血清直接胆红素测定实验设计
总结总、直接胆红素的检测方法
血清总胆红素和直接（结合）胆红素测定目前测定血清胆红素的方法主要有重氮试剂法（包括改良J-G法、二甲亚砜法、二氯苯重氮盐法和2，5二氯苯重氮四氟硼酸盐法等）、胆红素氧化酶法、钒酸盐氧化法、高效液相色谱法、导数分光光度法、经皮胆红素测定法以及直接分光光度法等。
改良咖啡因（J-G）法：一、实验原理血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，生成紫色的偶氮胆红素；在同样条件下，未结合胆红素须有加速剂破坏胆红素氢键后才能与重氮试剂反应。
咖啡因、苯甲酸钠作为加速剂，醋酸钠缓冲液可维持反应的PH值同时兼有加速作用。
叠氮钠破坏剩余重氮试剂，终止结合胆红素测定管的偶氮反应。
最后加入碱性酒石酸钠，在碱性条件下，紫色偶氮胆红素转变为蓝色偶氮胆红素，使最大吸光度由530nm转移到598nm，此时，非胆红素的黄色色素及其它红色与棕色色素产生的吸光度可忽略不计，使测定的灵敏度和特异性增加。
最后形成的绿色是由蓝色的碱性偶氮胆红素和咖啡因与对氨基苯磺酸之间形成的黄色色素混合而成。
二、实验方法（一）器材试管，刻度吸管，分光光度计，37℃水浴箱。
（二）试剂1．咖啡因-苯甲酸钠试剂无水醋酸钠41g，苯甲酸钠37.5g，乙二胺四乙酸二钠EDTANa2 0.5g，溶于约500mL 的蒸馏水中，再加入咖啡因25g，搅拌至完全溶解(不可加热)，然后加蒸馏水稀释至1000mL，混匀，过滤后放置棕色试剂瓶中，室温保存可稳定6个月。
2. 5g/L 亚硝酸钠溶液：亚硝酸钠5.0g，加蒸馏水溶解并稀释至100mL，若发现溶液呈淡黄色时，应丢弃重配。
3. 5g/L 对氨基苯磺酸溶液：对氨基苯磺酸（NH2C6H4SO3H·H20）5.0g，加于约800mL 蒸馏水中，加浓盐酸15mL，待完全溶解后，加蒸馏水至1000mL。
4. 重氮试剂临用前，取5g/L 亚硝酸钠溶液（试剂2）0.5mL 与5g/L 对氨基苯磺酸溶液（试剂3）20mL 混合。
5. 5g/L 叠氮钠溶液：叠氮钠0.5g，用蒸馏水溶解并稀释至100mL。
血清直接胆红素DBIL测定-检验科生化室作业书
血清直接胆红素DBIL测定1.实验原理直接胆红素与2,4-二氯苯胺重氮盐形成重氮化合物，在酸性条件下呈红色。
2.标本：2.1病人准备：无特殊要求。
最好用禁食的标本以减少乳糜血的干扰。
2.2类型：血清、肝素或EDTA血浆，应避光保存。
3.标本存放：15～25℃保存可稳定2天；2～8℃保存可稳定7天；-20℃保存可稳定3个月，如冰冻保存，不可反复冻融！。
4.标本运输：常温条件下避光保存运输。
5.标本拒收标准：标本溶血、细菌污染、脂血、非避光保存运输的标本。
6.实验材料6.1试剂：申能总胆红素试剂盒：14108271701 试剂＋试剂2 6.1.1试剂组成试剂1：16×64mlEDTA-Na20.07mmol/L氯化钠6.6g/L氨基磺酸70mmol/L试剂2：6×16ml2,4-二氯苯胺重氮盐0.09mmol/L盐酸130mmol/LEDTA-Na20.02mmol/L6.1.2试剂准备：试剂为即用式。
6.1.3试剂稳定性与贮存：试剂避光保存于2～8℃，若无污染，可稳定至失效期。
试剂有效期为18个月。
试剂2必需避光保存。
试剂不可冰冻。
6.1.4变质指示：当试剂有浊度时，表明有细菌污染，不能继续使用。
6.1.5注意事项：此试剂为体外诊断用。
警告！腐蚀剂！不要入口。
避免和眼睛，皮肤或衣服接触。
如果接触到，立即用大量的水冲洗受损害的部位15分钟。
接触到眼睛或吞服，立即寻找医疗保护。
6.2校准品：使用DiaSys公司提供的TruCalU校准品对自动分析仪进行校准，参见生化检验校准品和质控品.SOP文件6.3质控品：参见生化检验校准品和质控品.SOP文件7.仪器：奥林巴斯AU1000生化分析仪8.操作步骤8.1项目基本参数：参见生化检验奥林巴斯AU1000生化分析仪项目测定参数.SOP文件8.2仪器操作步骤：参见生化检验奥林巴斯AU1000生化分析仪操作规程.SOP文件检验结果的判断与分析10.质量控制：在每一批标本中都应把非定值血清水平I与II质控做为未知标本进行分析，以2S为质控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控。
