质粒转化、细胞转染步骤
双荧光素酶报告实验质粒转染详细步骤及说明
双荧光素酶报告实验质粒转染详细步骤及说明
1. 待测细胞在10 cm dish 中培养至80-90% 融合时，倾去培养液，用2ml PBS 洗涤细胞两次；
2. 加1ml Trypsin-EDTA solution, 混匀后，小心吸去胰酶溶液，37ºC 放置1-5分钟；
3. 加入2 ml 完全培养基，吹打使细胞形成单细胞悬液；
4. 血球计数板计数，将细胞稀释至1×10 6 细胞/ml；
5. 取100 μl 上述细胞稀释液加入96 孔板，使细胞密度达到1×10 5 个细胞/孔，混匀后于37ºC 5% CO 2 培养24 小时；
6. 在3 个1.5 ml EP 管中各加入50 μl 无血清培养基，分别加入0.2 μg，0.4 μg，0.8 μgpEX-1 质粒，混匀；取另一1.5 ml EP 管，加入150 μl 无血清DMEM，加入1.5 μl 转染试剂，充分混匀，室温放置5 分钟后将150 μl 平均3 等份对应加入含有质粒的3个EP 管，充分混合，室温放置20 分钟；
7. 吸去96 孔板中的培养液，将转染混合物逐滴加入96 孔板中，混匀后，在培养箱中
温育5 小时；
8. 吸弃转染液，加入100 μl 完全培养液。
37ºC 5% CO 2 继续培养, 24h 和48h 观察并拍照质粒转染效果图片。
转染详细步骤大攻略
转染详细步骤大攻略范例----真核重组表达质粒pDsRed-N1-NS1在A549细胞中表达按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，测得质粒浓度为410.32ng/µl。
将培养的A549细胞铺板，待细胞密度长到90%左右时，按lipo2000说明书转染A549细胞，36h后于荧光显微镜下观察DsRed-NS1融合蛋白的表达情况。
具体操作步骤如下：1）质粒准备按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，具体步骤如下：(1) 取1-5ml细菌培养物，12000rpm离心1 min,尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
(2) 向留有菌体沉淀的离心管中加入200µl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA）,使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
（注：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低）(3)向离心管中加入200µl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
（注：混匀一定要温和，以免污染基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏）(4)向离心管中加入250µl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。
12000rpm 离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。
（注：溶液P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。
如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清）(5)加入1/5体积冰预冷的去内毒素清除剂，振荡混匀，溶液变浑浊，冰浴2min 至溶液变清亮。
(6)37℃水浴5 min，不时振荡，溶液又变浑浊。
12000rpm室温离心5min，溶液应分为两相，上层水相含质粒DNA，下层油状相含内毒素。
(7)将质粒DNA上层水相转移至新管，弃下层油状相，注意不要吸入油状相，重复抽提三次，即重复步骤5-7三次。
质粒转化、细胞转染步骤
质粒转化、细胞转染步骤
转化是指将外源DNA（常以质粒作为载体）导入受体细
胞（如大肠杆菌），从而使其获得新的遗传特性。
具体步骤如下：首先将12ul的质粒DNA加入50ul感受态cell中，轻柔混合后进行冰浴30min。
接着向管中加入培养基，混匀后使细菌
恢复正常生长状态。
然后在42℃下热激90s，迅速冰浴2min，最后在37℃下震荡培养（﹤225rpm）1h，使细菌获得新的遗
传特性。
转染（n）是将含有目的基因的载体转移到真核细胞内的
过程。
在进行质粒转染时，需要先将6-well-plate中的每个孔
培养至60-70%的状态。
然后在接种时每个孔加入2.5×105个
/ml的细胞。
接下来，将2.5ug质粒DNA和200ul的opti-
