In-Fusion克隆技术介绍

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无缝克隆说明书+原理+实例

HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒使用说明（基于Gibson Assembly 原理，原理附后）一、产品简介HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒是一种新型、快速并且高效的Gibson Assembly DNA 定向克隆技术，可以在任意载体的任意位置一次插入多个目的基因片段。

HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒操作极其简单，仅需在载体的克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR 引物的5’端引入与载体克隆位点两端完全一致的15~25 bp 同源序列（图1，图3）。

将上述线性化的克隆载体和带有同源序列的PCR 片段按合适比例混合，并加入HB-infusion TM Master mix，通过反应体系中DNA 外切酶、DNA 聚合酶以及连接酶的在50℃反应20 min 即可快速完成定向克隆，阳性率几近100%。

图1. HB-infusion TM 快速克隆试剂盒原理示意图。

1. 线性化目的载体（左上）；2. PCR 获取目的片段。

设计的引物５’需要和线性化载体末端有15~25 bp 的重叠（图中蓝色和黄色片段，细节可参考图3）；3. 按照一定比例把二者混合在HB-infusion TM 的2预混液内，50 C 反应20 min 后直接转化E.coli 即可。

二、HB-infusionTM 试剂盒的优点1. 相比于传统的同源重组的无缝克隆方法进行，HB-infusion TM 试剂盒更高效，操作更简单，只需要一次反应即可完成定向克隆；2. 对酶切位点无要求，可以把目的片段插入到任意载体的任意位点；3. 连接片段之间不会引入任何其他序列；4. 可以同时克隆多个片段。

三、产品包装产品组成使用次数体积2 x HB-infusion TM Master mix 20 tests 200 lPositive linearized pUC vector （250 ng） 5 tests 25 lPositive control insert (500 ng) 5 tests 25 l储存条件-20 ℃四、使用说明汉恒生物建议2-3 个片段连接时，DNA 片段的使用总量为0.02~0.5 pmols，4~6 片段连接时加入的DNA 总量为0.2~1.0 pmols。

克隆技术的研究与应用

克隆技术的研究与应用近年来，克隆技术作为一种前沿科技，不断引起了人们的关注，同时也在生物学、医学、农业等领域发挥着重要作用。

克隆技术的研究与应用，不仅推动了生命科学的发展，也对社会的进步带来巨大的贡献。

一、克隆技术的定义与原理克隆技术，是指利用人工手段将某一个个体的基因或一组基因复制出来，并转移到另一个宿主细胞中，在宿主细胞中进行复制和生长，从而获得一系列与原基因相同或相似的新个体。

克隆技术的原理主要是利用细胞分裂的能力和基因工程技术，通过对细胞核和DNA进行操作，实现对个体遗传信息的复制和改变。

二、克隆技术在生物学研究中的应用1、基因克隆基因克隆是通过克隆方法得到与原基因相同或相似的基因序列，并进行分析和研究。

基因克隆技术可以用来制备基因库，对基因的结构和功能进行研究，并且可用于制备各种重要蛋白质。

2、细胞克隆细胞克隆是指利用克隆方法获得一组相同或相似的细胞群体，以便进行相关实验和研究。

细胞克隆技术在细胞学研究中发挥着重要作用，为细胞学的进一步研究提供了理论基础和实验手段。

三、克隆技术在医学领域的应用1、组织和器官移植组织和器官移植是利用克隆技术实现的一种医学手段，在多种疾病治疗中发挥着重要作用。

克隆技术可以用于制备人工器官替代病患自身的受损和失效的组织器官，从而恢复其正常功能。

2、药物研发克隆技术可以用于药物研发中，例如以克隆技术获得人体生长激素基因，并进行基因重组，得到大量的生长激素，用于药物制备。

克隆技术可以利用重组技术进行药物靶标的发现和验证，从而为药物研发提供重要的基础研究手段。

四、克隆技术在农业领域的应用1、动植物育种克隆技术可以用于动植物的优良品种育种，在动物育种中，克隆技术可以解决种畜生繁殖率低、死亡率高等问题，从而大幅度提高其繁殖效率和生产水平；在植物育种中，利用克隆技术获得的干细胞可实现对优良品种的无性繁殖，极大地提高了良种的繁殖效率。