实验六直接胆红素和总胆红素的测定
教研室 生物化学 课程 内容 生物化学检验 实验六 专业 08 检验 指导教师 徐燕 学时 3
教材 生物化学检验实验
血清直胆和总胆的测定
教 学 要 求
教 学 目 的 掌握重氮法测定直胆和总胆的原理和方法 和 要 求 重点 重氮法测定直胆和总胆的原理和方法 难点 教学 媒体 复习 旧课 学生动手操作为主，课堂演示为辅 测定直胆和总胆的临床意义 （一）原理 葡萄糖氧化酶 直接胆红素 + 无水对氨基苯磺酸 亚硝酸钠 间接胆红素 + 无水对氨基苯磺酸 二甲基亚砜 （二）仪器 分光光度计、吸量管、移液器、水浴锅 （三）操作步骤 取一次性试管做好标记，按下表操作： 蓝色偶氮胆红素 蓝色偶氮胆红素
山东医学高等专科学校生物化学实验教案教研室生物化学课程生物化学检验专业08检验指导教师教材生物化学检验实验内容实验六血清直胆和总胆的测定学时掌握重氮法测定直胆和总胆的原理和方法重点难点重氮法测定直胆和总胆的原理和方法教学媒体学生动手操作为主课堂演示为辅复习一原理直接胆红素无水对氨基苯磺酸蓝色偶氮胆红素间接胆红素无水对氨基苯磺酸蓝色偶氮胆红素二仪器分光光度计吸量管移液器水浴锅三操作步骤取一次性试管做好标记按下表操作
教 学 过 程
讲 授 新 课
加入物 工作试剂（ml） 标准液（ul1.5 100
样品管 1.5
100
混匀，37 水浴 6min，用试剂空白调零，分光光度计 578nm 处，读取标准 管和样品管的吸光度。 （四）结果与分析
CT
AT CS AS
其中 CS=20umol/L
（五）注意事项 1.胆红素特别是直接胆红素在血清中含量甚微，操作中稍许误差便使得结 果有较大出入，所以此实验要求取液准确，操作规范。 2.胆红素大于 342umol/L 的标本可减少标本用量，或用 0.154mmol/L NaCl 溶液稀释血清后重测。 讲 授 新 课 3.胆红素对光敏感，标准液及标本均应尽量避光保存。
直接胆红素(DBIL)测定标准操作程序SOP文件
PROZONE LIMIT [ 32000/UPPER ]
REACTION TIME [ 10 ]
TECHNICAL LIMIT(LOW) [ 0 ]
Measurement POINT(1) [ 16 ]
TECHNICAL LIMIT(HIGH) P或日立7060生化分析仪。
6上机操作
见仪器作业指导书。
7参考范围
0-0.3mg/dlmg/dl(0-5.13umol/l)
8性能指标
本法线性范围为0.1-20mg/dl(1.71-315umol/l)，不准确度允许范围 ±20%，不精密度CV=5.2%，灵敏度为0.1mg/dl(1.71umol/l)。
SENSITIVITY LIMIT(HIGH) [ 31 ]
R.VOLUME(R1) [ 180 ]
S1 ABS(LOW) [ -32000 ]
R.VOLUME(R2) [ 0 ]
S1 ABS(HIGH) [ 32000 ]
R.VOLUME(R3) [ 50 ]
S1:0.9%NaCl
S2:C.f.a.s
贮存条件：校准物在2-8℃保存可保存至有效期。
准备：直接使用。
定标频率：A 24小时后进行1点空白定标
B试剂换瓶后进行1点空白定标
C试剂批号更换后进行2点定标
D由质控结果决定是否进行2点定标
4.3质控物
来源：Precinorm (罗氏正常值质控)
Precipath (罗氏病理值质控)
其它适合的质控品
贮存条件：置2-8℃冰箱至有效期。
准备：直接使用。
质控间隔时间及限制：应视不同地区及各自实验室情况而定。质控结果应在限定的范围之内，如果超出范围，实验室应根据情况采取措施。
血清总胆红素测定
【思考题】 结合胆红素/总胆红素的比值测定意义？
实验原理重氮试剂1血清中结合胆红素偶氮胆红素2非结合胆红素咖啡因苯甲酸钠醋酸钠加速剂重氮试剂分子内部氢键遭到破坏偶氮胆红素紫红色在540nm波长进行比色实验原理试剂与器材校准液
血清总胆红素测定
浙江中医药大学 生命科学学院 生物化学教研室
【实验目的】
