基因芯片的操作流程及步骤
基因芯片的操作流程及步骤ppt课件
仅有上述5个能同靶DNA杂交。 • 可以用人工合成的已知序列的所有可能的n体寡核苷酸探
针与一个未知的荧光标记DNA/RNA序列杂交，通过对杂 交荧光信号检测，检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸， 从而推出靶DNA中的所有8 nt亚序列，最后由计算机对大 量荧光信号的谱型（pattern）数据进行分析，重构靶 DNA 的互补寡核苷酸序列。
生物芯片的制作步骤
细胞
对mRNA进行标记 杂交
基因表达资料
“雪亮工程"是以区（县）、乡（镇） 、村（ 社区） 三级综 治中心 为指挥 平台、 以综治 信息化 为支撑 、以网 格化管 理为基 础、以 公共安 全视频 监控联 网应用 为重点 的“群 众性治 安防控 工程” 。
基因芯片研制的总体蓝图
检测样品 的制备
获取样品分子的 数量和序列信息
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基因芯片是信息时代的产物
横跨：生命科学、物理学、
计算机科学、微电子技术 光电技术、材料科学 等现代高 科技。
我国第一家批量生产基因 芯片 拥有近2千条基因药物发明专利
• 东南大学吴健雄实验室 • 中科院计算所生物信息学实验室 • 上海生科院
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基因芯片检测流程
基因芯片检测流程基因芯片检测是一种高通量的基因分析技术，可以同时检测大量基因的表达水平或基因组的变异情况。
该技术的流程主要包括样本准备、芯片处理、数据分析和结果解读等步骤。
首先，样本准备是基因芯片检测的关键步骤。
样本可以是组织、细胞、血液等。
首先，需要提取样本中的总RNA，然后利用逆转录酶将RNA转录成cDNA，并标记上荧光染料。
这一步骤可以通过不同的实验方法进行，如全基因组扩增、dscDNA合成等。
随后，将标记好的cDNA与芯片上的探针进行杂交反应。
其次，芯片处理是对标记好的cDNA进行杂交的步骤。
将标记好的cDNA溶液滴在芯片上，并利用温度控制设备进行加热、冷却等环境控制，促进标记物与芯片上的探针结合。
芯片上的探针可以是单链DNA、RNA或寡核苷酸等，可以选择特定的探针来检测特定基因。
然后，进行数据分析是基因芯片检测的重要步骤。
通过激光扫描芯片上的标记物，可以获取荧光强度信号。
这些信号表示了样本特定基因的表达水平。
通过对比不同样本之间的信号差异，可以分析某个基因在不同样本中的表达差异。
数据分析可以使用各种统计学方法和生物信息学工具进行，常用的包括聚类分析、差异表达分析、富集分析等。
最后，基因芯片检测的结果解读是整个流程的最终目标。
数据分析得到了许多的基因表达信息和差异表达基因，需要对这些数据进行解读和分析。
通过比对已有的数据库和研究结果，可以找出与特定疾病或生理过程相关的重要基因。
进一步的实验验证可以进一步证实芯片分析结果的可靠性。
综上所述，基因芯片检测流程是一个复杂且关键的分子生物学技术。
通过样本准备、芯片处理、数据分析和结果解读等步骤，可以对大量基因进行快速、高通量的检测和分析。
基因芯片检测在疾病诊断、生物学研究等领域具有重要的应用价值。
AFFYMETRIX基因芯片操作流程
AFFYMETRIX 基因芯片操作流程第一章真核靶片断制备＜一＞ RNA 的抽提一、 哺乳动物细胞或组织RNA 的抽提1. 总 RNA 使用 QIAGEN ' 哺乳动物组织作为+2. Poly(A) mRNA 哺乳动物细胞使用 哺乳动物组织作为 离步骤或使用kit.二、 RNA 沉淀1. 总 RNA在用RNeasy Total RNA Isolation kit 分离或洗涤后没有必要沉淀总 RNA.调整洗脱体积以制备cDNA 合成接近希望的 RNA 浓度。
注：为获得足够量的标记 cRNA 用来评估和基因芯片表达探针杂交， AFFYMETRIX 建议开 始合成cDNA 的Poly(A) +mRNA 最小浓度为0.02卩g/卩l 时的最小量是0.2卩g,总RNA 最 小浓度为0.5卩g/卩l 时的最小量是5卩g.这样有两个好处： (1) 有足够量在各步检查样品浓度和质量 (2)制备足够的cRNA 用于杂交在TRIzol 分离和热酚提取后需要乙醇沉淀；见下面方法 +2. Poly(A) mRNA大多数Poly(A) +mRNA 分离过程都会导致得到较稀浓的 RNA ，所以需要在cDNA 合成前浓缩mRNA. 3. 沉淀步骤： (1) 力口 1/10体积3M NaOAc,PH5.2,和2.5倍体积乙醇. (2) 混匀，-20C 放置最少1小时. (3) 4C ,＞ 12000x g 离心 20 分钟. (4) 80%乙醇洗涤沉淀 2次.(5) 空气干燥沉淀.继续下面步骤前检查是否干燥 . (6)DEPC 处理水重新溶解沉淀.最合适的溶解体积由cDNA 合成中需要的 RNA 的浓度和量来决定.先阅读cDNA 合成的过程来决定这一步的适合溶解体积4. RNA 测定用分光光度计分析 RNA 浓度，在260nm1单位吸光度等于 40卩g/mlRNA.