2、基因转移克隆技术可以利用基因工程技术，将优良基因或抗病基因移植到其他品种或物种中，从而实现物种间基因的跨越转移和融合，为农业生产提供了重要的技术支撑。

基因克隆实验手册

插入片段线性化载体
推荐使用的试剂盒
产品信息
DNA Ligation Kit <Mighty Mix> P4
Blunting Kination Ligation (BKL) Kit
P6
TaKaRa DNA Ligation Kit LONG P4
Mighty TA-cloning Kit
P6
Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR®
↓ ③42℃反应45秒后，在冰中放置1～2分钟
↓ ④加入已预先37℃保温的SOC培养基，使终体积为1 ml。
↓ ⑤37℃振荡培养1小时（160～225 rpm）
↓ ⑥取适量涂布于LB选择培养基、37℃过夜静置培养
5. PCR扩增确认插入片段DNA 6. 培养、纯化质粒
PCR扩增确认插入片段DNA请参考第5页
TCGA 5’ Hin d Ⅲ
线性化载体 ※
C TAG A G C T
※ 利用限制性内切酶酶将环状载体DNA切断后，切胶回收、或必要时进行去磷酸化反应
转化
·感受态细胞
形成菌落
进行菌落PCR 确认插入片段
·EmeraldAmp® MAX PCR Master Mix等
·电泳相关制品
— 1—
基因克隆实验手册
※ PCR扩增产物是平滑末端时进行dA加尾反应。
【目的DNA片段】带有限制性内切酶的
酶切末端
In-Fusion克隆
5×In-Fusion® HD In-Fusion酶使 Enzyme Premix 末端15个相同
碱基无缝融合
TA克隆
3’ A
A 3’
T载体

infusion克隆原理

infusion克隆原理
Infusion克隆是一种提取特定的基因的过程，它能够让研究人员和其他从事科学研究的人员获得特定细胞识别等基因信息，以用于做
为他们实验或研究。