MEM混合，再加入6ul的转染液进行混匀，并在室温下静置
15min。
待转染细胞换成1.3ml的opti-MEM培养基后，将转
染复合物（200ul）轻轻均匀滴入细胞培养基中，并十字形摇
晃6-well-plate以混匀转染复合物。
最后将6-well-plate放入37℃、CO2培养箱中进行培养。
质粒转染技术
质粒转染技术质粒转染技术是现代生命科学研究中常用的实验手段之一，广泛应用于基因工程、细胞生物学、分子生物学等领域。
本文将从质粒转染技术的原理、方法和应用等方面进行介绍。
一、质粒转染技术的原理质粒转染技术是指将外源质粒DNA导入到细胞内的一种方法。
质粒是一种环状DNA分子，具有自主复制和表达基因的能力。
质粒转染技术通过将质粒DNA导入到细胞内，使其在细胞内复制和表达，从而实现对目标基因的研究和应用。
1. 化学法转染：化学法转染是最常用的质粒转染方法之一。
其基本原理是利用化学物质（如聚合物、脂质体等）与质粒DNA结合，形成复合物后与细胞膜发生相互作用，使质粒DNA进入细胞内。
这种方法操作简单、成本低廉，适用于大多数细胞类型。
2. 电穿孔法转染：电穿孔法利用高压电脉冲的作用，瞬时破坏细胞膜，使质粒DNA能够进入细胞内。
这种方法适用于多种细胞类型，转染效率较高，但操作较为复杂。
3. 粒子轰击法转染：粒子轰击法利用高速粒子（如金属微粒）的撞击作用，将质粒DNA导入细胞内。
这种方法适用于质粒DNA较大、难以通过其他转染方法的细胞。
三、质粒转染技术的应用1. 基因表达研究：质粒转染技术可用于将外源基因导入细胞，使其在细胞内表达，从而研究基因的结构、功能和调控机制。
2. 基因敲除研究：质粒转染技术结合CRISPR/Cas9等基因编辑技术，可以实现对特定基因的敲除，从而研究该基因的功能。
3. 基因治疗：质粒转染技术可用于将治疗基因导入患者的细胞，修复或替代异常基因，实现基因治疗的目的。
4. 细胞药物递送：质粒转染技术可用于将药物敏感基因导入细胞，使其在细胞内表达，从而增强对药物的敏感性，提高治疗效果。
四、质粒转染技术的进展与挑战随着生命科学研究的不断发展，质粒转染技术也在不断改进和完善。
目前，研究人员正在努力提高转染效率、降低细胞毒性和改善转染的特异性等方面。
同时，也面临着一些挑战，如如何选择合适的转染方法、如何提高质粒的稳定性等问题。
质粒转染-DH5α法
质粒转染-DH5α法
1、解冻DH5α:从-80°C冰箱中取DH5α感受态细胞100ul冰上解冻。
2、加质粒:加100ng,1ul质粒(如果是连接产物全都加入)于感受态DH5α中,
冰上混匀30min。
(超净工作台里面操作)
准备SOC:同时取SOC培养于37°C水箱中预热,待用。
3、热击:将质粒,感受态混合物置于42°C水箱中热击90s
4、恢复:冰上冷却2min。
5、复苏:取预热的SOC培养基于质粒感受态混合物中,摇床摇晃1h.
准备平板:同时取小平板于37°C温箱中预热。
(超净工作台里面操作)
6、涂板子:对于连接产物;低速离心4000rpm×4min,去部分上清,留沉淀约
100ul,重悬,把质粒感受态混合物平涂在小平板上。
倒放平板于37°C温箱中过
夜。
对于质粒,不用离心,取20ul平涂。
Tips:连接产物不离心去上清的话,涂板液体太多,连接产物容易集中。
7、准
备后续的实验:挑板子,小量培养细菌,质粒小抽鉴定。
注意:
1、连接产物比质粒转染效率低,所以加入的量多,热击时间长。
2、用于转染的质粒或者连接产物的体积不能超过感受态细胞体积的15%。
3、用于转化的质粒量在0.1pg-50pg最好,超过50pg转化效率低。
4、热击与离心管的厚度,菌液体积,输入片段大小等直接相关。
一般建议热击45S,时间长,转化效率低。
质粒扩增、提取、转化和转染
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序60质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序一、感受态细菌制备（CaCl2法）1. 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于5ml不加Amp的LB 培养基中，37℃振荡培养过夜（200r/min，至OD=1.5左右）。
2. 取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50ml的LB的三角烧瓶（1%）中，37℃条件下振荡培养2~2.5小时左右（200r/min），使OD600达到0.2~0.4左右（100μl测600nm时OD值）。
3. 将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中，每管10ml，冰上放置10min，4. 4℃条件下，4000r/min离心10分钟，弃上清。