需要在260和280nm 测定吸光度来确定样品的浓度和纯度 A 260/A 280应接近2.0为较纯的RNA(比值在1.9-2.1也可)＜二＞由纯化的总RNA 合成双链cDNAAFFYMETRIX 强烈建议 HPLC 纯化 T7-(d7) 24 primerRNeasy Total RNA Isolation kit 成功抽提哺乳动物细胞总 RNA.RNA 的来源，建议使用 TRIzol 抽提总RNA.QIAGEN ' Oligotex Direct mRNA kit,从总 RNA 中抽提 mRNA . RNA 的来源，应首先使用 TRIzol 纯化，再进行一个 Poly(A)+mRNA 分一、第一链cDNA合成开始RNA的量:高质量RNA5.0卩g -40.0卩g纯化后RNA浓缩由260nm吸光度决定（1单位吸光度=40卩g/mlRNA ）, A260/A280应接近2.0，在1.8-2.1的范围内。
基因芯片检测原理及简要过程
基因芯片检测原理及简要过程1.样本准备：首先需要从目标生物体中获得样本，可以是DNA、RNA或蛋白质。
样本处理的方式根据研究目的不同而不同，可能需要提取DNA或RNA，并对其进行纯化和扩增。
2.样本标记：为了将样本引入芯片中进行检测，样本需要与荧光标记物结合。
在样本处理过程中，可以使用反应物来标记样本中的基因或序列。
标记物的选择基于实验设计和研究目的。
3.杂交：标记的样本与芯片上的核酸探针进行杂交反应。
核酸探针是单链DNA分子，具有与目标样本中的DNA互补的序列。
这种杂交反应是通过将样本和核酸探针同时加入一个反应混合物中，使它们相互结合。
4.洗涤：经过杂交反应后，需要对芯片进行洗涤以去除未结合的标记物和杂交物。
这个过程是为了减少背景信号，提高检测的特异性和灵敏度。
5.扫描：在洗涤后，芯片被放入一台专门的扫描仪中，这个扫描仪使用激光或LED光源来激发标记物的荧光信号。
随后，该信号被检测并记录下来。
6.数据分析：通过扫描仪获得的数据可以用来分析芯片上的每个探针的荧光强度。
根据荧光强度的变化，可以推断出样本中的基因表达和变异情况。
通常使用的数据分析方法包括基因差异分析、聚类分析、富集分析和通路分析等。
总结起来，基因芯片检测是一种高通量的基因分析技术，可以同时检测数以千计的基因或序列，用于揭示基因表达和变异的情况。
其基本原理是通过将样本与芯片上的核酸探针进行杂交，再通过标记物的荧光信号检测和数据分析，得出样本中的基因信息。
这项技术已经广泛应用于基因组学、遗传学、癌症研究等领域，促进了对基因功能和疾病机制的理解。
基因芯片第三章基因芯片的制作方法
基因芯片第三章基因芯片的制作方法基因芯片是一种用于检测和分析基因表达的工具，它可以同时测量上千至上百万个基因的表达水平。
基因芯片的制作方法主要包括芯片设计、探针合成、芯片加工和芯片测试等步骤。
下面将详细介绍基因芯片的制作方法。
第一步：芯片设计芯片设计是基因芯片制作的关键步骤，它决定了芯片上每个位置的探针序列。
探针可以是DNA或RNA分子，用于与待测样品中的RNA结合。
探针的设计需要考虑到基因序列的特异性，以及探针长度、探针间隔等参数的选择。
设计好的探针序列将被用于后续的探针合成。
第二步：探针合成探针的合成常常采用固相合成技术。
通过在固相合成反应中逐步添加不同的核苷酸单元（A、T、G、C），可以合成出具有特定序列的寡核苷酸。
合成好的探针需要经过纯化和检测，确保其质量符合要求。
第三步：芯片加工芯片加工是将探针固定在芯片表面的过程。
目前常用的芯片加工技术有光刻和喷墨技术。
光刻技术是通过在芯片表面涂覆光敏材料，然后使用掩膜和紫外线照射，将探针序列的图案直接写入芯片表面。
喷墨技术则是将合成好的探针溶液喷洒在芯片表面，并利用喷嘴的高精度控制，将探针序列分别定位到芯片上的每个位置。
第四步：芯片测试芯片测试是基因芯片制作的最后一步，也是评估芯片质量和性能的重要环节。
通过将待测RNA样品与芯片上固定的探针进行杂交反应，可以检测每个位置的探针与RNA的结合情况。
一般采用荧光探针或放射性标记物等技术，将杂交信号转化为可测的荧光强度或放射性强度。
通过对杂交信号的分析和比较，可以得到样品中各个基因的表达水平。
总结起来，基因芯片的制作方法包括芯片设计、探针合成、芯片加工和芯片测试等步骤。
这些步骤的顺序和操作都对基因芯片质量和性能有重要影响，因此需要严格控制每个步骤的条件和参数。
随着技术的发展，基因芯片的制作方法也在不断更新与改进，以满足对基因芯片在生物医学和生命科学领域的研究应用需求。
基因芯片操作方法
基因芯片操作方法基因芯片是用于检测和分析基因表达的一种高通量技术。
它能够同时检测上千个基因的表达水平，通过测量RNA或DNA分子与芯片上的探针结合的情况，可以得到目标基因在样本中的表达水平。
本文将介绍基因芯片操作的步骤及相关注意事项。
首先，进行实验前需要准备样品和试剂。
样品可以是RNA或DNA提取物，可以来自细胞系、组织样本等。
而试剂包括芯片、标记物（如荧光素或生物素）、缓冲液、洗涤液等。
接下来，样品中的RNA或DNA需要被标记。
标记物通常与RNA或DNA进行酶反应，将荧光素或生物素等标记反应到目标分子上。
此步骤可以使用商业化的标记试剂盒完成。
第三步是将样品和标记物混合。