基因克隆技术通过提取一系列核酸（DNA）和蛋白
质（RNA），以建立某种特定细胞的克隆，以及特定酶的催化。

研究人员在进行Infusion克隆的实验的时候，需要确定提取的
基因的类型，以及确立表达这些基因所需要的诱因。

受克隆的基因被
提取到试管中，使用特定的催化酶。

当所需的蛋白质在细胞中被发现，基因信息将被提取出来，以供下一步实验。

Infusion克隆可以用于从细胞提取DNA，以及提取特定类型细胞
以外物质，例如乳腺母细胞。

同时，研究者也可以将这种克隆技术用
于更进一步的深入的研究和实验，例如分离具有特定遗传序列的基因，作为芯片。

此外，Infusion克隆也为研究人员提供了一个更加容易的方式来分享和传播与特定目标有关的基因研究信息。

总而言之，Infusion克隆技术通过提取一系列基因信息，为研究人员提供了一种工具，作为进行下一步实验，深入研究和分享基因信
息的可靠途径。

此外，流入克隆还可以提供更直观的测定细胞状态的
方法，以及能够将基因提取并传播的一种可靠的方式。

4重组表达质粒的构建——基因的克隆

重组表达质粒的构建——基因的克隆长片段基因在大肠杆菌中表达往往比较困难，作为抗原使用的重组蛋白可以考虑选择抗原性好的区段原核表达，前文已作阐述。

对整个蛋白结构研究，必须全长表达该蛋白，此时最好考虑真核表达系统，特别是含有跨膜区的蛋白。

选定要克隆的区段，需先富集纯化之后才方便插入载体，常用的富集方法是PCR或者质粒繁殖复制。

为了防止在PCR扩增过程中引入碱基错误或者碱基缺失，PCR扩增基因时候必须使用高保真Taq酶。

为了满足科研工作者不同实验需求，福因德生物将高保真Taq酶优化为即用型Mix，使用时直接加引物和模板就可以扩增。

除此之外，福因德生物还开发出LA Taq、S-Taq Mix以及SYBR荧光定量PCR Mix(需要更高品质的可选用SYBR PCR SuperMix)。

原核重组表达常用克隆技术主要有以下几种：1）酶切连接这个是目前应用最为广泛的的克隆技术，主要优点是技术稳定；缺点是周期长、步骤多，任何一个环节产生的误差都会影响克隆构建的成败。

如用酶切连接的策略进行载体批量构建，不同载体和不同外源基因尽可能选用相同的上下游酶切位点，比如，批量克隆基因到某个载体上，可一次性大量双酶切将载体线性化后保存备用，每次构建载体只需酶切外源基因片段，载体可直接取用，不必每次都酶切，省时省力（此处需特别留意的是基因内部不能有与上述所用冲突的酶切位点）。

2）TA克隆TA克隆必须使用商业的线性化载体，线性载体3´末端有一个T碱基，与PCR扩增产物3´末端A正好匹配。

这种克隆策略最大的优点是载体使用方便，扩增产物可以直接克隆到载体上，不需要酶切位点等冗余序列；缺点是：必须依赖商业化载体，载体选择受限；扩增外源片段所使用的Taq酶也必须是可以在3´末端加A，这种Taq酶的保真度不高；外源片段插入之后还必须鉴定方向。

目前，这种构建表达载体的策略已经逐渐被淘汰。

3）TOPO克隆TOPO克隆载体利用DNA拓扑异构酶I识别序列中的CCCTT松弛双螺旋并重新连接，同时兼具限制性内切酶和连接酶的功能。

利用In-Fusion技术构建存活素-增强型绿色荧光蛋白融合基因重组慢病毒表达载体

利用In-Fusion技术构建存活素-增强型绿色荧光蛋白融合基因重组慢病毒表达载体【摘要】目的：本研究以构建存活素增强型绿色荧光蛋白(survivin ＆efp)融合基因慢病毒表达载体（pcfusurvivin）为例来探讨infusion克隆技术在常规载体构建中的应用价值。

方法：根据infusion技术原理，克隆引物设计时，在survivin 同源序列的两侧分别引入经ae i线性化的载体pcfu两端各15个碱基，将以此引物扩增的聚合酶链式反应（pcr）产物与线性化pcfu用infusion交换酶在室温下作用30min，使survivin特异性扩增产物两端的序列与线性化载体两端的序列发生同源交换，取2μl交换液进行转化，挑取阳性克隆，进行酶切和测序鉴定。

将鉴定正确的阳性克隆瞬时转染293t 细胞，观察survivin ＆efp融合蛋白在293t细胞中的表达。

结果：每2μl克隆交换液获得大约103个克隆数，阳性率达90%以上，瞬时转染pcfusurvivin可获得survivin ＆efp融合蛋白在293t细胞中的表达。

结论：该技术是一种非连接酶依赖性克隆技术，使基因克隆步骤简化并大大节省了实验时间和经费。

关键词】基因；克隆细胞；基因，病毒value of infusion clonin techhique on routine vector construction lin chao ui fan lin chen lian londepartment of cardioloy，union hospital，fujianmedical university，fuzhou，fujian，350001，abstract：objective:to introduce a simple method for the clonin of pcr products.methods:the infusion clonin technique was described by constructin a rebinant lentivirus vector (pcfu) with survivin ＆efp fusion ene as a sample.the survivin cdna was amplified with survivin ene specific primers with 15 bp extensions homoloous to the pcfu ends.by the action of the infusion enzyme at room temperature for 30 minutes，the sinlestranded pcr frament and vector ends were fused due to the 15 bp homoloy.finally，clones derived from transformation were chosen randomly and identified.results:about 103 positive clones for inserts were obtained after transformation with 2 μl of exchanin products，and the ratio of the positive colonies was more than 90%.after 24 h the pcfusurvivin was transfected into 293t eukaryotic cells，the expression of the survivin ＆efp fusion ene can be confirmed with fluorescence microscope.conclusion:the liation independent property makes the infusion pcr clonin technique rapid，reliable and hiher costeffective，avoidin the need for multiple sub clonin steps.key words：enes;clone cells;enes,viral传统的聚合酶链式反应（pcr）产物克隆技术包括补平末端克隆、ta克隆以及连接酶依赖性克隆等。