掌握：试剂盒测定血清总胆红素的基本原理 熟悉：试剂盒测定血清总胆红素的操作过程
4、叠氮钠能破坏重氮试剂，终止偶氮反应。不宜采用叠氮 钠作防腐剂中的质控血清。
5、标本对照管的吸光度一般很接近，若遇标本量很少时可 不做标本对照管，可参照其他标本对照管的吸光度。
6、每次加完试剂都应充分混均，给予适宜的温度、时间使 其反应。
7、在使用分光光度计测吸光度前，应使其事先预热，以免 影响所测结果。
【实验原理】
血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反 应，产生偶氮胆红素。非结合胆红素在 催速剂咖啡因等的作用下，其分子内部 氢键遭到破坏后才与重氮试剂反应也产 生偶氮胆红素，即在酸性介质中生成偶 氮色素。
【实验原理】
重氮试剂
1)血清中结合胆红素
偶氮胆红素
2)非结合胆红素+咖啡因-苯甲酸钠-醋酸钠 （加速剂） 重氮试剂
分子内部氢键遭到破坏
偶氮胆红素(紫红色) 在540nm波长进行比色
【试剂与器材】
1. 血清总胆红素测定试剂盒 工作试剂R1：盐酸120mmol/L；咖啡因2.1mmol/L
2，5-二氯苯重氮四氟硼酸盐0.31mmol/L；
校准液：TBil（总胆红素）：68 umol/L，
DBil（结合胆红素）：15 umol/L
血清总胆红素=
× 校准物浓度
初级护师：血清胆红素测定
初级护师：血清胆红素测定
血清总胆红素和血清直接胆红素(1m in胆红素)测定，此项试验可准确测定血清中总胆红素含量和直接胆红素含量。
1.参考值血清总胆红素测定1.7~17. 1umoI/L(0.1~1.0mg/dl);血清直接胆红素测定0~4 umoI /L(0~0.2mg)
2.临床意义
(1)判断黄疸程度：总胆红素在17~3 4 umoI/L为隐性黄疽;34~170 umoI/L为轻度黄疸;170~340/L umoI为中度黄疸;大于350 umoI/L为重度黄疸。
根据总胆红素与直接胆红素的比率判断黄疸类型，其中阻塞性黄疸的直接胆红素最高，肝细胞性黄疸次之。
正常人及三种黄疸的胆红素代谢检查结果(表略) 。
实验二十八 胆红素测定
胆红素测定
胆红素测定的临床意义
（1）判断有无黄疸。 隐性黄疸：< 34.2 mol/L，外观看不出。
显性黄疸：≥34.2
mol/L，有黄染的现象。
（2）根据血清胆红素分类，判断黄疽类型。 1.肝细胞性黄疸: TB DB IB 2.溶血性黄疸: TB IB 3.梗阻性黄疽: TB DB
0.1ml
0.1ml
0.1ml 0.1ml
混匀20－25℃， 10min、546nm比色
D.Bili：
R1 工作液 生理盐水 标准液 样品 试剂空白 2ml 0.08ml 试剂 2ml 0.08ml 0.08ml 标准空白 2ml 标准 2ml 0.08ml 0.08ml 0.08ml 样品空白 2m 样品 2ml
直接胆红素（DBIL）： R1：EDTA、盐酸、对氨基苯磺酸 R2：亚硝酸钠 直接胆红素标准液：21.8μmol/L R1：R2＝40：1 即为工作液 标准液用2ml蒸馏水复溶后可直接使用
T.Bili：
R1 工作液 生理盐水 标准液 样品 试剂空白 2ml 0.1ml 试剂 2ml 0.1ml 标准空白 2ml 标准 2ml 样品空白 样品 2m 2ml
胆红素测定的实验原理
IF-CC推荐胆红素测定采用偶氮反应法 血清胆红素可在加速剂（甲醇、咖啡因） 的作用下，与重氮试剂发生反应生成偶氮 胆红素，出现颜色反应，颜色的深浅与胆 红素的浓度成正比。
总胆红素（TBIL）： R1：对氨基苯磺酸、盐酸 R2：亚硝酸钠 总胆红素标准液：36μmol/L R1：R2＝5：1 即为工作液 标准液用2ml蒸馏水复溶后可直接使用
混匀37℃， 5min、546nm比色
结果计算： 胆红素浓度= [（A样品-A样品空白）-（A试剂-A试剂空白）]×F
胆红素测定的实验报告
一、实验目的1. 了解胆红素测定的原理和方法。
2. 掌握胆红素测定仪器的操作技能。
3. 通过实验，掌握胆红素测定的方法，并对胆红素含量进行定量分析。
二、实验原理胆红素是一种黄色的生物色素，是血红蛋白在体内代谢的产物。
胆红素在血液中含量过高会导致黄疸。