将离心管倒扣在吸水纸上，尽量倒尽管中的培养基。
5. 每管加入预冷的0.1mol/l CaCl2溶液2ml，用枪轻轻吹打，重悬沉淀。
转移到一个离心管中，共8ml。
6. 冰上放置10min后，4℃条件下，4000r/min离心10min。
7. 沉淀用预冷的1.6ml 含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液悬浮。
分装成200μl的小份，共8管（40ml变为1.6ml浓缩25倍），-70℃保存备用。
二、溶液的配置1. LB培养基：1%蛋白胨（typtone）、0.5%酵母提取物（yeast extract）、1%NaCl，即10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH调PH至7.0，在补足水至1L。
高压灭菌20分钟备用。
2. 0.1mol/l的CaCl2溶液：1.1g/100ml，称取1.1g CaCl2，加入双蒸水定容至100ml，滤膜过滤或高压灭菌，分装成10ml/小份，4℃保存。
另取8.5ml+1.5ml已灭菌甘油，甘油含量为15%甘油，分装成1ml/小份（10份）4℃保存。
3. 配置液体培养基时，高压灭菌20min备用；4. 配置固体培养基时+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min。
一般转染操作步骤
一般转染操作步骤
1、稀释转染试剂
将6ul转染试剂FuGENE加到装有90-98ul预热到室温培养基的无菌聚丙乙烯管中，立即混匀，室温放置5min。
注：勿将未稀释的转染试剂FuGENE碰到管壁，造成稀释不充分。
2、制备转染物
加2ug的质粒DNA至稀释的转染试剂中，立即混匀，室温放置15min。
注：勿超过45min，否则影响转染效率。
3、添加转染物至细胞培养液
将2-10ul的转染物加到含有100ul细胞培养液的96孔板中，轻轻吸打或者左右摇晃10-30S以充分混匀。
推荐：5ul作为起始点
4、孵育培养
置于CO2培养箱中，培养24-48h检测。
转染试剂FuGENE：DNA=3:1
质粒DNA浓度：0.2-1 ug/ul
96孔板每孔2-10ul转染物成分：0.15-0.6ul的转染试剂+0.04-0.2ug的质粒DNA。
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序一、感受态细菌制备（CaCl2法）1. 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于5ml不加Amp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜（200r/min，至OD=1.5左右）。
2. 取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50ml的LB的三角烧瓶（1%）中，37℃条件下振荡培养2~2.5小时左右（200r/min），使OD600达到0.2~0.4左右（100μl 测600nm时OD值）。
3. 将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中，每管10ml，冰上放置10min，4. 4℃条件下，4000r/min离心10分钟，弃上清。
将离心管倒扣在吸水纸上，尽量倒尽管中的培养基。
5. 每管加入预冷的0.1mol/l CaCl2溶液2ml，用枪轻轻吹打，重悬沉淀。
转移到一个离心管中，共8ml。
6. 冰上放置10min后，4℃条件下，4000r/min离心10min。
7. 沉淀用预冷的1.6ml 含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液悬浮。
分装成200μl 的小份，共8管（40ml变为1.6ml浓缩25倍），-70℃保存备用。
二、溶液的配置1. LB培养基：1%蛋白胨（typtone）、0.5%酵母提取物（yeast extract）、1%NaCl，即10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH 调PH至7.0，在补足水至1L。
高压灭菌20分钟备用。
2. 0.1mol/l的CaCl2溶液：1.1g/100ml，称取1.1g CaCl2，加入双蒸水定容至100ml，滤膜过滤或高压灭菌，分装成10ml/小份，4℃保存。
另取8.5ml+1.5ml已灭菌甘油，甘油含量为15%甘油，分装成1ml/小份（10份）4℃保存。