汉恒生物无缝克隆试剂盒使用说明(附原理)

汉恒生物无缝克隆试剂盒使用说明(附原理)HB-infusion TM无缝克隆试剂盒使用说明（附原理说明）一、产品简介HB-infusion TM无缝克隆试剂盒是一种新型、快速并且高效的Gibson Assembly DNA定向克隆技术，可以在任意载体的任意位置一次插入多个目的基因片段。

HB-infusion TM无缝克隆试剂盒操作极其简单，仅需在载体的克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物的5’端引入与载体克隆位点两端完全一致的15~25 bp同源序列（图1，图3）。

将上述线性化的克隆载体和带有同源序列的PCR片段按合适比例混合，并加入HB-infusion TM Master mix，通过反应体系中DNA外切酶、DNA聚合酶以及连接酶的在50℃反应20 min即可快速完成定向克隆，阳性率几近100%。

图1. HB-infusion TM快速克隆试剂盒原理示意图。

1. 线性化目的载体（左上）；2. PCR获取目的片段。

设计的引物５’需要和线性化载体末端有15~25 bp的重叠（图中蓝色和黄色片段，细节可参考图3）；3. 按照一定比例把二者混合在HB-infusion TM的2⨯预混液内，50︒C反应20 min后直接转化E.coli即可。

二、HB-infusionTM试剂盒的优点1. 相比于传统的同源重组的无缝克隆方法进行，HB-infusion TM试剂盒更高效，操作更简单，只需要一次反应即可完成定向克隆；2. 对酶切位点无要求，可以把目的片段插入到任意载体的任意位点；注：1. 为了降低载体自连背景，提高阳性率，建议采用双酶切载体质粒。

酶切最好能切出一个较大片段，这样回收的目的条带可以和没有切开的质粒明显分开。

2. 质粒单酶切容易造成载体切割不完全和自连，导致假阳性的产生。

因此，必须单酶切的时候建议延长酶切时间并脱磷处理（酶切2h-过夜，CIP处理20 min），同时做好空载的对照。

3. 请务必跑胶回收线性化的载体，否则非线性化质粒会带来极高的背景。

InFusion克隆技术介绍

选择片段纯化
混合
引物设计 PCR扩增
重组载体
In-Fusion克隆不受限制性内切酶酶切位点的限制: • 在cDNA序列中插入内含子,荧光蛋白基因 • 在cDNA序列添加UTRs • 转换纯化标签例如Myc 转换为His • 缺失蛋白表达区域…
13
8/16/2020
29
8/16/2020
•
In-Fusion Kit 常见问答
Q1.如何选择PCR酶？ A1.可以使用任何PCR酶。由于科研人员进行克隆表达的实验较多，我
们推荐使用高保真的PCR酶。
Q2.载体和插入的DNA片段末端结构有限制吗？ A2.没有特别的限制。无论是平滑末端、粘性末端或者末端有无A尾均可
进行有效的连接反应。
30
8/16/2020
•
技术支持
：800-810-6261；010-80720985 / 86
：
service@. cn
：
我们将竭诚为您服务！
31
8/16/2020
•
Thank You ！
3Q！！！！
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8/16/2020
•
•
引物设计网络工具
在线支持工具
/infusion
23
8/16/2020
•
主要内容
1 In-Fusion®克隆技术的原理 2 In-Fusion®优点及应用实例 3 In-Fusion®系列产品介绍 4 常见问答
24
8/16/2020
•
产品列表
6
8/16/2020
•
In-Fusion®基因克隆技术原理示意图
50 ℃，15 min单管反应
In-Fusion专利酶