本实验采用紫外-可见分光光度法测定胆红素含量。
该方法基于胆红素在特定波长下有最大吸收的特性，通过测定其吸光度，计算胆红素含量。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：紫外-可见分光光度计、恒温水浴锅、移液器、容量瓶、试管等。
2. 试剂：胆红素标准溶液、盐酸、硫酸铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水乙醇等。
四、实验步骤1. 准备工作（1）将胆红素标准溶液稀释至一定浓度，制成标准系列。
（2）将待测样品用无水乙醇提取胆红素。
（3）用移液器准确移取一定量的胆红素标准溶液和待测样品，分别加入试管中。
（4）向试管中加入适量的盐酸和硫酸铵，混匀。
（5）将试管置于恒温水浴锅中，加热至60℃，保温10分钟。
（6）取出试管，冷却至室温。
2. 吸光度测定（1）打开紫外-可见分光光度计，设定波长为510nm。
（2）将胆红素标准溶液和待测样品分别放入比色皿中。
（3）依次测定胆红素标准溶液和待测样品的吸光度。
3. 数据处理（1）以胆红素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
（2）根据待测样品的吸光度，从标准曲线上查得相应的胆红素浓度。
（3）计算待测样品中胆红素含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制根据实验数据，绘制胆红素标准曲线，其线性方程为：y = 0.0036x + 0.0152，相关系数R² = 0.9987。
2. 待测样品胆红素含量测定根据待测样品的吸光度，从标准曲线上查得相应的胆红素浓度为0.8 mg/L。
3. 结果分析本实验通过紫外-可见分光光度法测定了待测样品中的胆红素含量，结果显示待测样品中胆红素含量为0.8 mg/L。
该结果与实际值较为接近，表明实验方法准确可靠。
最新实验十八 血清胆红素测定(改良J-G法)
实验十八血清胆红素测定(改良J-G法)（改良J-G法）【目的】1.熟悉血清胆红素测定的原理和方法；２.掌握胆红素测定的正常参考范围及临床意义。
【原理】血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，生成偶氮胆红素；未结合胆红素需要在加速剂（咖啡因-苯甲酸钠）作用下，分子内氢键破坏后，才能与重氮试剂反应生成偶氮胆红素。
醋酸钠缓冲液保持反应的pH，反应完成后加入终止试剂（叠氮钠）以破坏重氮试剂，最后加入碱性酒石酸钠溶液，使颜色不稳定的紫红色偶氮胆红素在咖啡因存在下转化为稳定的蓝色偶氮胆红素，在600nm波长比色，从标准曲线查找总胆红素和结合胆红素含量。
【器材】试管及试管架、吸管、恒温水浴箱、分光光度计、秒表。
【试剂】1．咖啡因试剂称取无水水醋酸钠41.0g，苯甲酸钠38.0g，乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na）0.5g，溶于约500ml去离子水中，再加入咖啡因25.0g，搅拌使溶解（加2入咖啡因后不能加热溶解），用去离子水补足至1L，混匀。
过滤后置棕色瓶，室温保存。
2．碱性酒石酸钠溶液称取氢氧化钠75.0g，酒石酸钠（Na2C4H4O6·2H2O）263.0g，用去离子水溶解并补足至1L，混匀。
置塑料瓶中，室温保存。
3．5g/L亚硝酸钠溶液仅供学习交流冰箱保存，稳定期不少于2周。
若发现溶液呈淡黄色，应废弃重配。
4．5g/L 对氨基苯磺酸溶液称取对氨基苯磺酸（NH2C6H4SO3H·H2O）5.0g，溶于800ml去离子水中，加入浓盐酸15ml，用去离子水补足至1L。
5．重氮试剂临用前取上述亚硝酸钠溶液0.5ml和对氨基苯磺酸溶液20ml，混匀即成。
6．5.g/L叠氮钠溶液7．胆红素标准液（1）目前一般用未结合胆红素配制标准液，此标准品须用含白蛋白的溶剂配制，常用人混合血清，对此血清的要求如下：收集无溶血、无黄疸、无脂浊的新鲜血清，混合，必要时可用过滤器过滤。
取过滤后的血清1ml，加入新鲜0.154mmol/L NaCl溶液24ml，混合。
直接胆红素测定(D-BIL).
