神经生物学实验 - HRP神经束路追踪

HRP的特性：
HRP是是从辣根中提取出来的一组同 功酶的混合物，为糖蛋白，含有其组 织化学活动所必需的正铁血红素族， 在H2O2作用下催化某些化合物（成色 原）而氧化产生可见的反应物。
分子量为40，000道尓顿，分子半径 ห้องสมุดไป่ตู้为3.0nm。
HRP的细胞外给药法：
加压注射法 微量注射器或微玻管注射，常用。
离子透入注射法 离子透入技术是以负载电荷的化学 分子或示踪剂注入组织的方法。
HRP的结合与扩散:
终末摄取
电镜显示，注入HRP后，依次出现于胞 饮小泡、膜性囊和小管以及多泡体和致 密体内。较长时间后， HRP从这些成分 中消失，说明这些细胞器与示踪剂的结 合、存储及溶酶体降解有关。
由神经终末摄取的HRP直接与它的突触 活动有关。
神经束路追踪技术
－辣根过氧化物酶法
神经束路追踪技术是利用神经元轴 浆运输（axoplasmic transport） 现象的示（追）踪法，主要用于研 究神经元间广泛的神经纤维联系。
轴浆运输包括从胞体向轴突及其终 末的顺行运输和从轴突及其终末向 胞体的逆行运输。
神经束路追踪法主要有辣根过氧化 物酶示踪技术、荧光素示踪技术、 同位素示踪技术及顺行示踪技术等。
冰箱过夜。
６.切片：待脊髓在蔗糖液中沉底后，标本 以磷酸缓冲液略洗，冷冻切片机冠状切 脊髓，厚15-20um，贴于多聚赖氨酸载玻 片上，回至室温凉或烘干 。
７.后固定：切片入丙酮溶液固定10min， 蒸馏水冲洗2－3次，每次2－3min。
８.预浸：入20℃预孵育液，在避光条件下， 恒温孵育20 min 。
轴索摄取
轴索暂时受损（如注射区）或经 挤压与切断而受到严重损伤时，即 可摄取HRP并填充于损伤处的远端和 近端。
逆行性轴索输送
通过细胞器经轴索逆行运输到神 经元胞体，与微管的完整性有关。
胞体摄取与顺行性轴索输送
神经元胞体直接摄取HRP的现象几 乎发生于注射区或其附近，或在高 浓度HRP处的神经元。
实验步骤：
麻醉动物 导入HRP 动物存活 灌注固定 取材 切片 组织化学反应 显微镜观察
1.麻醉大鼠：2%戊巴比妥（40mg/kg)腹
腔注射。麻醉不宜过深，以免苏醒过慢， 影响HRP被神经元摄取及在其内的运输。
2.注入HRP：动物麻醉后，分离坐骨神经，
用微量注射器将1%CB-HRP(霍乱原B亚单 位结合辣根过氧化物酶）2.5ul
10.清洗：反应结束用0.05mol/lPB洗 4-6次，每次2-3min。
11.复染：切片经苏木素短时复染。
12.封片：切片经蒸馏水漂洗30s，再 用70%、80%、95%酒精逐级脱水各 1min，二甲苯透明两次，共4-10min， 树胶封片。
13.镜检：光镜下观察染色结果。
注意事项：
1. HRP运输到预定部位的时间取决于传送速 度及距离。传送速度因动物的种类及纤维 系统而有不同，故每组实验必须具体试验 以求最佳动物存活期，一般2～3天比较合 适。而时间过长，HRP可被胞体内的溶酶体 逐渐破坏水解。
HRP示踪的常用方法（TMB法）
基本原理：
神经组织的冰冻切片或振动切片在 含H2O2的TMB（四甲基联苯胺)溶液 中孵育，组织内之HRP与H2O2结合成 （HRP-H2O2）络合物，此络合物可 氧化供氢的TMB，使之形成深兰色沉 淀物，沉积在HRP周围。
TMB法特点：
灵敏度高，产物在光镜下易观察，于 明视野下颗粒呈蓝至深蓝色，暗视野 呈金色；不宜电镜检查。改良TMB法可 避免其缺点（反应产物过度的结晶形 成、反应的不稳定性、易褪色消失 等）。
左心室-主动脉插管，灌注温的（37℃） 生理盐水冲洗血液至液体清亮，约100 ml。 再灌注冷的固定液（1%多聚甲醛 和1.25%戊二醛的0.1mol/l磷酸盐缓冲 液，PH7.4， 4°C)，约500ml ,30分 钟。灌注后用含10%蔗糖的0.1mol/l PBS100ml冲洗。
５.取材：取脊髓，切成小块，放入含25% 蔗糖的0.1mol/l PBS（ PH7.4）于4℃
HRP法是基于神经元轴浆运输的生理 现象，即将HRP注射至中枢神经系 统或周围神经的一定部位，HRP可被 神经末梢以胞饮的方式摄入，逆行 运送至胞体，经过一定时间后取相 应的部位固定、切片，然后用组织
化学方法显示HRP的标记。
该方法的问世，得到神经科学界 的 高 度 评 价 。 它 结 束 了 自 Marchi （1886年）开始长达近一个世纪 的唯一用银染法追踪选择性溃变 纤维的年代，在神经束路及其功 能的研究中具有划时代的意义。
目前较常应用辣根过氧化物酶法进 行神经束路追踪，本章对其作重点
介绍。
1971年Kristenson 和Olsson 首先报道 HRP可被神经末梢摄取，经逆行轴浆运 输至神经元胞体后，可用组织化学方 法显示胞体的位置，从而创建了辣根 过 氧 化 物 酶 （ horseradish peroxidase, HRP）追踪神经元法。
HRP输送到细胞体的命运
HRP标记的微管、小囊和小泡被运 送到胞体并积聚于核周质高尔基复合 体附近，即互相融合成较大的结构 （如溶酶体），最后全细胞及树突都 为HRP溶酶体所充满。
早在HRP被输送到胞体的前三天， 由于溶酶体降解作用而使HRP含量显著 减少，在4-8天大部分溶酶体内已无 HRP。
预孵育液：500mg钨酸钠溶解在23.5ml
蒸馏水中，过滤，后加入0.2mol/l的 PBS25ml及1NHCL0.75ml，搅拌混匀，呈色 反应前加 TMB液(TMB3.5mg用0.25ml丙酮 溶解后，加0.5ml无水乙醇）。
９.呈色反应：呈色开始时，于反应液中 加入 0.3%H2O2 0.35ml，以后每 10min 加0.35ml 在避光条件下反应， 历时1小时。
缓慢注入坐骨神经。注射后原位留针 10min，缝合切口，将大鼠置于原环境 中继续存活。
3.存活期：指HRP注入后，动物需存活一
段时间，以利于HRP的摄取、运输及积 累。存活期的长短依赖于运送速度、运 送距离及胞体内HRP在溶酶体的降解速 度，一般为24-72小时。
4.灌注固定：动物麻醉同前，开胸，经