羊布鲁菌BtpA 和BtpB 基因缺失突变载体

Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报收稿日期：2020-05-25基金项目：动物布鲁菌新型标记灭活疫苗的研制及临床试验研究（20200402054NC）；“十三五”国家重大科研专项（2016YFD0500900）作者简介：乔连江，男，硕士研究生，预防兽医学专业通信作者：杨艳玲，E-mali：********************2022,30(6):19-26·研究论文·羊布鲁菌BtpA 和BtpB 基因缺失突变载体的构建及生物信息学分析摘要：为进一步研究布鲁菌IV 分泌系统（T4SS ）效应蛋白BtpA 和BtpB 的分子功能，本研究预构建羊布鲁菌BtpA 和BtpB 基因缺失突变载体，并对其生物学功能进行简单的预测。

本研究以羊布鲁菌流行菌株基因组为模板，分别设计了BtpA 和BtpB 基因上、下游同源臂引物，通过PCR 克隆技术得到了待融合基因片段。

采用无缝克隆技术（in-fusion cloning ），将待融合片段与线性化载体PBK-CMV-SacB 连接，经转化、阳性载体的筛选、PCR 鉴定及DNA 测序验证。

并利用生信软件对BtpA 和BtpB 进行分析。

结果表明：PCR 鉴定和基因测序显示BtpA 和BtpB 上、下游基因片段均成功连接到自杀载体上；生信分析显示，BtpA 和BtpB 序列同源性达99％，不存在信号肽，二级结构以α-螺旋为主，具有良好的反应原性。

说明本试验成功构建了羊布鲁菌BtpA 和BtpB 基因缺失突变载体，并对基因结构和功能进行了预测分析，为下一步研究布鲁菌的致病机制奠定了基础。

关键词：布鲁菌；Ⅳ分泌系统；无缝克隆技术；生信分析中图分类号：S858.31文献标志码：A文章编号：1674-6422（2022）06-0019-08Construction of the Brucella melitensis BTPA and BTPB Genetic Defect Vectorsand Analysis of BioinformaticsQIAO Lianjiang, ZHANG Ping, ZHOU Yucheng, YANG Sen, YANG Yanling(Institute of Special Economic Animal and Plant Sciences, CAAS, Changchun 130000, China)乔连江，张萍，周玉成，杨森，杨艳玲（中国农业科学院特产研究所，长春130000）Abstract: To further study the molecular functions of BtpA and BtpB effector proteins of Brucella Ⅳ secretion system, the aim of the present study was to construct genetic defect vectors of BtpA and BtpB genes of Brucella standard strain 16M effector protein and make a simple prediction of their biological functions. Using the Brucella melitensis genome as a template, the homologous arm primers for the upstream and downstream of the BtpA and BtpB genes were designed respectively and the gene fragments to be fused were obtained by PCR cloning technology. In-Fusion Cloning was used to connect the gene fragments to linearized vectors, which were then veriﬁ ed by transformation, screening of positive vectors, PCR identiﬁ cation and DNA sequencing. The resulting BtpA and BtpB were analyzed using biological software. The results show that the fragment sizes and sequences of the recombinant vectors were identiﬁ ed as expected by PCR. Bioinformatics analysis showed that the BtpA and BtpB sequences were 99% homologous without signal peptide and their secondary structures were mainly α-helix with good reactogenicity. These results indicated the success of construction of the Bt. Mutans BtpA and BtpB gene deletion mutation vectors and prediction of their structure and function, which laid the foundation for the investigation of the pathogenic mechanism of brucella.Key words: Brucella ; T4SS; in-fusion cloning; bioinformatics· 20 ·中国动物传染病学报2022年12月布鲁菌病（简称“布病”）是由布鲁菌属（Brucella spp.）引起的一种严重人畜共患传染病，被列为我国法定传染病中乙类传染病之首[1]。

