液相色谱基础知识

离子对色谱法
在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂 与样品中可电离的组份形成“对离子” 在反相色谱柱上分离离子型化合物 离子对试剂的类型
季铵盐、叔胺盐 （正离子），适用于弱酸
烷基磺酸盐、高氯酸盐（负离子），适用于弱 碱
烷基长度不同，形成对离子的能力不同
离子对色谱的应用
抗组胺及减充血剂药物的分析
HPLC的应用
在兽药研究中分析应用 在医药研究中分析应用 药物分析有USP、BP、CP等标准
常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心 血管药、磺胺类消炎药等。 甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性 激素和孕激素等。 抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素 、四环素、氯霉素、诺氟沙星等。 中草药研究中的应用：生物碱、甙类(皂甙、强心甙、黄酮甙 等)、萜类 手性药物研究中的应用：光学异构体的拆分(如解毒剂D-青霉 胺毒性小，L-异构体毒性很强) 医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。
峰对称因子计算公式
对称因子(fs)：
式中： fs=0.95~1.05为正常峰 fs＜0.95为前延峰 fs＞1.05为拖尾峰
液相色谱原理 － 更进一步的探讨
离子型化合物的分离方式 多数化合物是离子型的！ 使用离子交换柱：离子交换法 主要用于“强”阴、阳离子
使用反相柱
离子抑制色谱法：通过改变流动相的pH值，使 样品成中性 离子对色谱法：加入“对离子”，使样品呈中 性
理论塔板数计算公式：
V1 N s W
W Wtan s 16
2
方法 切线法
Wh W3s W4s W5s
5.54 9 16 25
半峰高 3s 4s 5s
分离度方程解析：分离因子项
R1 4
1 N 1

高效液相色谱基本概念
源自文库
色谱图：HPLC图形结果（Chromatogram）
色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的 曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。
← 色谱峰 峰高 峰宽 基线 ↓ 保留时间（分）
液相色谱图相关术语
色谱峰 － Peak 色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分 曲线 峰底 － Peak Base 峰的起点与终点之间连接的直线 峰高 － Peak Height 峰最大值到峰底的距离 峰宽 － Peak Width 在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离 半（高）峰宽 － Peak Width at Half Height 通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相 交两点之间的距离
若 = 1.1 or 1.4，R 会如何变化？
＝ 分离因子：峰分离程度的量度
V1 V2 V3
V0

时间
0.5
1
2
5
k' V2 k' V1
V2 V0 或 V1 V0
2 - .5 V2 3 1 - .5
5 - .5 V3 9 1 - .5
分离因子：α
CHO
COONa
CHO
COOH
OCH3 OH 1 2 3 OCH3 4
离子抑制色谱的使用范围
下列情况下不能使用离子抑制方法，如果： 一些酸在pH低于2时还保持离子化 一些碱在pH高于7时还保持离子化 可以有以下的选择
离子交换色谱
使用聚合物或其他耐碱性流动相的反相柱，在 pH高于7时用离子抑制法 使用“离子对色谱法”
HPLC的应用
在公安、刑警破案工作需要
毒品分析等
在环境污染分析中的应用
废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、 酚类和胺类的检测
*************************************
2004年获悉，世界上化合物总数达到4700万，其中绝大部 分是有机化合物，而大约有70％以上是不挥发的。对HPLC 来说，只要被分析物质在流动相溶剂（各种各样〕中有一 定的溶解度便可分析。所以，HPLC在各行各业有着广泛的 应用潜力。
评价液相色谱方法的标准
问题：什么样的分离结果是好的？分离度？灵敏度？
什么是色谱的分离度
分离度的公式：
R
V2 V1 1 (W2 W1 ) 2
R：分离程度的量度
影响分离度的因素：K’、α及N
分离度方程：
N k ' 1 R k ' 1 4
HPLC 的应用
在生物化学和生物工程中的应用
氨基酸、多肽和蛋白质的分析研究 核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究 生物胺的分析研究（儿茶酚胺类)
在精细化工分析中的应用
醇、醛和酮、醚的分离分析 酸和酯的分离分析 表面活性剂的分析 聚合物的分析研究 药物、农药、染料、炸药等工业产品
在无机离子分析中应用
饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析
V1 V0 V0
1 - .5 k' V1 1 .5
5 - .5 k' V3 9 .5
容量因子 k 与分离度的关系
k 值 k项 k对分离度影响
0
1 2 3 10
0
1/2 2/3 3/4 10/11
0
.50 .67 .75 .91 与 R 的关系
20
20/21
.95
容量因子 k 与峰高的关系
改变 k’ 值的方法： 调节流动相的极性（比例）、pH、离子强度等 梯度淋洗
改变容量因子 K’ 的例子
谱图
① ① ① 5 0 / 5 0 ② ③ 6 0 / 4 0 4 0 / 6 0
② ②
③③
α、k’ 及 N 如何控制分离度
对称因子计算示意图
色谱峰的对称性—对称因子： a. 拖尾因子 b. 不对称因子
液相色谱基础知识
关于色谱
色谱是一种分离工具，而不是传统意义上的分析 仪器 常见的分离方式： 蒸馏、离心、电泳、过滤、超滤
等等
色谱
是其中一种分离工具
色谱法简介
色谱法（Chromatography）溯源 俄国科学加1903年发现色谱的吸附原理，开创 了应用吸附原理分离植物色素的新方法并见诸 于俄文的文献 1906年正式命名（见诸文献） 色谱法；Chromatography 50年代开始广泛研究和应用 主要是气相色谱及薄层色谱 高效液相色谱法的广泛应用始于70年代
液相色谱图相关术语
死时间，t0 － Dead time 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需 的时间 保留时间，tR － Retention time 组分从进样到出现峰最大值所需的时间
死体积，V0 － Dead volume
不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需 的流动相体积
保留体积，VR － Retention volume 组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积
t R 2 t0 k ' 2 定义： t R1 t0 k ' 1
1 =1 时两组分分不开，R 改变的途径
改变固定相或改变流动相(组成)
改变温度
改变样品的本身性质
改变分离因子α 的例子
通过改变流动相组成改变α，同样强度的不同溶剂
① THF / H 2O ＝ 28 : 72 ② MeOH / H 2O ＝ 58 : 42 ③ CH 3CN / H 2O ＝ 38 : 62
对定量及定性分析的要求
灵敏度、精度及准确度的要求
样品量的要求；复杂样品的分析能力 容易使用
液相色谱实验所需的基本参数
液相色谱实验所需的基本参数 流动相：种类及配比，等度或梯度 固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量 以上参数即构成一个具体的HPLC方法；亦称色 谱条件
HPLC的应用
在食品研究中的分析应用 食品中的天然成分
碳水化合物 类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇 脂肪酸和有机酸 蛋白、肽、氨基酸
食品添加剂
酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂 抗氧化剂、防腐剂 颜料和染料（色素〕 维生素
污染物
霉菌（黄曲霉毒素〕 农药和兽药残留 多环芳烃（PAHS〕和亚硝酸
柱 色 谱 纸 色 谱 薄 层 色 谱
气 相 色 谱
气相色谱：流动相是气相
液相色谱：流动相是液相
高 效 液 相 色 谱 H P L C
什么是高效液相色谱
High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱法，简称：HPLC 是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高 效能分离手段：
液相色谱应用：制备型液相色谱
分离及纯化样品是液相色谱原理的直接利用 对分离及纯化的要求 化合物的稳定性 样品的复杂性
制备量的要求
纯度的要求，及纯度的鉴定 方法的安全性
液相色谱应用：分析型液相色谱
定量分析主要基于与标准品的比较 是其最大应用领域 定性分析；不是色谱的强项 基于样品的保留时间比较
借助于和其联用的紫外、质谱或其他检测器
高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以 及高灵敏度的检测器……
广泛应用于各个领域：
医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业……
在技术，理论及应用上仍处于发展阶段
液相色谱的基本流程图
流动相
色谱柱
A B C
进样阀
检测器
D
E F
G
泵
泵输液
进样
分离
检测
记录
HPLC的仪器配置
溶剂 数据处理系统 色谱泵 自动进样器 色谱柱及柱温箱 检测器
改变色谱柱
分离度方程解析：容量因子项
1 1 R 4
1
N