3. 配置液体培养基时，高压灭菌20min备用；4. 配置固体培养基时+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min。
质粒转染实验步骤
质粒转染大肠杆菌材料试剂：胰化蛋白胨，酵母提取物，琼脂，胰化蛋白胨，酵母提取物，琼脂，NaCl NaCl NaCl，，NaOH NaOH（调（调pH pH）），氨苄青霉素，卡那霉素，质粒提取试剂盒仪器：高压灭菌锅，4242℃恒温水浴锅，℃恒温水浴锅，，恒温摇床（3737℃℃,225rpm ,225rpm）），无菌培养板，消毒1.5ml 离心管，消毒枪头，无菌操作台实验步骤：1. LB 培养基的配制：在950 ml 去离子水中加入去离子水中加入: :胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质溶解动容器直至溶质溶解..用5mol/LNaOH 调pH 至7.0.7.0.用去离子水定容至用去离子水定容至1L.1L.在在15psi 高压下蒸汽灭菌20min.固态培养基LB 固体培养基及倒板 ：（1）.配制：配制：100mlLB 100mlLB 培养基加入1.5g 琼脂粉（2）.抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB 固体培养基置与5555℃的水浴中，待培℃的水浴中，待培养基温度降到5555℃时（手可触摸）加入氨苄抗生素（终浓度为℃时（手可触摸）加入氨苄抗生素（终浓度为5050μμg/ml g/ml）），以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。
（3）.倒板：一般10ml 倒1个板子。
培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。
（4）.保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。
2. 从-70-70℃冰箱中取℃冰箱中取200μl 感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。
3. 加入质粒DNA 溶液（含量不超过50ng 50ng，体积不超过，体积不超过10μl），轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。
4. 4242℃水浴中热击℃水浴中热击45s/90s ，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
5. 向管中加入1ml LB 液体培养基（不含Amp ），混匀后3737℃振荡培养℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr Ampr ）。
基因编辑质粒载体体外转录 RNA 转染细胞方法
基因编辑质粒载体/ 体外转录RNA 转染细胞方法基因编辑载体/体外转录RNA可以使用多种转染试剂进行转染,具体实验方法请参考试剂说明，这里以使用lipofectamin2000为例。
1) 以24 孔培养板操作为例（其他孔板各种的试剂用量，请参照“Lipofectamine2000 manual”），转染前一天，将0.5~2×10 5个细胞接种于培养板中，每孔中加入约500 μL 无抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到30~50％；2) 取1 μL/ 孔Lipofectamine2000（使用前轻轻摇匀），用50 μL Opti-MEM I Reduced Serum Medium 稀释。
轻轻混和后在室温孵育5 分钟；3) 取1 μg 质粒载体/ 体外转录RNA，用50 μL Opti-MEM I Reduced Serum Medium 稀释，轻轻混和均匀;4) 稀释后的Lipofectamine2000 经过5 分钟孵育后，与稀释后的质粒载体/ 体外转录RNA 轻轻混和，室温静置20 分钟，以形成载体- 转染试剂混和物/RNA- 转染试剂混和物；注意：稀释后的Lipofectamine2000 尽量在25 分钟之内，和质粒载体/ 体外转录RNA 混和，如果放置时间过长，可能导致转染试剂活性的降低。
5) 将载体- 转染试剂混和液/RNA- 转染试剂混和物加入含有细胞及培养液（约含400 μL）的孔中，轻轻摇晃孔板，使其混和；6) 在37 ℃的CO 2 培养箱中培养，4~6 小时后可将培养基换为含血清的完全培养基( 该步骤可以省略)；7) 如果载体含荧光基因，转染24 小时后即可在荧光显微镜下观察到荧光，一般转染后72 小时，收集细胞检测突变。
转染24~48小时后可利用载体表达荧光，通过流式细胞仪富集转染细胞，或通过载体表达puro，通过抗性富集转染细胞。