样品和标记物混合后，在合适的反应条件下进行杂交作用，使标记的RNA或DNA与芯片上的探针结合。
芯片上的探针是一系列具有特异性的寡核苷酸序列，在芯片上形成固定阵列。
第四步是对芯片进行洗涤。
洗涤的目的是去除没有结合的标记物和杂质。
洗涤液中的盐和其他成分可以改变探针和样品分子之间的亲和性，帮助去除非特异性结合。
接下来，通过芯片扫描仪读取芯片上的荧光强度。
被标记的RNA或DNA与芯片上的探针结合后，会发出荧光信号。
芯片扫描仪会记录下每个探针位点的荧光强度，并把数据输出到计算机上。
最后，对芯片数据进行分析和解读。
数据分析可以包括对芯片上每个基因的表达水平进行比较，找出在不同样品之间有差异表达的基因。
此外，还可以进行聚类分析、生物通路分析等，进一步挖掘和解读基因表达的相关信息。
在进行基因芯片操作时，需要注意一些关键点。
首先，样品的制备应该尽量避免污染和降解的问题。
其次，标记物的选择和使用要符合实验要求，并且稳定性好。
不同芯片的探针设计也不同，因此在测序前需要了解所用芯片上的探针信息。
此外，洗涤步骤要严格控制，以免造成杂交效果不佳或者非特异性结合。
最后，在数据分析过程中，要注意处理和解读数据的方法和统计学原则。
总结起来，基因芯片操作包括样品准备、标记、杂交、洗涤、扫描和数据分析等步骤。
AFFYMETRIX基因芯片操作流程
AFFYMETRIX基因芯片操作流程第一章真核靶片断制备<一> RNA的抽提一、哺乳动物细胞或组织RNA的抽提1.总RNA使用QIAGEN’s RNeasy Total RNA Isolation kit成功抽提哺乳动物细胞总RNA.哺乳动物组织作为RNA的来源，建议使用TRIzol抽提总RNA.2.Poly(A)+mRNA哺乳动物细胞使用QIAGEN’s Oligotex Direct mRNA kit,从总RNA中抽提mRNA .哺乳动物组织作为RNA的来源，应首先使用TRIzol纯化，再进行一个Poly(A)+mRNA分离步骤或使用kit.二、RNA沉淀1.总RNA在用RNeasy Total RNA Isolation kit分离或洗涤后没有必要沉淀总RNA.调整洗脱体积以制备cDNA合成接近希望的RNA浓度。
注：为获得足够量的标记cRNA用来评估和基因芯片表达探针杂交，AFFYMETRIX建议开始合成cDNA的Poly(A)+mRNA最小浓度为0.02μg/μl时的最小量是0.2μg, 总RNA最小浓度为0.5μg/μl时的最小量是5μg.这样有两个好处：（1）有足够量在各步检查样品浓度和质量（2）制备足够的cRNA用于杂交在TRIzol分离和热酚提取后需要乙醇沉淀；见下面方法.2. Poly(A)+mRNA大多数Poly(A)+mRNA分离过程都会导致得到较稀浓的RNA，所以需要在cDNA合成前浓缩mRNA.3.沉淀步骤：（1）加1/10体积3M NaOAc,PH5.2,和2.5倍体积乙醇.（2）混匀，-20℃放置最少1小时.（3）4℃,≥12000x g离心20分钟.（4）80%乙醇洗涤沉淀2次.（5）空气干燥沉淀.继续下面步骤前检查是否干燥.（6）DEPC处理水重新溶解沉淀.最合适的溶解体积由cDNA合成中需要的RNA的浓度和量来决定.先阅读cDNA合成的过程来决定这一步的适合溶解体积.4.RNA测定用分光光度计分析RNA浓度，在260nm 1单位吸光度等于40μg/mlRNA.●需要在260和280nm测定吸光度来确定样品的浓度和纯度●A260/A280应接近2.0为较纯的RNA(比值在1.9-2.1也可)<二>由纯化的总RNA合成双链cDNAAFFYMETRIX强烈建议HPLC纯化T7-(d7)24 primer一、第一链cDNA合成开始RNA的量:高质量RNA5.0μg -40.0μg纯化后RNA浓缩由260nm吸光度决定（1单位吸光度=40μg/mlRNA），A260/A280应接近2.0，在1.8-2.1的范围内。
基因芯片的操作流程及步骤
02
基因芯片操作流程
基因芯片的设计与制备
01
02
03
确定目标基因
根据研究目的，确定需要 检测的目标基因或基因组 区域。
设计探针
根据目标基因序列，设计 特异性捕获探针，确保探 针的特异性、灵敏度和稳 定性。
制备芯片
将探针合成并固定在芯片 基质上，形成基因芯片。
样本准备
样本收集
采集待检测样本，如组织、 血液、细胞等。
背景校正
通过特定的算法和技术，对基因芯片中的背景信号进行校正，排除非特异性信号和背景 噪声的干扰，提高数据的准确性和可靠性。
数据分析与结果解读
数据分析
运用统计分析、机器学习等方法，对基 因芯片数据进行深入分析，包括差异表 达基因的筛选、基因功能注释、通路富 集分析等。
VS
结果解读
根据分析结果，结合生物学知识和文献资 料，对基因表达谱进行解释和推理，揭示 基因之间的相互作用和调控关系，为后续 实验提供理论依据和指导。
06
应用实例
基因表达谱分析
目的
了解不同组织或不同生长条件下基因的表达情况，寻找差异表达基 因。
操作步骤
提取组织或细胞的总RNA，逆转录为cDNA，将cDNA标记后与基 因芯片进行杂交，洗涤、检测并分析结果。
注意事项
确保RNA质量、标记效率和杂交条件的优化。
单核苷酸多态性检测
目的