若 = 1, 2, 10 or 20, R会如何变化?
K ＝ 容量因子：保留能力的量度
V1 V2 V3
V0
时间
0.5
1
2
5
k'1
离子抑制色谱
离子型化合物在反相色谱柱上不保留 改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离 主要适用于弱酸性化合物的分离 降低流动相的pH值，使样品降低离子化
使用硅胶基质C18填料
使用条件应在填料基质的范围内
硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）内
离子抑制色谱实例
而在乙腈/水并且 pH=7 时，多数组份 保留时间很短，无 法完全分离。
K‘ 是容量因子，表达了被分离组分与柱填料之 间作用的强弱
α是分离因子，描述两个被分离组份分离的好 坏程度，是化学因素 N 是理论塔板数，描述色谱峰谱带展宽的程度
分离度方程解析：柱效项
1 1 R 4
N
1
若 N 增加 2倍 或 3倍 , R会如何变化?
N ＝ 理论塔板数：分离效率的量度
PW = .5
PW = 2
2
V N 16 W 5 N 16 .5 N 1600
V N 16 W 5 N 16 2 N 100
2
2
2
色谱柱的柱效 N
液相色谱图相关术语
峰面积 － Peak Area 峰与峰底之间的面积,又称响应值
标准偏差；σ － Standard Error 0.607倍峰高处所对应峰宽的一半 拖尾峰 － Tailing Peak 后沿较前沿平缓的不对称峰 前伸峰 － Leading Peak 前沿较后沿平缓的不对称峰 鬼峰 － Ghost Peak 并非由试样所产生的峰；亦称假峰
离子对色谱分析水溶性维生素
N
1 . N i a c i n a m i d e 烟 酰 胺 C O N H
2
C H O H 2 H O C H H O C H H O C H C H 2 NNO
H C N 3
{
3
3 2 . P y r i d o x i n e N 吡 哆 素 ， H C N H O C H O H 3 2 O C H O H V B 6 2 3 . R i b o f l a v i n + N H H CN SC 核 黄 素 ， H C H O H - l C N N V B 2 C H C H
色谱的发明人
俄国科学家：M. S. Tswett 正式命名“色谱”的文献
经典液相色谱
一、色谱起源
石油醚
色素 碳酸钙颗粒 玻璃柱
色谱分离的机理
分离是一个物理的过程
流动相（Mobile Phase） 固定相（Stationary Phase） 样品（溶解于流动相中的溶质）
什么是液相色谱
色 谱
液 相 色 谱
液相色谱图相关术语
基线 － Baseline 在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的 曲线 基线飘移 － Baseline Drift 基线随时间定向的缓慢变化
基线噪声；N － Baseline Noise 由各种因素所引起的基线波动
谱带扩展 － Band Broadening 由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱 内移动过程中谱带宽度增加的现象