In―Fusion克隆技术构建HBV X基因真核表达质粒-8页文档资料

In―Fusion克隆技术构建HBV X基因真核表达质粒慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus， HBV）感染是肝癌发生的主要危险因素之一。

HBV 编码的分子中与肝癌发生关系最密切的是X蛋白质，HBV X基因编码的X蛋白质（the hepatitis B virus X，HBx）具有多种生物学功能，可与宿主细胞多种蛋白质相互作用，调控宿主细胞基因表达，影响宿主细胞的信号转导、细胞增殖与分化等，其对肝细胞周期与凋亡的影响是HBV致肝癌发生的重要机制之一[1-3]。

因此，克隆HBV X基因进行HBx蛋白生物功能研究具有重要意义。

由于血清HBV DNA X基因的特殊结构，使得克隆X基因较为困难。

血清HBV病毒颗粒的基因组长约3.2kb，为带有缺口的双链不完全环形结构DNA，称为松弛环状DNA（rcDNA），而X基因位于HBV基因组的1374bp～1838bp，正位于缺口处，而且该区域为高CG区。

实验发现：当以血清HBV rcDNA为模板时，用普通PCR一次扩增全长X基因，或用PCR分段扩增后再用PCR扩增拼接的X基因，所获得全长X基因扩增片段经常会出现序列缺失现象[4]。

为克服上述问题，我们采用In-Fusion克隆技术，将分段扩增的X基因片段一次连接克隆入真核表达载体中。

In-Fusion克隆技术是利用In-Fusion Enzyme可准确将末端带有15个相互重叠碱基序列的DNA片段融合连接的特性，将一个或多个外源基因片段一次克隆入目的质粒中[5-6]。

目的克隆基因片段末端的15 bp重叠碱基序列，是通过特定设计的In-Fusion引物加到扩增片段的末端。

In-Fusion HD Cloning Kits 试剂盒可快速准确地将一个或多个外源DNA片段克隆到载体任何位置[7-8]。

采用In-Fusion技术，以血清HBV DNA为模板，分段扩增并拼接X基因，将X基因准确地克隆入真核表达载体pcDNA3.0，获得了可表达HBx蛋白质重组真核表达载体。

Infusion技术 ppt课件

In-Fusion专利酶
【结果】
In-Fusion 连接反应 50 ℃ 15 min
反应液直接转化
20
7/21/2020
•
引物设计原则
引物的5’末端必须包含与载体末端相同的15个碱基序列引物的3’末端必须包含与目的基因片段相互补的特异碱基序列
21
July 21, 2020
•
引物设计原则
22
July 21, 2020
6
July 21, 2020
•
In-Fusion®基因克隆技术原理示意图
50 ℃，15 min单管反应
In-Fusion专利酶
In-Fusion是一种快速、简单、高效的基因克隆技术！
7
•
主要内容
1 In-Fusion®克隆技术的原理 2 In-Fusion®优点及应用实例 3 In-Fusion®系列产品介绍 4 常见问答
11
7/21/2020
•
不附加任何多余序列
A 克隆位点
C
任意载体
线性化载体
B 目的DNA片段
不需要的碱基序列
PCR扩增
引物设计
与载体相同的 15 个碱基序列
不附加任何多余序列的重组载体
In-Fusion 连接反应15 min
无缝克隆：不附加任何多余序列
12
7/21/2020
•
不受限制性内切酶酶切位点的限制
3
7/21/2020
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In-Fusion®基因克隆特点
4
•
主要内容
1 In-Fusion®克隆技术的原理 2 In-Fusion®优点及应用实例 3 In-Fusion®系列产品介绍 4 常见问答