如果体外转录RNA 为荧光基因mRNA，转染6 小时后即可在荧光显微镜下观察到荧光，24~48 小时荧光强度较强，48 小时之后荧光强度逐渐降低，到120 小时基本消失。
质粒转化细胞转染步骤
质粒转化细胞转染步骤质粒转化和细胞转染是两种常用的实验技术，用于将外源DNA引入到细胞中。
一般情况下，质粒转化用于细菌细胞，而细胞转染适用于非细菌的真核细胞。
以下将详细介绍质粒转化和细胞转染的步骤。
一、质粒转化质粒转化是将外源质粒DNA转移到细菌细胞中。
它通常与革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌）一起使用，并且可以通过化学法、热冲击法或电穿孔法进行。
1.预处理细菌细胞：将细菌单克隆培养在含有抗生素的培养基中，以筛选出含有质粒的细胞。
通常使用革兰氏阴性细菌如大肠杆菌。
2.质粒DNA处理：将质粒DNA与细菌细胞一起孵育，以促进质粒与细菌细胞的结合。
孵育时间和孵育条件取决于所使用的方法。
3.转化：将孵育混合物涂布在含有适当营养物和抗生素的琼脂平板上，使质粒转移到接收细胞中。
4.筛选和鉴定：根据在琼脂平板上形成的菌落的形态、大小、颜色等特征进行筛选。
同时，还可以通过PCR、限制性酶切、测序等方法鉴定是否成功转化。
二、细胞转染细胞转染是将外源DNA引入到真核细胞中。
常见的方法包括化学转染、电穿孔转染和病毒载体转染。
1.预处理细胞：将目标细胞培养在适当的培养基中，使其达到适宜的生长状态。
2.DNA和转染试剂处理：将外源DNA与转染试剂（如转染剂、细胞渗透剂等）共同孵育，以增加DNA进入细胞的效率。
3.转染：将DNA和转染试剂的混合物加入到细胞培养物中，启动转染过程。
不同的转染方法有不同的具体操作步骤，如化学转染通过溶液浸泡法将DNA引入细胞，电穿孔转染通过电脉冲打开细胞膜孔，病毒载体转染通过病毒感染细胞等。
4.培养和筛选：将转染后的细胞培养在适宜的培养条件下，保证其正常生长。
根据转移的DNA携带的标记或筛选标志基因，使用特定的培养基或抗生素进行筛选。
5.鉴定：通过PCR、蛋白质表达分析、荧光染色等方法检测外源DNA 是否成功进入细胞，并得到所需的表达或功能。
综上所述，质粒转化和细胞转染是两种将外源DNA引入到细胞中的常见方法。
脂质体转染实验步骤和细胞转染技术总述
脂质体转染实验步骤和细胞转染技术总述
一、脂质体转染实验步骤
1）细胞处理：细胞培养，细胞脱落，细胞悬液浓缩；
2）添加脂质体：将DNA与相应脂质体混合，可以将DNA结合到脂质体上；
3）细胞接种：将脂质体/DNA混合物接种到细胞悬液中，使DNA能够被细胞吞噬；
4）转染放置：将接种混合物保持在室温静置一定的时间，从而使DNA能够被细胞吞噬；
5）细胞活化：在静置期间，DNA会被细胞内吞噬，当添加激活剂和营养培养基时，细胞会活化；
6）细胞培养：在细胞活化后，细胞会被培养，并进行观察，以评估DNA转染的效果；
7）细胞收集：在培养过程中，可以通过浓缩细胞悬液，将转染后的细胞收集起来，以便进行其他分析。
细胞转染是将外源DNA片段转染到细胞中，从而改变其基因表达的技术。
目前常用的细胞转染技术有电转染、磁珠转染、质粒转染、脂质体转染等。
1）电转染
电染是一种最常用的染技术，即通过将DNA片段置于细胞悬液中，然后用微电流刺激，使DNA片段直接进入细胞。
质粒转染文档
质粒转染简介质粒转染是一种将外源质粒导入到目标细胞中的技术。
质粒转染广泛应用于分子生物学和基因工程研究中，可以用于基因功能研究、基因治疗以及表达外源蛋白等方面。
本文将介绍质粒转染的原理、方法和一些常用的实验技术。
原理质粒转染主要依靠质粒与细胞之间的相互作用来实现。
一般情况下，质粒会通过不同的转染方法被导入到细胞内，然后在细胞内复制和转录。
而转染后的质粒可以携带外源基因或其他功能序列，使细胞表达这些外源物质。
转染方法常见的质粒转染方法主要包括化学法、电穿孔法和病毒介导法。
化学法化学法是将质粒与转染试剂一起处理，使质粒能够穿过细胞膜进入细胞内。
常见的化学转染试剂包括聚乙烯亚胺（PEI）、脂质体和钙磷共沉淀等。
这些试剂能够与DNA形成复合物，通过与细胞膜相互作用，使质粒进入细胞质。
电穿孔法电穿孔法通过施加高电压脉冲使细胞膜发生短暂的孔穴，从而使质粒能够进入细胞。
这种方法可以通过电击法或电渗透法来实现。
电击法是将细胞悬浮在含有质粒的溶液中，然后施加高压脉冲使细胞膜发生短暂裂开，使质粒进入细胞质。
电渗透法是将细胞与含有质粒的溶液一同置于电穿孔仪中，通过电流作用使质粒进入细胞。
病毒介导法病毒介导法是使用病毒作为质粒的载体，通过病毒感染细胞来实现质粒转染。
常见的病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒和整合子病毒等。
这些病毒能够感染细胞并将质粒导入细胞内，使细胞表达质粒中的外源基因。
