，所有有效组分必须出峰，且所有组分必须在一个分析周期内流出色谱峰；b.定量计算必须先知道各成分的校正因子，校正因子的求出较麻烦。
2、易挥发性的油脂类化合物和混合性气体、液体，可用GC归一化法进行定量检测.例如食用油里面各成分的含量测定。
2、外标法.用待测组分的纯品作为对照物质,以对照物质和样品中待测组分的响应信号(即峰面积大小）相比较进行定量的方法。
优点：简便；只关注待测成分出峰，不需要所有成分出峰.缺点：a.必须有被测组分的纯品作为标准对照物；b.此方法准确性受进样重复性和实验条件稳定性的影响。
3、内标法。
选择样品中不含有的纯物质作为内标物加入待测样品中,以待测组分和内标物的响应信号（即峰面积大小）对比，对待测组分定量的方法。
优点:a。
是一种比较准确的定量方法；b。
定量结果与进样量重复性无关（在色谱柱不超载范围内）;c.只需要内标物与被测物出峰，达到一定的分离度即可；d。
常用于样品的GC定量检测以及微量成分含量检测；缺点：配置较麻烦；内标物需要跟待测组分在同样条件下出峰，且分离度较好，所以选择合适的内标物比较困难。
药物的含量测定方法与验证-定量分析方法的分类与特点
T=m×a/b×M=0.05×1/1×260.23 =13.01(mg/ml)
含量（％） ＝[（V0-VS）Ｂ× FB×TA ]/W×100% =[(23.21-15.73)×1.038×13.01]
×1000/0.1022 ×100% =98.8%
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二、光谱分析法
（一）紫外-可见分光光度法
可以避免样品前处理及 进样体积误差对结果的影响
28Βιβλιοθήκη 地塞米松的HPLC法测定：取本品精密称 定，质量为0.0697g，置50ml量瓶中， 加30ml乙醇溶解，用水稀释至刻度，摇 匀，精密量取5ml，置25ml量瓶中，加 0.2mg/ml甲基睾丸素液5.0ml，用流动 相稀释至刻度，摇匀，取20µl进样， 测得地塞米松的峰面积为1313，甲基睾 丸素的峰面积为1032，质量校正因子为 1.05，求其含量。
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地塞米松% =（f×AX ）/AS×Cs × D/W× 100% =（1.05×1313） /1032×0.2×250/69.7×100%
=96.8%
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三、色谱分析法—HPLC
(2)外标法 含量：
C供＝（A供/ A对） C对
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用外标法测定某胺类药物的含量。对照品溶液的制备： 精密称取对照品50.0mg，置50mL量瓶中， 加甲醇溶解并稀释至刻度，精密量取上述溶液5mL， 置25mL量瓶中，加流动相稀释至刻度。 供试品溶液的制备：精密称取供试品50.5mg， 照对照品溶液制备方法制备。 取对照品溶液和供试品溶液各10μL进样， 测得对照品溶液中，对照品的峰面积分别为1350， 供试品溶液的峰面积分别为1313。 试计算样品的百分含量
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已知：司可巴比妥钠的摩尔质量M=260.23， 司可巴比妥钠与溴反应的摩尔比为1：1； 供 试 品 的 量 W=0.1022g ， 硫 代 硫 酸 钠 滴 定液(0.1mol/L) 浓度校正因数F=1.038； 供试品滴定消耗硫代硫酸钠滴定液 15.73ml ， 空 白 试 验 消 耗 硫 代 硫 酸 钠 滴 定液23.21ml。
仪器分析实验 HPLC内标法测定原料药中对-乙酰氨基酚的含量