利用PLDMV

热带作物学报2022, 43(4): 684 692 Chinese Journal of Tropical Crops收稿日期 2021-12-20；修回日期 2021-12-27基金项目海南省自然科学基金高层次人才项目（No. 320RC717）；国家自然科学基金项目（No. 32072390）。

作者简介杨秀坤（1996—），女，硕士研究生，研究方向：农艺与种业（园艺）。

*通信作者（Corresponding author ）：朱国鹏（ZHU Guopeng ），E-mail ：******************；周鹏（ZHOU Peng ），E-mail ：*****************.cn 。

利用PLDMV/Twin-Strep 侵染性克隆纯化HC-Pro 病毒蛋白杨秀坤1,2，沈文涛2，庹德财2，王赫1,2，言普2，黎小瑛2，朱国鹏1*，周鹏1,2*1. 海南大学园艺学院/海南省热带园艺作物品质调控重点实验室，海南海口 570228；2. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口 571101摘要：番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus , PLDMV ）是一种新的潜在威胁番木瓜种植业的病毒，其辅助成分蛋白酶（helper component- proteinase, HC-Pro ）是PLDMV 编码参与病毒复制、运动、寄主植物症状表现的多功能蛋白，因此纯化获得具有功能活性的HC-Pro 蛋白，研究其多功能性具有重要意义。

本研究利用In-Fusion 拼接策略和E.coli Cell-Free 快速构建植物病毒侵染性克隆法，一步快速地将28个氨基酸组成的蛋白标签Twin-Strep 插入到PLDMV HC-Pro 氨基端，成功获得了基于农杆菌的携带Twin-Strep 标签的PLDMV 侵染性克隆pPLDMV-Strep 。

SMARTer RACE-SEQ技术

SMARTer RACE-SEQ技术一、背景与原理（一）RACE概念RACE：Rapid-amplification of cDNA ends，是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。

它是由已知的一段cDNA片段，利用PCR，快速扩增cDNA末端，从而获得目的基因3’或5’端序列的技术。

（二）基本原理（1）本实验室采用商业化的SMARTer RACE 5’/3’试剂盒（TAKARA；634860）以及其提供的方法进行RACE-SEQ实验。

SMART技术提供了在逆转录反应中产生全长cDNA的方法。

（2）通过SMARTer II A寡核苷酸和SMARTScribe逆转录酶的联合作用实现。

（3）oligo（dT）可以与polyA互补配对，通过逆转录酶的活性进行逆转录；（4）SMART Scribe逆转录酶有逆转录酶活性和末端转移酶活性。

当SMART Scribe逆转录酶到达RNA 5’末端时，其末端转移酶活性在第一链的cDNA的末端添加上额外的dC，可以与RNA的5’末端帽子结构的dG配对。

（5）SMARTer II A寡核苷酸充当反转录的模板，SMARTScribe逆转录酶将模板从mRNA分子切换到SMARTer寡核苷酸，最后用额外的SMARTer序列产生原始RNA的完整cDNA拷贝。

由于逆转录酶的模板转换活性仅在酶到达RNA模板末端时才发生，SMARTer序列通常仅被整合到全长的第一链cDNA中。

（在逆转录之后，SMART技术允许第一链cDNA直接用于5'-和3'-RACE PCR反应。

在第一链cDNA合成期间在一步中掺入通用引物结合位点消除了繁琐的第二链合成和衔接子连接的需要。

这种简单高效的SMARTer cDNA合成方法可确保扩增目的cDNA更高的特异性。

抑制PCR和逐步PCR技术，结合SMARTer技术可以减少RACE PCR中的背景扩增。

）（三）基本要求与用途1.要求SMARTer RACE 从DNA扩增的唯一要求是知道目的基因上至少23-28 nt的序列信息，以用于基因特异性引物（GSP）的设计。