检测基因组中单核苷酸的变异，如SNPs，了解遗传变异与疾病的 关系。
交，洗涤、检测并分析结果。
注意事项
03
确保DNA标记效率和杂交条件的优化，注意控制实验条件和背
景噪音。
THANKS
感谢观看
核酸提取
从样本中提取出所需的核 酸（DNA或RNA）。
基因芯片的操作流程及步骤
基因芯片的操作流程及步骤基因芯片是一种用于检测和分析基因表达的高通量技术。
它能够同时检测上万个基因，在生物医学研究、生物工程和临床诊断等领域具有重要的应用价值。
基因芯片的操作流程主要包括前处理、杂交、显像和数据分析等步骤。
下面是详细的操作流程及各步骤的介绍。
1.前处理：a.提取RNA：从细胞或组织中提取总RNA，可以使用常规的酚/氯仿法或者商业化的RNA提取试剂盒等方法。
b.反转录：使用反转录酶将RNA逆转录成cDNA，以便进一步扩增和检测。
这一步骤可以使用随机引物或专用的引物结合反转录酶进行。
2.样品标记：a.样品标记：将cDNA样品标记为荧光基团，例如使用荧光染料dCTP 或其他标记物。
b.去除杂交物：通过水解或其他方法去除未反应的标记试剂，并纯化标记后的cDNA样品。
3.制备探针：a.设计探针：选择适当的探针序列，通常是与待检测基因的特定片段互补的DNA片段，用于检测基因表达。
b.生产探针：使用DNA合成技术或PCR等方法合成大量的探针，通常是固定在玻片上的寡核苷酸序列。
4.杂交：a.样品混合：将标记后的cDNA样品与探针混合，可以加入包含缓冲液、杂交解聚剂等的杂交液。
b.杂交反应：在恒温条件下，将混合物进行杂交反应，使探针与标记的cDNA靶标发生互补反应，形成探针-靶标复合物。
5.洗涤：a.洗涤：使用一系列含有不同浓度盐或洗涤缓冲液的溶液，去除没有结合的或非特异结合的探针-靶标复合物。
b.除去二级结构和非特异结合：使用高盐浓度的洗涤缓冲液或其他特定条件洗涤，去除可能形成的非特异结合和二级结构。
6.显像：a.扫描：使用光学设备测量芯片上的荧光强度，将探针-靶标复合物的检测结果转化为数字信号。
b.校准：对每个荧光信号进行校准，以消除技术偏差和背景噪声。
7.数据分析：a.数据提取：将荧光强度数据转化为基因表达的相对量，通常是使用专门的数据分析软件进行。
b.统计分析：使用统计学方法对基因表达数据进行分析，包括聚类分析、差异表达分析和信号通路分析等。
基因芯片的必备知识和操作流程
基因芯片技术的诞生为生物技术工作人员打开了一道科研的便利之门，曾被评为1998年年度十大科技进展之一。
本文对基因芯片的实验原理、技术基础、分类、用途、操作主要环节等内容做详细的介绍。
基因芯片技术的诞生为生物技术工作人员打开了一道科研的便利之门，曾被评为1998年年度十大科技进展之一。
本文对基因芯片的实验原理、技术基础、分类、用途、操作主要环节等内容做详细的介绍。
1.基本原理和技术基础基因芯片以DNA杂交为基本原理，基于A和T、G和C的互补关系。
它是在探针的基础上研制出的。
所谓探针是一段人工合成或筛选出的已知顺序的碱基序列，样品分子上连接有一些cy3、cy5等可检测的物质。
经激光共聚焦荧光显微镜检出杂交或反应信号，通过计算机处理、分析，即可获得所需信息。
例如，用红、绿荧光分别标记实验样本和对照样本的cDNA，混合后与微阵列杂交，可显示实验样本和对照样本基因的表达强度(显示红色、绿色或黄色)，由此可在同一微阵列上同时检测两样本的基因表达差异。
在基因芯片工作过程中，固定位点使用不同分子生物学技术和碱基互补配对原则与待测基因片段杂交，并通过自动阅读设备分析杂交结果，达到定性、定量分析的目的。
基因芯片通过应用平面微细加工技术和超分子自组装技术，把大量分子检测单元集成在一个微小的固体基片表面，可同时对大量的核酸等生物分子实现高效、快速、低成本的检测和分析。
基因芯片的检测主要建立在放射标记技术、荧光标记技术、质谱分析、化学发光等技术上。
使用荧光标记的基因芯片需要专用的荧光扫描仪。
对于高密度的基因芯片，目前最常用的是激光共聚焦显微镜和高性能的冷却CCD。
目前专用于荧光扫描的扫描仪大致分为两类：一类是基于CCD(charge-coupled device，电荷耦合装置)的检测光子;另一类则是基于PMT(photomultiplier tube，光电倍增管)的检测系统。
生物芯片的发展得益于微细加工技术和现代分子生物技术的结合。
基因芯片的操作流程及步骤
结合患者的基因组信息，基因芯片技术可以 实现疾病的精准诊断，为后续治疗提供指导 。
个性化治疗方案设计
通过分析患者的基因变异信息，可以为每位患者量 身定制个性化的治疗方案，提高治疗效果。
预后评估
基因芯片技术可用于评估患者的预后情况， 为医生制定后续治疗方案提供参考。
06
基因芯片技术挑战与展望
固定化效果检测
通过荧光标记等方法检测 探针的固定化效果，确保 芯片质量。
探针合成与标记
01
探针合成
根据设计序列，通过化学合成方 法合成探针，并进行纯化和质量 控制。
探针标记
02
03
标记效果检测
将合成好的探针进行荧光标记或 其他标记，以便于后续的信号检 测。
通过荧光扫描仪等设备检测探针 的标记效果，确保标记成功且均 匀。
VS
意义