HPLC 内标法测定原料药中对-乙酰氨基酚的含量一、实验目的1、掌握高效液相色谱仪的使用方法2、掌握输液泵和色谱柱的使用注意事项2、掌握内标法定量的测定步骤和计算方法二、实验原理分别配制含有内标物的对准品溶液和供试品溶液，由对照品溶液中组分i 和内标物s 的A i ’和As ’计算相对校正因子f ，再由供试品溶液中待测组分i 和内标物s 的A i 和As 计算待测组分的含量，由对准品溶液求相对校正因子f ：由供试品溶液求待测组分的含量：100100(%)⨯=⨯=⇒=⇒=试样试样m A m A f m m m A A f m A A f m m s s i i i i S i i s i s i ω 三、色谱条件色谱柱：C 18柱（250mm ×4.6mm ，5μm ）；流动相：甲醇-水（60:40）；流速1ml/min ；检测器：UV 257nm ；柱温：室温；内标物：咖啡因。
四、实验步骤1、溶液配制称取对-乙酰氨基酚对照品 mg ，内标物咖啡因对照品 mg ，置50ml 容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密吸取1ml ，置10ml 容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，过0.45μm 的微孔滤膜，取滤液即得对准品溶液。
称取对-乙酰氨基酚样品 mg ，内标物咖啡因对照品 mg ，相同方法配制供试品溶液。
2、实验部分打开仪器各部电源，更换流动相，设置泵流量，排气；设置检测波长257nm ；打开工作站，设置参数，查看基线。
基线平稳后，注入对照品溶液，重复3次进样。
记录保留时间、半峰宽、峰面积等参数。
注入试样溶液，重复3次进样。
记录保留时间、半峰宽、峰面积等参数。
实验完毕关检测器电源，更换流动相，冲洗色谱柱和进样阀。
五、数据处理要求1、计算公式2、结果表格（另附）3、系统适用性试验（对-乙酰氨基酚的理论塔板数、对-乙酰氨基酚和咖啡因的分离度）六、思考与讨论题1、高效液相色谱仪的输液泵有何使用注意事项？2、高效液相色谱柱有何使用注意事项？3、HPLC 法中，外标法和内标法定量各有何优缺点？4、本实验的定量方法采用了哪种方法？内标法绘制标准曲线时，如果（Ai/As ）—Ci 直线不通过原点，能否用内标对比法（内标一点法）定量？''''''i i i i s s s s m f A A f m f A A ==⇒''''i s s i m A f m A =。
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实验步骤
配制溶液 – (1)流动相的配制。甲醇-0．5％冰乙酸水(1：1，V／V)，减压过滤并 超声波脱气。 – (2)栀子苷对照品溶液的配制。称取10．0 mg栀子苷对照品，精密称 定质量，以甲醇溶解，转移至2mL容量瓶巾(浓度为0．4 g／L)，甲 醇定容，分别精密移取0．1，0．5，1．0，2．5，5．0 mL于 10．0 m1．容量瓶中，以流动相溶液定容，得浓度为0．004， 0．02，0．04，0．1，0．2 g／L的栀子苷对照品溶液。 – (3)栀子供试品溶液的配制。取本品粉末0．1 g，精密称定，置具塞 锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理20 min， 放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。 平行处理3份。
实验步骤
配制溶液 (1)流动相的配制。乙腈一0．1％磷酸水(20：80，V／V)，减压过滤并超 声波脱气。 (2)对照品溶液的配制。分别称取40 mg扑热息痛和50 mg阿司匹林，精密 称定质量，于10 mL容量瓶中，加少量甲醇超声溶解，甲醇定容，即得 4．0 g／L的扑热息痛、5．0 g／L的阿司匹林的混合对照品溶液A。称取 50 mg的咖啡因，精密称定质量，于10 mL容量瓶中，加少量甲醇超声溶 解，甲醇定容，即得5．0 g／L的咖啡因内标溶液B。分别精密移取0．1， 0．5，1．0，2．5，5．0 mL的混合对照品溶液A和1．0 mL的咖啡因内 标溶液B于25．0 mL容量瓶中，溶解，混匀，以甲醇定容，即得浓度分别 为0．016，0．08，0．16，0．4，0．8 g／L扑热息痛和0．02，0．10， 0．20，0．50，1．0 g／L阿司匹林、内标物咖啡因浓度为0．2 g／L的5 种混合对照品溶液。 (3)供试品溶液的配制。精密移取待测样品溶液5 mL和1．0 mL的B于25 mL的容量瓶中，溶解，混匀，以甲醇定容，并平行处理3份。