实验技术质粒提取质粒提取是质粒转染前的一项重要步骤。
质粒提取可以通过碱裂解法或商用试剂盒等方法来实现。
碱裂解法是将菌落或培养物中的质粒与碱性溶液混合，然后进行离心，将质粒沉淀。
商用试剂盒则提供了一种简便快速的质粒提取方法，通过试剂盒中提供的缓冲液和柱子等物品进行操作。
转染优化质粒转染过程中，为了提高质粒转染效率，可以进行一些转染优化的操作。
例如，调整转染试剂与质粒的配比、处理时间和细胞密度等因素，可以进一步提高质粒转染效果。
此外，还可以尝试不同的转染方法并比较它们的转染效果，选择最适合的方法进行转染。
质粒提取和纯化及质粒转染所需试剂及操作规范
二、质粒的提取和纯化所需1. 液体LB培养基（1）配方蛋白胨（TRYPONE）1%(g/ml)NaCl1%酵母粉（YEAST EXTRACT）0.5%加蒸馏水定容（2）将配好的培养基高压后，恢复室温后置于4度保存备用，使用时恢复室温（3）配液体LB培养基时，一般不加抗生素（高温会使抗生素失活，也不宜4度保存），因此若要在此培养基中加抗生素，应该在使用时根据比例添加2. 固体LB培养基（1）配方蛋白胨（TRYPONE）1%(g/ml)NaCl1%酵母粉（YEAST EXTRACT）0.5%加蒸馏水定容时（装到可以高压的瓶中），由于加入的琼脂粉有一定的体积，因此定容时，注意略微少加点水，根据要加入的琼脂粉而定（琼脂粉只有在高压后溶解）（2）直接向以上配好的LB中加入加琼脂粉1.5%，以配成固体培养基（3）高压：高压完注意保温，温度过低培养基会凝固，因此从高压锅里取出后应立即铺板（4）铺板此操作在细胞室安全柜中无菌操作，铺板前应提前开紫外灯照台子15min，点燃酒精灯。
若铺的是无抗生素的阴性平板，则在铺板时直接铺板；若铺的是含有抗生素的平板，则在铺板时，应等到高压后的培养基温度降到不烫手时（高温会使抗生素失效），根据比例加入抗生素后在铺板。
培养基铺到平板上，每个平板约25ml，注意保温，一定要在培养基凝固成固体前铺到平板上，铺板时还应不时的摇匀培养基以防止瓶底的培养基因温度过低而凝固，铺好后敞开平板的盖子，待培养基凝成固体后再盖上（约15min）（5）待LB培养基在平板中凝固后，盖上平板的盖子，并用封口膜封好后放到4℃保存备用3. 配置含有抗生素的LB培养基Amp配制时一般为100μg/μl,使用时稀释1000倍Kana配制时一般为50mg/ml，使用时稀释1000倍二、质粒转染真核细胞1、lipo2000（以6孔板转染为例，其他用量请参考说明书）（1）将覆盖率为90-95%的细胞提前用only饥饿3h，转染前换新鲜培养液。
质粒转染技术
质粒转染技术质粒转染技术是一种常用的分子生物学技术，用于将外源基因导入细胞中。
本文将从质粒转染的原理、方法和应用等方面进行详细介绍。
一、质粒转染技术的原理质粒转染是指将质粒DNA导入目标细胞中，使其表达外源基因。
质粒是一种环状的双链DNA分子，通常存在于细菌细胞中，具有自主复制的能力。
质粒转染技术利用质粒的特性，将外源基因插入质粒中，然后通过物理或化学手段使质粒进入细胞内，从而实现外源基因的表达。
1. 钙磷法：将质粒DNA与钙盐形成复合物，然后将复合物添加到细胞培养基中，通过细胞摄取复合物实现质粒转染。
2. 电穿孔法：利用电场作用使细胞膜发生短暂通透，从而使质粒DNA进入细胞内。
3. 热激法：将细胞与质粒DNA进行热激处理，使细胞膜通透性增加，从而实现质粒转染。
4. 脂质体转染法：利用脂质体与质粒DNA形成复合物，然后加入细胞培养基中，通过脂质体与细胞膜的相互作用，使质粒DNA进入细胞内。
三、质粒转染技术的应用1. 基因功能研究：通过转染特定的质粒载体，可以实现对目标基因的过表达、沉默或突变，从而研究基因在细胞中的功能。
2. 基因治疗：将治疗相关的基因载体转染到患者的细胞中，通过表达特定的基因来治疗疾病。
3. 转基因生物制备：通过转染特定的质粒载体，将外源基因导入植物或动物细胞中，从而制备转基因生物。
4. 药物筛选：将药物相关的基因载体转染到细胞中，通过观察外源基因的表达情况，评估药物的疗效。
5. 蛋白表达：将目标蛋白基因载体转染到细胞中，使细胞表达目标蛋白，用于蛋白的纯化和功能研究。
质粒转染技术是一种重要的分子生物学技术，通过将外源基因导入细胞中，实现基因功能研究、基因治疗、转基因生物制备、药物筛选和蛋白表达等应用。
随着技术的不断发展和完善，质粒转染技术将在生物医学研究和生物工程领域发挥越来越重要的作用。
质粒转染实验步骤