基因芯片技术的出现和发展为生命科学研 究和医学诊断等领域带来了革命性的变革 。它不仅提高了检测效率和准确性，还为 我们提供了更加全面和深入的基因信息， 有助于揭示生命活动的本质和规律，为疾 病的预防、诊断和治疗提供更加有效的手 段。
02
基因芯片制备流程
芯片设计与制造
芯片类型选择
根据实验需求，选择合适的芯片类型，如cDNA芯 片、寡核苷酸芯片等。
质量控制与标准化管理
1 2
实验设计
制定合理的实验设计方案，包括样本选择、实验 重复次数等，以确保实验结果的可靠性和可重复 性。
标准化操作
建立标准化的实验操作流程和质量控制标准，确 保实验过程中各项操作的准确性和一致性。
3
数据质量评估
采用多种方法对实验数据进行质量评估，如信噪 比、动态范围、重复性等指标，以确保数据的准 确性和可靠性。
基因芯片的原理和流程
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AFFYMETRIX基因芯片操作流程
AFFYMETRIX基因芯片操作流程1.设计芯片：根据研究需求，设计基因芯片的探针序列。
探针序列是一小段DNA或RNA序列，用于检测芯片上的特定基因。
通常，基因芯片上会有上万个探针，可以检测大量的基因。
2.提取RNA或DNA：从感兴趣的生物样本中提取总RNA或基因组DNA。
RNA或DNA提取的方法会根据具体的研究目的和样本类型而有所不同。
3.RNA/DNA标记：将提取的RNA或DNA样本进行标记。
在基因芯片研究中，常使用荧光标记的核苷酸来标记RNA或DNA。
标记的方法可以是直接标记或间接标记，具体选择取决于实验的设计和要求。
4.混合和杂交：将标记的RNA或DNA样本与设计好的探针序列混合，形成杂交溶液。
杂交时，样本中的标记的RNA或DNA会与芯片上的相应探针序列结合。
5.洗涤和扫描：对芯片进行洗涤去除杂质，然后使用芯片扫描仪对芯片进行扫描。
扫描会产生荧光图像，显示不同基因的表达水平或基因变异情况。
6.数据分析：使用专门的数据分析软件对扫描后的图像进行处理和分析。
这些软件可以提供丰富的数据分析工具，包括基因表达聚类、差异分析、通路分析等。
通过数据分析，可以得到关于基因表达的定量和质量信息。
7.结果解读：根据数据分析的结果，解读实验结果。
通过比较不同样本之间的基因表达差异，可以找到与研究目的相关的基因。
根据差异基因的功能注释和通路分析等，可以深入了解基因的作用和功能。
8. 结果验证：将一部分差异表达的基因进行验证实验，如RT-PCR、Northern blot等。
验证实验可以进一步确认基因表达的差异，并验证基因芯片分析的可靠性。
通过以上步骤，AFFYMETRIX基因芯片可以帮助研究人员高通量、高效率地研究基因的表达水平和基因变异等生物过程。
同时，数据分析和结果解读对于科研的深入和扎实也非常重要。
基因芯片的必备知识和操作流程
基因芯片技术的诞生为生物技术工作人员打开了一道科研的便利之门，曾被评为1998年年度十大科技进展之一。
本文对基因芯片的实验原理、技术基础、分类、用途、操作主要环节等内容做详细的介绍。
基因芯片技术的诞生为生物技术工作人员打开了一道科研的便利之门，曾被评为1998年年度十大科技进展之一。
本文对基因芯片的实验原理、技术基础、分类、用途、操作主要环节等内容做详细的介绍。
1.基本原理和技术基础基因芯片以DNA杂交为基本原理，基于A和T、G和C的互补关系。
它是在探针的基础上研制出的。
所谓探针是一段人工合成或筛选出的已知顺序的碱基序列，样品分子上连接有一些cy3、cy5等可检测的物质。
经激光共聚焦荧光显微镜检出杂交或反应信号，通过计算机处理、分析，即可获得所需信息。
例如，用红、绿荧光分别标记实验样本和对照样本的cDNA，混合后与微阵列杂交，可显示实验样本和对照样本基因的表达强度(显示红色、绿色或黄色)，由此可在同一微阵列上同时检测两样本的基因表达差异。
在基因芯片工作过程中，固定位点使用不同分子生物学技术和碱基互补配对原则与待测基因片段杂交，并通过自动阅读设备分析杂交结果，达到定性、定量分析的目的。
基因芯片通过应用平面微细加工技术和超分子自组装技术，把大量分子检测单元集成在一个微小的固体基片表面，可同时对大量的核酸等生物分子实现高效、快速、低成本的检测和分析。
基因芯片的检测主要建立在放射标记技术、荧光标记技术、质谱分析、化学发光等技术上。
使用荧光标记的基因芯片需要专用的荧光扫描仪。
对于高密度的基因芯片，目前最常用的是激光共聚焦显微镜和高性能的冷却CCD。
目前专用于荧光扫描的扫描仪大致分为两类：一类是基于CCD(charge-coupled device，电荷耦合装置)的检测光子;另一类则是基于PMT(photomultiplier tube，光电倍增管)的检测系统。
生物芯片的发展得益于微细加工技术和现代分子生物技术的结合。
基因芯片构建流程
基因芯片构建流程以基因芯片构建流程为标题，本文将介绍基因芯片构建的整体流程，包括样本准备、核酸提取、RNA逆转录、cDNA合成、芯片杂交、芯片扫描和数据分析等环节。
一、样本准备在基因芯片构建之前，首先需要准备好样本。
样本可以是来自不同生物体的组织、细胞或血液等。
样本的选择要根据实验的目的来确定，确保样本的质量和数量足够满足实验需求。
二、核酸提取核酸提取是基因芯片构建的重要步骤之一。