实验结果
实验结果
实验结果
未知溶液中阿司匹林和扑热息痛的浓度测定 采用进样器吸取供试品溶液10uL，进样，记录阿司匹林、咖啡因和扑 热息痛色谱峰面积(保留时间、峰面积)，计算阿司匹林和扑热息痛对照品峰 面积与内标物咖啡因峰面积之比，并计算未知溶液中阿司匹林和扑热息痛 的浓度，结果见表5，6
结果
实验结果
实验结果
实验结果
栀子药材中栀子苷的含量测定采用进样器吸取栀子样品溶液10“L，进样， 记录栀子苷色谱峰面积(保留时间、峰面积)，并计算栀子药材中栀子苷 的含量。实验结果表明，栀子药材中栀子苷的含量为3．01％
采用HPLC内标法测定待测溶液中扑热息 痛和阿司匹林的含量
测定
(1)安装C18反相柱，按仪器操作说明依次打开色谱仪各单元的电源。 (2)色谱条件。C18一ODS色谱柱(53um，4．6 mm×250 mm)；流动相 比例：甲醇-0．5％冰乙酸水(1：1)；流动相流速：1．0 mL／min；检 测波长：238 nm。 (3)换卜流动相，待基线稳定后，采用进样器依次吸取浓度分别为 0．004，0．02，O．04，0．1，0．2，0．4 g／L的栀子苷对照品溶 液各10仙L进样，待组分色谱峰出完后，按“停止”键停止分析。记录 栀子苷色谱峰面积(保留时间、峰面积)，以栀子苷进样浓度(g／L)为横 坐标，色谱峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，进行回归分析。 (4)采用进样器吸取栀子样品溶液10¨L，进样，通过保留时间确定栀子 苷色谱峰的位置，记录栀子苷色谱峰面积(保留时间、峰面积)，并计算 栀子药材中栀子苷的含安装C18。反相柱，按仪器操作说明依次打开色谱仪各单元的电源。 (2)色谱条件：C18一ODS色谱柱(5um，4．6 mm×250 mm)；流动相 比例：乙腈一0．1％磷酸水(20：80，V／V)；流动相流速：1．0 mL／ min；检测波长：273 nm。 (3)换上流动相，待基线稳定后，采用进样器依次吸取浓度分别为 0．016、0．08、0．16、0．4、0．8 g／L扑热息痛和0．02、0．10、 0．20、0．50、1．0 g／L阿司匹林、内标物咖啡因浓度为0．2 g／L的 5种混合对照品溶液各10uL进样，待组分色谱峰出完后，按“停止”键 停止分析。记录各色谱峰面积(保留时间、峰面积)，以对照品峰面积与 内标物峰面积之比为纵坐标(y)，以浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线，进 行回归分析，求扑热息痛和阿司匹林的线性方程。 (4)采用进样器吸取供试品溶液10uL，进样，通过保留时间确定扑热息 痛、阿司匹林、咖啡因色谱峰的位置，记录扑热息痛、阿司匹林、咖啡 因色谱峰面积(保留时间、峰面积)，并计算待测样品溶液中扑热息痛、 阿司匹林的含量。
仪器与试剂 Aglient l 100 series HPLC(VWD检测器、四元恒流泵、在线脱气 机、手动进样器)，美国安捷伦公司； SB3200超声波清洗器，宁波新芝生物科技公司。 扑热息痛(CP，含量>98％)，国药集团化学试剂有限公司； 阿司匹林(CP，含量>98％)，国药集团化学试剂有限公司； 咖啡因(CP，含量>98％)，ALFAAESAR，A JOHNSON MATTHEY COMPANY；甲醇、乙腈为色谱纯，Merck公司。
采用HPLC外标法测定栀子中栀子苷的含量
仪器与试剂 Aglient 1100 series HPLC仪(包括VWD检测器、 四元恒流泵、在线脱气机、手动进样器)，美国安捷伦 公司；SB3200超声波清洗器，宁波新芝生物科技公司。 栀子苷对照品：中国药品生物制品检定所，供含量 测定用；甲醇、乙腈为色谱纯，Merck公司；栀子药材； 其他试剂均为分析纯。