胆红素 ＋氯化重氮苯磺酸 物
紫红色的偶氮化合
加速剂为二甲基亚砜，使游离的胆红素分子内的次级键断 裂，极性上升，与重氮试剂反应。 λ=接胆红素的测定 实验参考值： 2~18μmol/l 临床意义： 当血清胆红素浓度超过34.2μmol/L时，会 导致皮肤、巩膜黄染的现象，这称为黄疸。 根据黄疸的发病机制可分为三类：
注意事项
样品的活性超出可测线性范围上限时，需 进行生理盐水稀释，测定结果乘以稀释倍 数。 叠氮钠能破坏偶氮试剂，终止偶氮反应， 凡用叠氮钠作为防腐剂的质控血清，可引 起重氮反应不完全，甚至不呈色。
总胆红素测定（T -BIL）
实验原理
对氨基苯磺酸 ＋ 亚硝酸钠 氯化重氮苯磺酸 ＋ NaCl ＋ 2H2O
使上端胆管内压力不断升高，最后使小胆
管和毛细胆管扩张，通透性增加，甚至破
裂，使胆汁返流入血，血中结合胆红素增 加。
3. 肝细胞性黄疸（肝源性黄疸） 由于 肝细胞病变，肝功能减退，使肝脏对胆红 素的摄取、转化和排泄作用发生障碍。一 方面肝脏不能将未结合胆红素转化成结合 胆红素，使血中未结合胆红素增加；另一 方面，病变区压迫毛细胆管，使结合胆红 素返流入血，血中结合胆红素也增加。
1. 溶血性黄疸（肝前性黄疸） 由于各种
原因使红细胞大量破坏，以致未结合胆红素
明显增加，超过肝脏的转化能力，但结合胆
红素正常。新生儿血脑屏障发育不全，游离
胆红素易进入脑组织，与脑部基底核的脂类
结合，将神经核染成黄色，称为核黄疸（胆
红素脑病）。
2. 阻塞性黄疸（肝后性黄疸） 由于
胆道阻塞，胆汁不能排出而淤积在胆管内，
胆红素 ＋氯化重氮苯磺酸 偶氮化合物
血清胆红素的实验报告
血清胆红素的实验报告研究背景血清胆红素是一种重要的临床生化指标，用于评估肝功能和溶血性贫血等疾病的诊断和治疗过程中的效果。
因此，对血清胆红素的准确检测方法进行研究和优化，对临床检验具有重要意义。
实验目的本实验旨在探索一种简便、准确、实用的方法来测定血清胆红素的含量。
实验原理本实验利用了二甲基亚硝胺(DMA)与胆红素在酸性条件下的化学反应，生成红色的胆红素硝基胆红素(DMN)。
DMN与高碱溶液结合形成蓝色的复合物，其最大吸收波长为576nm。
根据DMN与胆红素的反应关系，通过测量吸光度来确定血清样品中胆红素的含量。
实验材料和方法材料：1. 血清胆红素标准品2. 二甲基亚硝胺溶液3. 磷酸盐缓冲溶液4. 纯水5. 高碱溶液方法：1. 准备标准曲线：分别取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL的血清胆红素标准品，加入离心管中。
2. 加入1 mL的DMA溶液和1 mL的磷酸盐缓冲液，快速摇匀后，在40恒温水浴中反应10分钟。
3. 加入10 mL的纯水冷却至室温，用离心机离心5分钟。
4. 取上清液，用高碱溶液稀释10倍，即得到标准曲线的各个浓度标准溶液。
5. 测定各个标准溶液的吸光度，并记录。
测量待测样品1. 取待测样品3 mL，加入1 mL的DMA溶液和1 mL的磷酸盐缓冲液，快速摇匀后，在40恒温水浴中反应10分钟。
2. 加入10 mL的纯水冷却至室温，用离心机离心5分钟。
3. 取上清液，用高碱溶液稀释10倍。
4. 测量吸光度，并根据标准曲线计算出样品中胆红素的含量。
实验结果及分析标准曲线根据所制备的标准曲线，测量各个标准溶液的吸光度，得到以下数据：胆红素标准溶液（mL）吸光度0.1 0.2340.2 0.4210.4 0.8230.6 1.2330.8 1.602待测样品测量结果测量待测样品后，得到其吸光度为0.845。
根据标准曲线的线性方程（y = 1.957x + 0.095，R²=0.998），可以计算出待测样品中胆红素的含量。
胆红素的测定实验报告
胆红素的测定实验报告实验目的1. 了解胆红素的性质和重要性；2. 学习测定胆红素的方法和原理；3. 进行胆红素的测定实验，掌握实验操作技巧和数据处理方法；4. 分析实验结果，提出实验中的问题并加以改进。
实验原理胆红素是一种重要的生物色素，主要存在于胆汁中，由红细胞分解代谢产生。
胆红素的检测在临床诊断和科学研究中有着重要的应用价值。
本实验主要采用间接法测定胆红素。
实验原理如下：1. 将待测试样中的胆红素与Diazotized Sulfanilic Acid（DSA）和N-(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride（NED）反应，生成紫红色的偶氮铵盐，该产物在波长为560 nm 处具有最大吸光度。
2. 利用分光光度计测定反应产物的吸光度，并进行定量分析。
实验步骤准备工作1. 打开分光光度计并预热，调节至波长560 nm；2. 准备胆红素标准溶液；3. 准备Diazotized Sulfanilic Acid（DSA）和N-(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride（NED）溶液；4. 使用比色皿清洗剂彻底清洗比色皿，保证无污染；5. 为每个待测样品准备10 mL的试管。
