RP—HPLC法测定复方甘草酸单铵注射液中甘草酸单铵的含量

RP—HPLC法测定复方甘草酸单铵注射液中甘草酸单铵的含量目的建立RP-HPLC法测定复方甘草酸单铵注射液中甘草酸单铵含量的方
法。

方法色谱柱：Waters C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）；流动相：乙腈-水（35∶65），用H3PO4调pH值为3.0；柱温：25 ℃；流速：1.0 ml/min；检测波长：252 nm；进样体积：20 μl。

结果甘草酸单铵线性范围：0.16048～3.2096 μg （r=0.9999，n=5）；甘草酸单铵加样回收率平均值为99.4%（RSD=0.72%，n=9）。

结论该方法灵敏、专属性强、准确、重现性好，可用于复方甘草酸单铵注射液中甘草酸单铵的含量测定。

[Abstract] Objective To establish a method for the determination of ammonium glycyrrhetate in compound ammonium glycyrrhetate injection by RP-HPLC. Methods The determination was performed on a Waters C18 column（5 μm，4.6 mm×150 mm）with the mobile phase consisted acetonitrile：water（35∶65，adjusted to pH 3.0 with phosphoric acid）.The column temperature was 25 ℃.The flow rate was 1.0 ml/min.The detective wavelength was 252 nm.The injection volume was 20 μl. Results The liner range of ammonium glycyrrhetate was 0.16048-3.2096 μg （r=0.9999，n=5）.The average recovery was 99.4%（RSD=0.72%，n=9）for the added amount of ammonium glycyrrhetate. Conclusion This method is sensitive，specific，accurate and reproducible.It can be used for determination of ammonium glycyrrhetate in compound ammonium glycyrrhetate injection.
[Key words] RP-HPLC；Compound ammonium glycyrrhetate injection；Content determination
复方甘草酸单铵注射液为甘草酸单铵、盐酸半胱氨酸、甘氨酸的灭菌水溶液，适用于急、慢性肝炎引起的肝功能异常；对中毒性肝炎有一定的辅助治疗作用；亦可用于食物中毒、药物中毒、药物过敏等[1]，其现行标准为国家药品监督管理局国家药品标准WS-10001-（HD-0347）-2002，采用紫外分光光度法（吸收系数法）测定甘草酸单铵的含量[2]，专属性不强，本文建立了反相高效液相色谱法[3-18]测定复方甘草酸单铵注射液中甘草酸单铵的含量，方法专属性强，重现性好，结果准确，可用于复方甘草酸单铵注射液中甘草酸单铵的含量测定。

1 仪器与试剂
Waters e2695-2489型高效液相色谱仪；甘草酸单铵对照品（中国食品药品检定研究院，批号：Y0000433；复方甘草酸单铵注射液（江苏正大天晴药业股份有限公司，批号：20140217、20140321、20131203）；乙腈：色谱纯；磷酸：分析纯。

2 方法与结果
2.1 系统适用性
色谱柱：Waters C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）；流动相：乙腈-水（35∶65），用H3PO4调pH值为3.0；柱温：25 ℃；流速：1.0 ml/min；检测波长：252 nm；进样体积：20 μl。

在此色谱条件下，理论塔板数以甘草酸单铵峰计：4500；拖尾因子：1.01；甘草酸单铵与相邻杂质峰的分离度均符合要求。

2.2 制备溶液
精称甘草酸单铵对照品40.12 mg，加水溶解并稀释至50 ml，摇匀，作为对照品储备液；精取对照品储备液5 ml，加水稀释至50 ml，摇匀，作为对照品溶液；取供试品，制备40 μg/ml供试品溶液。

2.3 专属性
取复方甘草酸单铵注射液适量（约相当于甘草酸单铵 4 mg），分别经 1.0 mol/L盐酸、1.0 mol/L氢氧化钠、强热（160 ℃，1 h）、氧化（30%过氧化氢）得各破坏产物，制备溶液，进样，由色谱图得知甘草酸单铵与各降解产物分离良好，专属性强（图1）。

时间（min）
A时间（min）
B
时间（min）
C
时间（min）
D
图1 专属性色谱图
A.酸破坏；
B.碱破坏；
C.热破坏；
D.氧化破坏
2.4 标准曲线制备
精取对照品储备液1、2、5、10、20 ml，分别加水稀释至置50 ml，摇匀，进样。

以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，作回归曲线：Y=13423.19X-7067.18，r=0.9999（n=5），表明甘草酸单铵在0.16048～3.2096 μg范围内与峰面积有良好线性关系。

2.5 精密度
精取对照品溶液20 μl进样，测定峰面积，重复进样5次，计算峰面积的RSD=0.76%，说明仪器精密度符合要求。

2.6 稳定性
取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10 h测定峰面积，RSD=0.65%（n=5），说明供试品溶液在12 h内稳定。

2.7 重现性
取同一样品（批号：20140217），制备供试品溶液5份，测定含量，平均值=98.0%，RSD=0.78%，说明重现性符合要求。

2.8 加样回收率
精取样品（批号：20140217，含量98.9%）适量各9份，每三份一组，每组精密加入对照品贮备液3、5、7 ml，制备低、中、高（80%、100%、120%）3个浓度的溶液，测定加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率测定结果（n=9）
2.9 样品含量测定
取对照品溶液及供试品溶液，依法测定，按外标法计算，测定结果见表2。

表2 样品测定结果
3 讨论
检测波长的选择：以流动相为溶剂，用岛津UV-2550紫外分光光度计测定，甘草酸单铵在252 nm波长处有最大吸收，故选定在此波长处测定含量，方法灵敏。

流动相的确定：本法流动相是乙腈-水（35∶65），用H3PO4调pH值为3.0，不含缓冲盐，对色谱系统的损害程度较小，且峰型对称（拖尾因子为1.01）。

流动相的选择符合《中国药典》2010年版二部附录新增要求尽可能少用含有缓冲液流动相的原则。

本法具有较宽的线性范围和较高的回收率，结果简便、可靠准确。

通过专属性实验可以得出，甘草酸单铵主峰能与各种条件破坏后的降解产物峰良好分离，专属性强，可以作为复方甘草酸单铵注射液含量测定的方法。

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