通过核酸提取可以将样本中的DNA或RNA分离出来。
核酸提取的方法有多种，常用的包括酚氯仿法、离心柱法、磁珠法等。
在进行核酸提取时，需要注意避免样本受到污染，保证提取得到的核酸的纯度和完整性。
三、RNA逆转录在基因芯片构建过程中，如果需要研究基因的表达情况，通常需要将RNA转录成cDNA。
这一步骤称为RNA逆转录。
逆转录过程中需要使用逆转录酶将RNA转录成cDNA。
此外，还可以添加一些引物和酶来进行扩增，以增加cDNA的数量。
四、cDNA合成经过RNA逆转录后得到的cDNA可以用于后续的芯片杂交。
在cDNA合成过程中，可以使用一些特定的引物和酶来合成需要的cDNA。
合成的cDNA需要经过检测，确保质量合格。
五、芯片杂交芯片杂交是基因芯片构建的核心环节之一。
在芯片杂交过程中，将合成的cDNA标记上荧光标记物后与芯片上的探针进行杂交。
杂交的目的是使样本中的cDNA与芯片上的探针结合，从而测量基因的表达水平。
杂交完成后，需要对芯片进行洗涤以去除杂质。
六、芯片扫描芯片杂交完成后，需要使用芯片扫描仪对芯片进行扫描。
扫描的目的是读取芯片上的荧光信号，从而获取基因表达水平的数据。
扫描的过程中需要注意参数的设置，以确保数据的准确性和可靠性。
七、数据分析芯片扫描完成后得到的数据需要进行进一步的分析。
数据分析可以包括差异表达基因的筛选、基因功能注释、通路分析等。
数据分析的方法有很多种，可以使用统计学方法、生物信息学工具等进行分析。
数据分析的结果将有助于我们理解基因的功能和表达调控机制。
基因芯片构建流程
基因芯片构建流程基因芯片是一种用于检测和分析大量基因表达的高通量技术。
它通过将成千上万个探针固定在芯片上，可以同时检测多个基因的表达水平。
下面将详细描述基因芯片的构建流程。
1. 设计探针设计探针是基因芯片构建的第一步。
探针是一种短小的DNA片段，用于特异性地检测目标基因。
在设计探针时，需要考虑以下几个方面：•目标基因序列：确定要检测的目标基因序列。
•探针长度：通常选择15-70个碱基对作为探针长度。
•特异性：确保探针与目标基因序列具有高度特异性，避免与其他非目标序列杂交。
•互补性：确保探针与目标基因序列具有适当的互补性，以便能够稳定结合。
2. 合成探针合成探针是将设计好的探针通过化学合成的方法制备出来。
合成方法通常使用固相合成技术，即将核苷酸单体逐个添加到固相载体上，通过化学反应形成探针。
合成探针的质量控制非常重要，通常使用质谱和凝胶电泳等方法进行检验。
确保探针的纯度和长度符合要求。
3. 探针固定探针固定是将合成好的探针固定在基因芯片表面。
通常使用玻璃片或硅片作为芯片基底，并在表面涂覆一层特殊的化学物质，用于固定探针。
在探针固定过程中，需要注意以下几个方面：•密度控制：控制每个位置上的探针密度，避免过高或过低。
•均匀性：确保每个位置上的探针分布均匀，避免出现簇集现象。
•固定效果：确保探针能够牢固地固定在芯片表面，不易脱落。
4. 样品制备样品制备是基因芯片实验的关键步骤之一。
样品可以是RNA、DNA或蛋白质等生物分子。
样品制备过程中需要注意以下几个方面：•提取：从细胞或组织中提取目标分子，通常使用离心、超声波或化学法等方法。
•纯化：对提取得到的样品进行纯化，去除杂质和干扰物质。
•标记：将样品标记为荧光或放射性等信号，以便能够在芯片上检测到。
5. 样品杂交样品杂交是将标记好的样品与基因芯片上的探针进行杂交反应。
在样品杂交过程中，需要注意以下几个方面：•温度控制：控制杂交反应的温度，使之适合探针和样品的结合。
液相基因芯片操作流程-protocol
芯片实验流程注意事项：1.不要用TE溶解氨基标记的探针，用分子生物级水。
2.EDC极易潮解，避免在冰冷情况下打开瓶盖。
3. 偶联反应在很短时间内即可发生，在加入EDC后迅速涡旋振荡。
4. Beads尽量避光，用锡纸包裹或用棕色EP管。
5. 用头比较细的吸头或凝胶上样的吸头弃上清。
试剂1.1偶联：EDC；MES (25g)；5N NaOH；Tween 20；10%SDS；Tris EDTA buffer（TE），pH8.0，100ⅹ；分子生物级水；需配置试剂：0.1M MES pH4.5：4.88g溶于250ml水中，调pH至4.5，0.22um过滤除菌，4℃保存。
（MES必须为分子生物学级）。
0.02％ Tween 20（洗液）：20ul加入250ml水中，0.22um过滤除菌，室温保存。
0.1％SDS:2.5ml 10％SDS溶液加入247.5ml中，0.22um过滤除菌，室温保存。
TE pH8.0(样品稀释液)：100ⅹTris EDTA buffer（TE），pH8.0 2.5ml加247.5ml水中，0.22um过滤除菌，室温保存。
5N NaOH：4gNaOH溶于80ml水中，别溶解边搅拌，最后定容于100ml。
1.2杂交Sarkosyl（50g）；5M TMAC; SA-PE 1mg/ml（1mg）需配置试剂：20％Sarkosyl: 50g用水溶解后，定容于250ml，0.22um过滤除菌，室温保存。
1.5ⅹTMAC：450ml 5M TMAC3.76ml 20％Sarkosyl37.5ml1M Tris－HCl，pH8.06.00ml 0.5M EDTA, pH8.02.74ml H2O室温保存。