实验步骤1. 取一只干净的比色皿，设置空白试管，在分光光度计上调到560 nm波长；2. 在空白试管中注入2 mL的去离子水作为空白参照；3. 分别将标准试样和待测试样分别加入10 mL的试管中；4. 各试管中加入0.2 mL的DSA 和NED 混合溶液；5. 用去离子水稀释待测试样，使其与标准试样在同一浓度范围内；6. 分别将试管放入分光光度计，记录各试管的吸光度；7. 根据标准曲线，计算出待测样品中胆红素的浓度。
实验结果以下为实验结果的一部分：实验样品吸光度标准样品1 0.315标准样品2 0.423标准样品3 0.537待测样品1 0.380待测样品2 0.465待测样品3 0.502数据处理与分析根据标准样品的吸光度和浓度之间的关系，可以得到一条标准曲线。
实验十八 血清胆红素测定(改良J-G法)
实验十六血清胆红素测定（改良J-G法）【目的】1.熟悉血清胆红素测定的原理和方法；２.掌握胆红素测定的正常参考范围及临床意义。
【原理】血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，生成偶氮胆红素；未结合胆红素需要在加速剂（咖啡因-苯甲酸钠）作用下，分子内氢键破坏后，才能与重氮试剂反应生成偶氮胆红素。
醋酸钠缓冲液保持反应的pH，反应完成后加入终止试剂（叠氮钠）以破坏重氮试剂，最后加入碱性酒石酸钠溶液，使颜色不稳定的紫红色偶氮胆红素在咖啡因存在下转化为稳定的蓝色偶氮胆红素，在600nm波长比色，从标准曲线查找总胆红素和结合胆红素含量。
【器材】试管及试管架、吸管、恒温水浴箱、分光光度计、秒表。
【试剂】1．咖啡因试剂称取无水水醋酸钠41.0g，苯甲酸钠38.0g，乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）0.5g，溶于约500ml去离子水中，再加入咖啡因25.0g，搅拌使溶解（加入咖啡因后不能加热溶解），用去离子水补足至1L，混匀。
过滤后置棕色瓶，室温保存。
2．碱性酒石酸钠溶液称取氢氧化钠75.0g，酒石酸钠（Na2C4H4O6·2H2O）263.0g，用去离子水溶解并补足至1L，混匀。
置塑料瓶中，室温保存。
3．5g/L亚硝酸钠溶液称取亚硝酸钠0.5g，用去离子水溶解并定容至100ml，混匀，置棕色瓶，冰箱保存，稳定期不少于2周。
若发现溶液呈淡黄色，应废弃重配。
4．5g/L 对氨基苯磺酸溶液称取对氨基苯磺酸（NH2C6H4SO3H·H2O）5.0g，溶于800ml去离子水中，加入浓盐酸15ml，用去离子水补足至1L。
5．重氮试剂临用前取上述亚硝酸钠溶液0.5ml和对氨基苯磺酸溶液20ml，混匀即成。
6．5.g/L叠氮钠溶液7．胆红素标准液（1）目前一般用未结合胆红素配制标准液，此标准品须用含白蛋白的溶剂配制，常用人混合血清，对此血清的要求如下：收集无溶血、无黄疸、无脂浊的新鲜血清，混合，必要时可用过滤器过滤。
直接胆红素测定的标准操作程序
直接胆红素（DBIL）测定的标准操作程序【应用范围】体外检测血清、血浆DBIL浓度测定。
【适用仪器】Olympus AU-27全自动生化分析仪。
【程序改变】严格遵循仪器、试剂说明书及校准品使用说明。
【方法学原理】在PH2.9环境中，表面活性剂和偏钒酸盐与直接胆红素作用形成胆绿素，胆红素的减少引起在波长450nm处吸光度的下降，吸光度的变化与直接胆红素的含量成正比。
【试剂】溶液A（R1）：酒石酸缓冲液PH 2. 90.1 mmol/L表面活性剂稳定剂70mmol/L溶液B（R2）:偏钒酸盐4mmol/L磷酸盐缓冲液PH7.010mmol/L稳定剂2.校准品：DiaSys TruCal U。
3.质控品：Randox Assayed Multiseral Level 1 and Level 2.【标本收集与准备】1.血清或血浆标本根据实验室标准采集程序采集标本，适用标本为血清或肝素抗凝血浆（肝素钠抗凝结果高0.5mmol/l）,不可从正在静脉滴注手臂上采血，上机标本不能有凝块，样品采集后2天内离心标本，分离血清，血清或血浆标本室温保存4天，冷藏7天，冷冻保存6个月。
【操作步骤】1. 仪器测定参数设置2. 试剂准备：将准备好的试剂置仪器试剂盘中（8C ）。
3. 校准校准物的准备：将校准物从冰箱取出，冻干校准物按说明书加入蒸馏水复溶，轻轻颠倒混匀3次，不可用力震摇，室温放置30分钟至完全溶解；液体校准物从冰箱取出，室温放置15分钟以平衡至室温。
校准物的选择尽可能选择配套仪器厂家校准品。
亦可将校准液复溶后分装保存于-20C 冰箱中，每周校准一次或更换试剂批次后进行校准。