质粒转染大肠杆菌材料试剂：胰化蛋白胨，酵母提取物，琼脂，NaCl，NaOH（调pH），氨苄青霉素，卡那霉素，质粒提取试剂盒仪器：高压灭菌锅，42℃恒温水浴锅，，恒温摇床（37℃,225rpm），无菌培养板，消毒1.5ml 离心管，消毒枪头，无菌操作台实验步骤：1.LB培养基的配制：在950 ml去离子水中加入: 胰化蛋白胨10g 酵母提取物5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌20min.固态培养基LB固体培养基及倒板：（1）.配制：100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉（2）.抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入氨苄抗生素（终浓度为50μg/ml），以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。
（3）.倒板：一般10ml倒1个板子。
培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。
（4）.保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。
2.从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。
3.加入质粒DNA溶液（含量不超过50ng，体积不超过10μl），轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。
4.42℃水浴中热击45s/90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
5.向管中加入1ml LB液体培养基（不含Amp），混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr ）。
6.将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。
同时做两个对照：对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。
此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
对照组2：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
将重组质粒导入受体细胞的方法
将重组质粒导入受体细胞的方法将重组质粒导入受体细胞是一种常用的分子生物学实验技术，用于将外源基因导入受体细胞内，以实现基因表达或功能研究。
下面将介绍几种常用的重组质粒导入受体细胞的方法。
一、化学转染法化学转染法是一种简单、经济、高效的重组质粒导入受体细胞的方法。
这种方法利用一些化学试剂，如聚乙烯亚胺（PEI）或脂质体，将质粒DNA转染到受体细胞内。
首先，将质粒DNA与转染试剂混合，形成质粒-转染试剂复合物。
然后，将复合物加入到受体细胞培养物中，使其与细胞膜结合，进入细胞质。
最后，复合物被细胞吞噬体内的溶酶体降解，释放出质粒DNA，并在细胞核内实现基因转染。
二、电穿孔法电穿孔法是一种利用高压电脉冲破坏细胞膜的方法，使质粒DNA 能够进入受体细胞。
首先，将质粒DNA与受体细胞混合。
然后，将混合物置于电穿孔仪中，通过施加高压电脉冲，使细胞膜发生短暂的破坏，形成微孔，从而使质粒DNA能够进入细胞质。
最后，细胞膜恢复正常，质粒DNA进入细胞核，并在其中实现基因转染。
三、病毒载体介导法病毒载体介导法是一种常用的重组质粒导入受体细胞的方法。
这种方法利用经改造的病毒载体，如腺病毒或腺相关病毒（AAV），将质粒DNA导入受体细胞。
首先，将质粒DNA与病毒载体进行重组，形成重组病毒。
然后，将重组病毒加入到受体细胞培养物中，使其与细胞膜结合。
接下来，病毒进入细胞内部，质粒DNA被释放并进入细胞核。
最后，质粒DNA在细胞核中实现基因转染，并在受体细胞中进行基因表达。
四、基因枪法基因枪法是一种利用高压气体驱动金属微粒，将质粒DNA导入受体细胞的方法。
首先，将质粒DNA与金属微粒混合，并涂覆在载体上。
然后，将载体放置在基因枪上，利用高压气体将金属微粒射入受体细胞中。
金属微粒会穿过细胞膜，将质粒DNA带入细胞质。
最后，质粒DNA进入细胞核，并在其中实现基因转染。
在实际应用中，选择适合的重组质粒导入受体细胞的方法需要考虑多种因素，如细胞类型、实验目的、质粒大小等。
MCF-7细胞转染操作步骤
在无菌管中加入 200 μl 稀释培养基。 加入 6μl X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent，轻柔混 匀。
在上述混合物中加入 2 μg 质粒 DNA （转染试剂：DNA=3：1）， 轻柔混匀。 +15 至+25℃下孵育 15~30 min，形成转染复合物。
在细胞培养板中以逐滴加入的方式，在每孔中加入 10 μl 转染复合 物。轻柔晃动 96 孔板，将转染复合物和细胞培养物混匀。 细胞继续培养 24-72h 后，进行蛋白表达检测。
