生物技术常用技术(1)-PCR技术及应用

1988年Saiki开始将耐热性Taq DNA聚合酶应用于PCR，整 个反应只加一次酶即可，扩增特异性和效率都明显改善， 操作大为简化。 1989年被誉为“分子年”，列PCR为十余项发明之首。 1993年，Mullis荣获诺贝尔化学奖。
Kary Mullis 1993
三、PCR的基本原理
试管中进行的DNA复制反应，依据 ① DNA半保留复制的机理； ② 体外DNA分子于不同温度下可变性和复性
引物设计的原则
基本原则是最大限度地提高扩增效率和特 异性，同时尽可能抑制非特异性扩增。
①引物长度： 15-30bp，常用20bp左右
— 引物的有效长度不能大于 38 bp，否则最适 延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度
（74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性
②引物扩增跨度：以500bp为宜
Vent DNA聚合酶 Pfu DNA聚合酶等
Taq 酶的保真性不高 • 5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，
无3’→5’外切活性; • 在PCR反应中如发生某些碱基的错配，该
的性质； 通过人为控制体外合成系统的温度，使 ① 双链DNA变成单链， ② 单链DNA与人工合成的引物退火， ③ DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双
链DNA。
待扩增片段
高温变性
低温退火
中温延伸
PCR每一步的转换通过温度的改变控制。 DNA模板解链（变性）、引物与模板结合 （退火）、DNA聚合酶催化新生DNA的合 成（延伸）三个步骤构成PCR反应的一个 循环。
1971 年 ， Khorana （ 美 国 MIT 教 授 ， 1968 年 诺贝尔医学奖得主）：“经过DNA变性，与 合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并 不断重复该过程便可克隆tRNA基因。”
核酸体外扩增最早设想被遗忘原因:
（1）很难进行测序和合成寡核苷酸引物； （2）1970年Smith等发现了II型限制性内切 酶，体外克隆基因已成为可能。
（一）PCR 的反应体系
1. 引物（primer） 2. 酶 （Taq DNA polymerase） 3. dNTP 4. 模板 （template） 5. Mg2+ （magnesium）
1、引物
引物：决定PCR反应的特异性 PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA互补的程度 理论上，只要知道任何一段模板DNA序 列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引 物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量 扩增
1976年，台籍科学家钱嘉韵（Alice Chien） 从黄石国家公园的嗜热菌Thermus aquaticus 中分离出热稳定的Taq DNA聚合酶。
1985 年 ， 美 国 Cetus 公 司 人 类 遗 传 研 究 室 的 Mullis发明聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），Saiki等首次应用PCR法 成功地扩增了人-珠蛋白的DNA，并应用于 镰刀状红细胞贫血的产前诊断。
此循环反复进行，可使目的DNA得以迅速 扩增。
理论扩增率：2n递增（ n为循环次数 ）， 25～30循环，目标DNA可增加109倍。
实际扩增率：(１＋Ｘ)n，X为PCR的实际扩 增率，平均约为75%。
由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因 素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为 线性形式，所以实际上进行30个循环后，扩 增倍数一般可达106～107。
—特别避免 3’端的互补，否则会形成引物二聚体，
产生非特异性的扩增条带
⑤引物 3’端的碱基要求严格配对（不能做任何 修饰）
— 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端 碱基不配对而导致PCR失败
⑥引物5′端可修饰 — 引物5′端限定着PCR产物的长度，但对扩增特
异性影响不大；引物5′端碱基可不与模板DNA 互补而呈游离状态；引物5′端最多可加10个碱 基而对PCR反应无影响
— 特定条件下可扩增长至10kb的片段
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜
— G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非 特异条带
— ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或 嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3′端不应超过3 个连续 的G或C，因为这样会使引物在G+C富集区 引发错 误延伸
④避免引物内部出现二级结构和引物间互补
以上“变性、退火、延伸”三部曲为PCR一 轮循环。
PCR扩增曲线
必须的仪器设备
四、PCR 反应体系与流程
反应体系 模板（DNA或RNA） 引物 Taq DNA聚合酶 10×PCR缓冲液 1.5～4 mM Mg2+ 0.2 mM dNTP
反应流程
预变性
变性 退火 延伸
25～35 循环
延伸完全
终止
生物技术常用技术一
聚合酶链反应（PCR）
一、PCR的用途
体外扩增特异DNA片段的技术，能快速、特 异地扩增目的DNA片段。 能通过试管内的数小时反应将特定的DNA
片段扩增数百万倍。 迅速获取大量的单一核酸片段，为分子生
物学研究提供了强大的工具。
二、发展历程
1953 年 ， Watson 和 Crick 提 出 DNA 双 螺 旋 结构及半保留复制模型。 1958年，Meselson和Stahl用实验证实DNA 半保留复制模型。 70年代以来，人们采用两种思路去尝试建 立基因的无性繁殖体系，一是基因克隆技 术，二是体外扩增技术。
2、酶及其浓度
目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应 – 天然酶：从水生嗜热杆菌中提纯 – 基因工程酶：大肠杆菌合成
一个典型的 PCR反应约需酶量1- 2.5U/100 ul体系 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产
物量减少
DNA聚合酶
Klenow片段 T4 DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶（应用最广） 其他DNA聚合酶：Tth DNA聚合酶
3’Baidu Nhomakorabea
5’
5’
3’
限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变 探针标记
⑦引物的特异性：
— 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同 源性
⑧引物量：
— 每条引物的浓度0.1 ~ 0.5μM，以最低引物量产 生所需要的结果为好
—引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且 可增加引物之间形成二聚体的机会