上机校准程序：[1] 选择用户菜单USERCalibrationStart Entry 进入输入界面。
[2] 用光标键选欲校准项目，。
确认后按叵互。
⑶将校准品按屏幕显示放入绿色校准架相应位置，将校准架置入进样轨道，按▲开始。
【参考范围】血清/血浆DBIL ： 1.7-6.8 mol/L 【临床意义】D.Bil 临床上多用于黄疸的诊断和黄疸性质的鉴别。
血清直接胆红素测定标准操作规程
血清直接胆红素测定标准操作规程1.检验原理：（钒酸盐法）pH 值接近3时，在钒酸盐和表面活性剂的作用下，胆红素被氧化成胆绿素。
此时，胆红素特有的黄色减少，在波长450nm 处通过测定钒酸作用前后的吸光度的差可以求得样品中直接胆红素的浓度。
胆红素−−−−−→−表面活性剂钒酸盐/胆绿素 2.试剂主要组成成分3.样本要求 新鲜无溶血血清，勿使用肝素抗凝血浆。
22～25℃保存8小时，2～8℃保48小时，-20℃保存7天，样本不可反复冻融！4.检验方法：仪器法（详见DF-603/DI-600标准操作规程）5.参考范围：6.检验结果的解释6.1样本含量超出线性范围时，建议用0.9%（W/V ）的氯化钠溶液稀释样本。
通常稀释2倍，当样本浓度较大时提高稀释倍数。
6.2单位换算：mg/dL=umol/L ×0.05857检验方法的局限性7.1结果的准确性依赖于仪器的校正和测定温度、时间的控制。
7.2若试剂浑浊或以水空白在450nm 处吸光度大于0.500时不能使用。
8.产品性能指标8.1线性范围：在给定的样本/试剂比例和条件下测定时，本世纪线性范围可达0-320umol/L 。
8.2试剂空白吸光度：在450nm 处，光径1cm 时，空白吸光度A ≤0.500，△A空白/分钟≤0.002.8.3准确度：相对偏差≤10%。
8.4精密度8.4.1批内精密度CV≤3%8.4.2批间精密度：R≤10%8.5分析灵敏度：在给定的样本/试剂比例和条件下测定时，1umol/L的直接胆红素对应的△A不低于1.5×3108.6干扰试验无明显干扰：添加干扰物后的测定值与初始测定值的相对偏差处于±10%以内。
8.7方法比较：本试剂盒与商品化试剂盒测定40个样本测定结果相关性如下：y=1.052x-1.254；r=0.998。
9.临床意义：在肝细胞内质网中，胆红素结合成水溶性的胆红素双葡糖醛酸酯，能和重氮试剂直接反应，故称直接胆红素。
直胆红素(DBIL) 重氮盐法
目录1. 检测原理2. 标本采集与处理2.1 受检者的准备2.2 静脉采血2.3 抗凝剂2.4 标本处理3. 试剂3.1 试剂3.2 校准血清3.3 试剂与校准血清的稳定性4. 仪器5. 操作6. 计算7. 操作性能7.1 精密度7.2 准确度7.3 灵敏度7.4 可报告范围7.5 特异性7.6 干扰8. 参考值9. 临床意义附录A: 参数1. 检测原理对氨基苯磺酸+ HCl + NaNO2 --------- 氯化重氮苯磺酸+ NaCl 胆红素+ 氯化重氮苯磺酸-------偶氮胆红素2. 标本采集与处理2.1 受检者的准备：病人空腹12h，不饮酒24h后采集血样。
体检对象抽血前应有两周的的正常状况记录。
注意有无应用影响测试项目的药物。
此外，对于体检者，采血的季节都应做相关记录，因为样本中各项目的含量有季节性变动，为了前后比较应在每年同一季节检验。
应嘱体检对象在抽血前24小时内不做剧烈运动。
2.2 静脉采血：除非是卧床的病人，一般在采血时取坐位。
体位影响水分在血管内外的分布，会影响测试项目的浓度。
在采血前至少应静坐5分钟，一般从肘静脉取血，使用止血带的时间不超过1分钟，穿刺成功后立即松开止血带。
2.3 抗凝剂：血浆多主张用EDTANa2（1mg/mL）抗凝。
2.4 标本处理：血标本室温放置30min～45min后离心分离血清或血浆，在两小时内检测完毕；如两小时内不能检测完毕，将离心分离血清或血浆置洁净试管加盖2-8℃保存。
3．试剂3.1 试剂：本科使用湖南永和阳光科技有限责任公司DBIL试剂盒，为液体双试剂，各组分如下：标准液：64.5umol/L (3.75mg/dL)3.2 校准血清：使用湖南永和阳光科技有限责任公司提供的40项校准血清。
校准频次：空白定标：每日需做试剂空白定标。
全点定标：试剂换批号使用时或质控结果超过规定的2SD范围，需要全点定标。
3.3 试剂与校准血清的稳定性：原包装试剂储存在2-8℃至标签所示失效日期。
血清直接胆红素(D-BIL)测定
血清直接胆红素（D-BIL）测定1. 实验原理直接胆红素与2,4-二氯苯胺重氮盐形成重氮化合物，在酸性条件下呈红色。
2. 标本：2.1 病人准备：无特殊要求。
最好用禁食的标本以减少乳糜血的干扰。
2.2 类型：血清、肝素或EDTA血浆，应避光保存。
3. 标本存放：15～25℃保存可稳定2天；2～8℃保存可稳定7天；-20℃保存可稳定3个月，如冰冻保存，不可反复冻融！。
