广东省柑橘炭疽病病原菌的形态与分子鉴定

M ycosystema

菌 物 学 报15 July 2010, 29(4): 488-493

jwxt@

ISSN1672-6472 CN11-5180Q

©2010 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved.

广东省柑橘炭疽病病原菌的形态与分子鉴定

王震 杨媚 杨迎青 彭正凯 周而勋*

华南农业大学资源环境学院热带亚热带真菌研究室 广州 510642

摘 要：炭疽病是柑橘的主要真菌性病害之一。2007年春，广东省德庆县名优柑橘品种贡柑炭疽病暴发流行。为了明确该县及广东省其他地区柑橘炭疽病菌的种类，为防治提供依据，对采集自广东省6个地区柑橘属10个栽培品种上的炭疽病样本进行病原菌分离，共获得柑橘炭疽病菌单孢菌株75株，对其中10株代表性的菌株进行了种类鉴定。通过培养性状和形态学特征观测、核糖体DNA（rDNA）内转录间区（ITS）序列分析、ITS区特异性引物PCR检测和系统发育关系比较等方面的研究，结果表明：10个柑橘炭疽病菌菌株均为盘长孢状刺盘孢Colletotrichum gloeosporioides，未发现国际上其他国家报道的严重危害柑橘花器和幼果部位的柑橘花后落果病病原菌——尖刺盘孢C. acutatum。

关键词：盘长孢状刺盘孢，形态学特征，核糖体DNA内转录间区序列分析

Morphological and molecular identification of citrus anthracnose pathogen from Guangdong Province

WANG Zhen YANG Mei YANG Ying-Qing PENG Zheng-Kai ZHOU Er-Xun*

Laboratory of Tropical & Subtropical Fungi, College of Natural Resources and Environment, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China

Abstract: Anthracnose is one of the major fungal diseases of citrus. A large-scale outbreak of anthracnose in Citrus sinensis cv. gonggan, the high-yield and high-quality cultivar of citrus, occurred in Deqing county, Guangdong Province in the spring of 2007. For identifying the pathogen so as to control this disease effectively, samples of citrus anthracnose were collected from ten cultivars of the genus Citrus in six areas of Guangdong Province, and a total of 75 single-conidial isolates were obtained, among them 10 representative single-conidial isolates were identified at the species level. Based on cultural and morphological characteristics, ribosomal DNA (rDNA) internal transcribed spacer (ITS) sequence analysis, ITS-specific primers PCR detection and phylogenetic relationships with other species of Colletotrichum, the 10 isolates were identified as Colletotrichum gloeosporioides, whereas C. acutatum, the causal agent of postbloom fruit drop of citrus seriously occurring in some countries in the world, was not yet found in this research.

Key words: morphological characteristics, Colletotrichum gloeosporioides, rDNA ITS sequence analysis

*Corresponding author. Tel: +86-20-38297832, E-mail: exzhou@

收稿日期: 2010-01-11, 接受日期: 2010-03-15

Vol.29 No.4 489

菌物学报

柑橘是世界第一大果树品种，在世界百果中，其种植面积和产量均居首位。我国是柑橘的原产国之一。2007年，我国柑橘种植面积194.14万hm 2，产量2,058.72万t ，分别占世界柑橘种植面积和产量的23.3%和17.75%（沈兆敏 2009）。广东是我国柑橘的主产区之一。上世纪90年代初期是广东柑橘种植面积最高峰时期，之后由于种植品种、病虫害等原因，柑橘种植面积和产量逐年萎缩。从2000年开始，广东柑橘产业步入恢复发展时期，至2006年，全省柑橘种植面积恢复至高峰时期的20万hm 2，