1ⅹTMAC：1.5ⅹTMAC 167mlH2O 83ml室温保存。
1.3操作步骤2.1 偶联2.1.1 准备试剂2.1.1.1探针：浓度为0.1nmol/ul，用分子生物级水溶解，不可用TE。
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2.基因芯片的基本原理分析
• 任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解为一个序列 固定、错落而重叠的寡核苷酸，又称亚序列 （subsequence）。例如可把寡核苷酸序列 TTAGCTCATATG分解成5个8 nt亚序列：
• 这5个亚序列依次错开一个碱基而重叠7个碱基。 • 亚序列中A、T、C、G 4个碱基自由组合而形成的所有可 能的序列共有65536种。 • 假如只考虑完全互补的杂交，那么48个8 nt亚序列探针中， 仅有上述5个能同靶DNA杂交。 • 可以用人工合成的已知序列的所有可能的n体寡核苷酸探 针与一个未知的荧光标记DNA/RNA序列杂交，通过对杂 交荧光信号检测，检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸， 从而推出靶DNA中的所有8 nt亚序列，最后由计算机对大 量荧光信号的谱型（pattern）数据进行分析，重构靶 DNA 的互补寡核苷酸序列。
• 目前，我国尚未有较成型的基因芯片问世，但据 悉已有几家单位组织人力物力从事该技术的研制 工作，并取得了一些可喜的进展。标志着我国相 关学科与技术正在走向成熟。
• 涉及领域：生命科学、计算机科学、精密机械科 学
生物芯片分类
• 根据用途还可以把生物芯片分为两类：信息生物芯片 （information-biochip）和功能生物芯片（functionbiochip）。
1 CELL =23 PAIRS OF CHROMOSOMES
23 PAIRS OF CHROMOSOMES =~ 3,200,000,000 BASES
1 HUMAN BODY =100,000,000,000,000 CELLS
基因芯片结构示意图
生物芯片的制作步骤
细胞
对mRNA进行标记 杂交 基因表达资料
三、 基因芯片设计步骤
1. 基因芯片设计的一般性原则 基因芯片设计主要包括两个方面: 1. 探针的设计
–
指如何选择芯片上的探针
2. 探针在芯片上的布局
– 指如何将探针排布在芯片上。
• 确定芯片所要检测的目标对象
– 查询生物分子数据库
取得相应的DNA序列数据
– 序列对比分析
找出特征序列，作为芯片设计的参照序列。
薄膜型、玻片型
微板型
集成电路型
基因芯片 /DNA 微阵列
Gene Chip /DNA Microarray
第二节、基因芯片技术
核酸杂交技术 是基因芯片应用的基础。
核酸体外杂交技术
表达型基因芯片的设计
一、基因芯片（DNA微阵列）
寡核苷酸芯片、cDNA芯片、Genomic芯片 模式一：是将靶DNA固定于支持物上，适
原理 -- 通过杂交检测信息
一组寡核苷酸探针
TACGTTAG ATACGTTA
由杂交位置确定的一组 核酸探针序列
ATACGTTA TACGTTAG ACGTTAGA CGTTAGAT GTTAGATC
杂交探针组
ACGTTAGA
—TATGCAATCTAG
CGTTAGAT GTTAGATC
ATACGTTAGATC
芯片杂交
实际应用
数据分析
杂交检测
二、 基因芯片基本操作流程
• 制备总RNA→ mRNA经RT--PCR用Cy3（正常对照
组）和Cy5（实验组）荧光标记目的基因，得 到cDNA 探针→ 混合标记探针→与表达谱芯片 上核苷酸片段（或基因）杂交→扫描→分析杂 交结果→结论
• 载体+寡核苷酸-探针分子+荧光染料-点样仪扫描仪-计算机+专业软件
把大量分子检测单元集成在一个微 小的固体基片表面，可同时对大量 的核酸和蛋白质等生物分子实现高 效、快速、低成本的检测和分析。
基因芯片原型
主要类型
• 多种方法将寡核苷酸或短肽 • 固定到固相支持物上 • 原位合成（in situ synthesis） • 合成点样 • 支持物：玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙 膜等
例 基于芯片的基因测序
基因芯片流程（二）
4. 芯片杂交（将用Cy3和Cy5荧光标记的对照组 和实验组的cDNA 等量混合，与芯片进行杂交）
5. 芯片扫描（采用激光扫描仪，分别用532nm 和635nm波长激光扫描芯片，对于每张芯片， 得到Cy3和Cy5通道两幅图象）
cDNA spotted microarrays
8. 目的基因或序列的确定（采用ratio值对差 异基因进行判断，或采用统计方法如线性 回归、主成分分析、调整P值算法等对差 异基因进行统计推断）
9. 生物信息学分析（如cluster 算法、差异基 因的同源性比对，差异基因的相关文献检 索等）
微流控芯片检测仪
基因芯片的阅读分析系统
芯片扫描仪
芯片杂交盒
重组的互补序列 靶序列
TATGCAATCTAG
荧光标记的样品