4. 标本运输：常温条件下避光保存运输。
5. 标本拒收标准：标本溶血、细菌污染、脂血、非避光保存运输的标本。
6. 实验材料6.1 试剂：奥林巴斯总胆红素试剂盒：试剂＋空白对照6.1.1 试剂准备：试剂为即用式。
6.1.2 试剂稳定性与贮存：试剂避光保存于2～8℃，若无污染，可稳定至失效期。
试剂有效期为18个月。
试剂2必需避光保存。
试剂不可冰冻。
6.1.3 变质指示：当试剂有浊度时，表明有细菌污染，不能继续使用。
6.1.4 注意事项：此试剂为体外诊断用。
警告！腐蚀剂！不要入口。
避免和眼睛，皮肤或衣服接触。
如果接触到，立即用大量的水冲洗受损害的部位15分钟。
接触到眼睛或吞服，立即寻找医疗保护。
6.2 校准品：使用奥林巴斯公司提供的校准品对自动分析仪进行校准，参见生化检验校准品和质控品.SOP文件6.3 质控品：参见生化检验校准品和质控品.SOP文件7. 仪器：奥林巴斯AU2700生化分析仪8. 操作步骤8.1 项目基本参数：参见生化检验奥林巴斯AU2700生化分析仪项目测定参数.SOP文件8.2 仪器操作步骤：参见生化检验奥林巴斯AU2700生化分析仪操作规程.SOP文件检验结果的判断与分析10. 质量控制：在每一批标本中都应把非定值血清水平I与II质控做为未知标本进行分析，以2S为质控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控。
质控规则参见生化室室内质控操作规程.SOP文件。
11. 计算方法以TruCal U复合校准品校准仪器后，在病人结果可报告范围内，仪器直接报告可靠的检测结果无需手工计算，以μmol/L报告。
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血清直接胆红素的测定
病人准备：要求病人处于安静状态，生活状态处于日常状态，避免过度空腹、饮食、饮酒吸烟
标本采集，处理，保存和要求：收集无溶血，无黄疸，无脂浊的新鲜血清或肝素血清，避光保存。
混合，必要时可用过滤器过滤。
实验原理：血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，生成偶氮胆红素。
醋酸钠缓冲液保持反应的pH，反应完全后加入终止试剂（叠氮钠）以破坏重氮试剂，最后加入碱性酒石酸钠溶液，使颜色不稳定的紫红色偶氮胆红素在咖啡因存在下转化为稳定的黄色偶氮胆红素，在600nm波长比色，从标准曲线找直接胆红素含量。
实验仪器设备及试剂：咖啡因试剂碱性酒石酸钠溶液5g/L亚硝酸钠溶液5g/L 对氨基苯磺酸溶液5g/L叠氮钠溶液胆红素标准溶液加样枪分光光度计（或半自动生化仪）
实验操作：
一。
取两支试管，按表1操作
表1 改良J—G发测定血清直接胆红素操作表
加入物 (ml) 直接胆红素空白管
血清0.2 0.2
咖啡因苯甲酸钠试剂— 1.6
对甲基苯磺酸—0.4
重氮试剂0.4 —
混匀，准确1分钟
重氮钠0.05 —
咖啡因甲苯酸钠试剂 1.55 —
室温10分钟
碱性酒石酸钠 1.2 1.2
混匀，600nm波长比色，以空白管调0，读取各管吸光度。
从标准曲线上查出直接胆红素浓度。
二．标准曲线的制作
表2 胆红素标准曲线的制作表
加入物 (ml) 对照管 1 2 3 4 5
胆红素标准贮存液— 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
稀释血清 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 —
相当于胆红素浓度 0 34.2 68.4 103 137 171
（u mol/L)
混匀（不可产生气泡),按直接胆红素的测定方法操作。
每一浓度做2个平行管，用对照管调零，读取各管吸光度，以各管吸光度的均值为纵坐标，以相应胆红素浓度为横坐标，绘制标准曲线。
参考范围：血清结合胆红素0~6.8umol/L(0~0.4mg/dl）
注意事项：
1.本法在10 —37℃范围内测定，不受温度变化的影响，两小时内显色非常稳定且灵敏度高，轻度溶血对本法无影响。
2.试剂无法长期稳定，溶血可使胆红素测定值偏低，以叠氮钠作为防腐剂时能破坏偶氮试剂，终止偶氮反应，使重氮反应不完全，甚至不呈色。
方法学评价：1、重氮反应测定胆红素，也可用甲醇（M-E法）或二甲亚砜等做加速剂，可做成单一试剂，反应ph和显色ph都在酸性，560nm波长比色，易于自动化，但灵敏度比改良J-G法略低，M-E法摩尔吸光系数为60500，Hb干扰较明显，Hb>1g/L时，需用样品空白校正
2、本法灵敏度较高，可避免其他有色物质的干扰，是测定血清总胆红素的参考方法，但不能自动化分析是其缺点。
现有些商品试剂盒称咖啡因法或J-G法，但不加碱性酒石酸，即不在碱性条件下显色，其灵敏度和特异度不如上述方法。
质控方法：准确加量。