总产量达180万t （广东省统计局 2007）。在柑橘病害中，不同国家和地区的病害种类和危害程度不同。在中国，柑橘黄龙病是柑橘上的重要病害（Chen et al . 2009），但在北美洲的美国和南美洲的巴西等美洲湿润地区，柑橘花后落果病（postbloom fruit drop of citrus ，简称PFD ，由Colletotrichum acutatum 引起）则对该地区的柑橘生产造成了非常严重的危害（Timmer et al. 1994；Brown et al.1996；Theodoro et al. 2004；Peres et al. 2008），我国目前尚无PFD 病害的报道。而柑橘炭疽病（病原菌Colletotrichum gloeosporioides ）是世界性的、潜伏性侵染柑橘的常发性病害，该病可危害叶、梢、花、果等部位，潜伏的病原菌在果实贮运期可继续危害（Timmer et al. 1994）。近年来，随着优质柑橘品种的大面积推广种植，一些地方的柑橘炭疽病危害非常严重，甚至在某些地区和某些柑橘品种上大规模爆发流行，但我国有关柑橘炭疽病的研究不多。2007年春，广东省德庆县名优柑橘品种德庆贡柑大面积暴发炭疽病，据不完全统计，发

病面积近500hm 2，果园损失2,000多万元，给当地农业生产造成了很大的经济损失（彭埃天等 2008）。究竟是什么原因造成该地区贡柑炭疽病大流行？彭埃天等（2008）对该病的发病条件和发生规律进行了一些探讨，对该病的防治具有一定的指导意义，但该研究主要从外因方面来分析其爆发流行的原因。笔者认为，除了外因之外，是否存在新的刺盘孢种类（如C. acutatum ）？该地区的炭疽病菌与本省其他地区的柑橘炭疽病菌有何不同？为了弄清楚这些问题，笔者奔赴广东省各柑橘主产区，采集不同柑橘种类上的炭疽病样本，分离其病原菌，然后通过对不同地区、不同柑橘种类上的炭疽病菌进行培养性状和形态学等方面的比较，并采用分子生物学手段、利用特异性引物PCR 扩增等技术，对这些炭疽病菌菌株进行鉴定，为今后对症下药、有效地控制柑橘炭疽病害的发生和危害，保证柑橘产业的健康发展提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 供试菌株

参照方中达（1998）有关病原真菌的组织分离方法，对从广东省柑橘各主产区采集到的柑橘炭疽病样本进行病原菌分离。当菌落在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA ）培养基长出后，用灭菌的接种针挑取菌落边缘的菌丝进行病原菌的初步纯化，将纯化后的菌株，再进行单孢分离，共获得柑橘炭疽病菌单孢菌株75株，在PDA 试管斜面中培养好后，于4℃冰箱中保存，备用。选取其中10株具有代表性的单孢菌株作为本研究的供试菌株，其详细情况见表1。

表1 供试刺盘孢菌株的详细情况

Table 1 Detailed information of isolates of Colletotrichum used in this study

菌株编号 Isolate No. 寄主 Host

采集地点 Sampling locality

采集时间 Sampling date CCDQ013 贡柑 Citrus sinensis cv. gonggan 广东肇庆Zhaoqing, Guangdong 2008.04.21 CCFS014 年桔 Citrus reticulata

广东佛山Foshan, Guangdong 2008.10.31 CCZJ003 红江橙Citrus sinensis cv. hongjiangcheng 广东湛江Zhanjiang, Guangdong 2008.08.14 CCZJ034 红桔Citrus erythrosa

广东湛江Zhanjiang, Guangdong 2008.08.14 CCMZ035 四季柚 Citrus grandis cv. sijiyou 广东梅州Meizhou, Guangdong 2008.08.19 CCMZ004 沙田柚 Citrus grandis cv. shatianyou 广东梅州Meizhou, Guangdong 2008.08.19 CCHZ001 春甜桔 Citrus reticulata cv. chuntianju 广东惠州Huizhou, Guangdong 2008.08.21 CCHZ020 天草 Citrus reticulata cv. tiancao 广东惠州Huizhou, Guangdong 2008.08.21 CCST003 蕉柑 Citrus reticulata var. tankan 广东汕头Shantou, Guangdong 2008.08.20 CCST026

脐橙 Citrus sinensis

广东汕头Shantou, Guangdong

2008.08.20