共聚焦显微镜
基因芯片
获取荧光图象
杂交
探针设计 杂交结果分析
基因芯片的相关技术示意图
提出问题
芯片设计
芯片制作
点样方法 ● 在片合成
●
表达差异分析 ●多态性分析 ●再测序
●
生物信息学 ●数学优化 ●数据库
●
试样处理
PCR扩增 ●靶基因标记
●
计算机科学、微电子技术 光电技术、材料科学 等现代高 科技。
4.我国主要研究单位
• 中科院遗传所人类基因组中心 • 北京大学 • 联合基因集团有限公司
我国第一家批量生产基因 芯片 拥有近2千条基因药物发明专利
• 东南大学吴健雄实验室 • 中科院计算所生物信息学实验室 • 上海生科院
我国基因芯片的研究现状
原位合成 光导原位合成法 原位喷印合成 针式点样
基因芯片的制 作方式 直接点样
喷墨点样 分子印章法
原位合成法
• 主要为光引导聚合技术（Light-directed synthesis），不仅可用于寡 核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。
• • • • 主要步骤为： 首先使支持物羟基化，并用光敏保护基团将其保护起来。 每次选取适当的蔽光膜（mask）使需要聚合的部位透光，其他部位不透光。 每次通过控制蔽光膜的图案（透光与不透光）决定哪些区域应被活化，以及 所用单体的种类和反应次序就可以实现在待定位点合成大量预定序列寡聚体 的目的。
合于大量不同靶DNA的分析，
模式二：将大量探针分子固定于支持物上，
适合对同一靶DNA进行不同探针序列的分
析。
1.基因芯片原理
基因芯片是在基因探针的基础上研制出的。它
将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品 进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分 析。基因芯片把大量分子检测单元集成在一个微小的 固体基片表面，可同时对大量的核酸和蛋白质等生物 分子实现高效、快速、低成本的检测和分析。 基因芯片技术是建立在Southern blot基础之上的， 可以说它是Southern blot的改进和发展，它的原理是： 变性DNA 加入探针后在一定温度下退火，同源片段之 间通过碱基互补形成双链杂交分子。
基因芯片又称DNA微阵列 （DNAmicroarray）
• 三种主要类型：
• 1）固定在聚合物基片（尼龙膜、硝酸纤维膜等）表面上的核酸探针 或cDNA片段——通过同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技 术进行检测 • 2）用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列——通过与荧光标记的靶 基因杂交进行检测 • 3）在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列——与荧光标 记的靶基因杂交进行检测
2、光导原位合成法
• 是在经过处理的载玻片表面铺上一层连接分子（linker）， 其羟基上加有光敏保护基团，可用光照除去，用特制的光 刻掩膜（photolithographic mask）保护不需要合成的 部位，而暴露合成部位，在光作用下去除羟基上的保护基 团，游离羟基，利用化学反应加上第一个核苷酸，所加核 苷酸种类及在芯片上的部位预先设定，所引入的核苷酸带 有光敏保护基团，以便下一步合成。然后按上述方法在其 它位点加上另外三种核苷酸完成第一位核苷酸的合成，因 而N个核苷酸长的芯片需要4N个步骤。每一个独特序列的 探针称为一个“feature”，这样的芯片便具有4N个 “feature”，包含了全部长度为N的核苷酸序列。 • 这种原位直接合成的方法无须制备处理克隆和PCR产物， 但是每轮反应所需设计的光栅则是主要的经费消耗。运用 这种方法制作的芯片密度可高达106探针/平方厘米，即探 针间隔为 5－10μm，但只能制作II型 DNA芯片。
一次性对样品大量序列进行检测和分析，解决了 传统核酸印迹杂交（Southern Blotting和 Northern Blotting等）技术操作繁杂、自动化 程序低、操作序列数量少、检测效率低等不足。
检测每个探针分子 的杂交信号强度
获取样品分子的 数量和序列信息
基因芯片是信息时代的产物
横跨：生命科学、物理学、
– 数据库搜索
• 得到关于序列突变的信息及其它信息。
• 在进行探针设计和布局时必须考虑以下 几个方面： (1)互补性 (2)敏感性和特异性 (3)容错性 (4)可靠性 (5)可控性 (6)可读性
基因芯片使用步骤
芯片制作
样品处理
把探针固定于载体表面
目标分子富集
分子间的杂交 结果检测与数据分析
原位光蚀刻合成
基因芯片流程
样品制备 杂交 芯片制备
杂交信号检测
数据分析
基因芯片的操作流程
基因芯片流程（一）
1. 实验设计 2. 样品制备（指mRNA或总RNA样品，包括对 照组和实验组。将mRNA或总RNA分别进行 逆转录生成cDNA，然后将对照组和实验组 cDNA分别标记Cy3和Cy5荧光信号） 3. 芯片制备（寡核苷酸探针或 cDNA探针，包 括PCR，纯化，点样等步骤）
基因芯片研制的总体蓝图