经优化的转染结果。 转染质粒：pcDNA 3.1-GFP
将 X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent，DNA 和稀释培养基（如 Opti-MEM® I Reduced Serum Medium 或无血清培养基）孵育到室温 （+15 至+25℃）。使用前将转染试剂轻柔混匀。
使用 X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent 转染 MCF-7 细胞系 优化的实验步骤
在转染实验前 18~24 小时，将 MCF-7 细胞按照 1.2~1.8× 104 细胞/孔的密 度接种到 96 孔板中，每孔中含有 100μl 完全生长培养基（70~90%的细胞汇 集度）。细胞培养过夜。
转化 转染 质粒提取等步骤
转化步骤1.取5μl的连接产物到1.5ml离心管中，放置于冰盒中，余下连接产物放回4°C冰箱保存。
2.从-70°C冰箱中取出trans-5α感受态细胞转化菌种，迅速放置于冰盒上，在冰上解冻，待到感受态细胞刚刚融化，取50μl加入到盛有连接产物的离心管中。
3.轻柔晃动离心管，冰上放置30 min。
4.在42℃水浴锅中热激45s，立刻放置于冰上2 min。
5.提前将超净台紫外灯打开，杀菌15min。
6.在超净台中往盛有热激过的感受态细胞的离心管中加入500μl LB培养基，209转/min,37℃摇床培养一个半小时至离心管中液体呈现雾状。
PEI（聚乙烯亚胺）转染（对于35mm培养皿而言）1、待细胞生长24h ，贴壁80%时开始转染；2、提前30min 37℃预热OPTI-MEM培养基；3、稀释好用于转染的质粒至1ug/ul，一般转染1ug；4、加入100ul OPTI-MEM于1.5ml 离心管中；5、加入质粒DNA，混匀；6、加入PEI（DNA：PEI=1（ug）：2（ul）），立即混匀（一定要马上混匀）；7、室温静置15min；8、向离心管中补加opti-MEM至1ml；9、细胞培养液弃旧液，D.Hanks 洗一遍，加入转染液，稍晃下培养皿使其均匀分布；10、4h 后，向细胞培养皿中补加1ml 含20%FBS 无PS的培养基；11、37℃5%CO2培养箱培养24h。
Lipo2000转染（对于35mm培养皿而言）1、待细胞生长24h ，贴壁80%时开始转染；2、提前30min 37℃预热OPTI-MEM培养基；3、稀释好用于转染的质粒至1ug/ul，一般转染1ug；4、取1个1.5ml离心管，标注为lipo2000，加入200ulOPTI-MEM，及适量lipo2000（DNA：lipo2000=1（ug）：2.5（ul）），室温放置5min（注意：lipo2000加到液面以下，不能加到壁上）；5、质粒及lipo2000混合，混匀，室温放置20min；6、追加opti-MEM至1ml；7、细胞培养液弃旧液，D.Hanks 洗一遍，加入转染液，稍晃下培养皿使其均匀分布；8、4-6h 后，更换DMEM+10%FBS培养基（不含PS）；碱裂解法提质粒1.取检验正确的PCR管对应的试管，提取质粒。
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转化：将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性。
转染（transfection）:将含有目的gene的载体转到真核cell内
转导：指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程。
有时也指在真核cell之间通过逆转录病毒转移和获得cellDNA的过程。
1.质粒转染（transfection）
6-well-plate 每well 60-70%时transfection
接种时2.5×105个/ml/well
质粒DNA 转染液优化培养基opti-MEM
步骤：2.5ug质粒DNA + 200ul opti-MEM + 6ul转染液混匀室温静置15min
待转染cell换优化培养基 opti-MEM 1.3ml，切记要轻轻加培养基，勿冲起cell
把transfection complex(200ul)轻轻均匀滴入cell培养基中，十字形摇晃plate,混匀
37℃，CO2培养箱培养
2.
转化：外源DNA(质粒作为载体)导入受体细胞（大肠杆菌感受态cell）步骤：
50ul感受态cell（一管）加入12ul质粒DNA→轻柔混合
↓
冰浴30min
↓
42℃热激90s
↓
迅速冰浴2min
↓
向管中加入培养基，混匀后37℃震荡培养（﹤225rpm）1h,使细菌恢复正常生长状态
↓
涂板正培1h后，倒培过夜。