新克隆技术不用酶切位点,直接克隆

17 In-Fusion克隆技术介绍
9/24/2020
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主要内容
1 In-Fusion®技术原理 2 In-Fusion®实验方法 3 In-Fusion®应用实例 4 In-Fusion®应用文献
18 In-Fusion克隆技术介绍
9/24/2020
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In-Fusion®应用
多片段克隆插入突变
CD101, 2799-bp PCR Product Sense 5′-CAGAGAGAAGTAACAGTTCAGAAA-3′ Antisense 5′-GGCCGAGGAGCAGATCCTGGAA-3′
Murine IgG3 with Overlaps to CD101 and SalI-Digested Vector, 771-bp PCR Product Sense 5′-ATCTGCTCCTCGGCCCCTAGAATACCCAAGCCCAGTACC-3′ Antisense (SalI underlined) 5′-AGTAACGTTAGTCGACTCAGTGTCTTGTAAGACCCGAGGA-3′
x μl**
dH2O μTol tal Volume
x 10 μl
Linearized vector : Purified PCR fragment(摩尔比)=1:2 *<0.5 kb: 10-50 ng, 0.5 to 10 kb: 50-100 ng, >10 kb: 50-200 ng **<10 kb: 50-100 ng, >10 kb: 50-200 ng
24 In-Fusion克隆技术介绍
9/24/2020
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In-Fusion®应用实例---插入突变

猪融合抗菌肽基因双质粒共转化重组毕赤酵母菌的构建

猪融合抗菌肽基因双质粒共转化重组毕赤酵母菌的构建陈骞;万小平;肖永乐;唐健雪;赵世纪;高荣【摘要】为构建高效表达的猪融合抗菌肽蛋白的重组酵母菌发酵表达体系，规模化生产制备新型免疫分子防控动物传染病，本试验从实验室先前构建的pGAPZαA-P质粒中克隆出已构建好的猪融合抗菌肽CAMPs基因片段。

通过Infusion技术，将CAMPs片段分别克隆入pPIC9K和pPICZαA真核表达质粒中，并通过PCR以及测序验证，成功构建了pPIC9K-CAMPs和pPICZαA-CAMPs重组质粒。

通过电转化将线性化pPIC9K-CAMPs转入毕赤酵母GS115基因组中，并筛选高拷贝菌株GS-PK-CAMPs。

再将线性化pPICZαA-CAMPs转入重组酵母GS-PK-CAMPs中，筛选出高拷贝菌株GS-PKZ-CAMPs。

对重组酵母GS-PKZ-CAMPs进行诱导表达后作转录表达研究，检测抗菌肽是否表达。

最终结果显示，成功获得了GS-PKZ-CAMPs可诱导表达菌株，这给猪融合抗菌肽蛋白的大规模发酵制备和应用于动物传染病的防治奠定了可靠的初步基础。

%In order to construct high effective expression recombinant yeast to produce economically nov-el fusion porcine antimicrobial peptide in large scale for the control of animal diseases,the experiment was conducted to clone the fusion CAMPs genes from the recombinant pGAPZαA-P vector constructed early in our laboratory. Then the two fusion genes were respectively inserted into expression plasmid pPIC9K and pPICZαA by Infusion cloning technology. The recombinant plasmids,named as pPIC9K-CAMPs and pPICZα-A-CAMPs, were successfully constructed and confirmed by PCR and sequencing analysis. After that, the linearized pPIC9K-CAMPs was inserted into pichia pastoris GS115 by electroporation,and screened forhigh-copy strain named as GS-PK-CAMPs. Then linearized pPICZαA-CAMPs was inserted into recombinant yeast GS-PK-CAMPs and screened for high-copy strain named as GS-PKZ-CAMPs. Next,induced fermentation of GS-PKZ-CAMPs was carried out to detect the expression of CAMPs gene. The final result showed that the recombinant pichia GS-PKZ-CAMPs strains with dual plasmids transformation was successfully obtained, which lay the reliable basis for future production of fusion antimicrobial peptides to promote the control level of animal infectious diseases.【期刊名称】《四川畜牧兽医》【年(卷),期】2016(043)012【总页数】5页(P28-31,31)【关键词】猪抗菌肽;融合基因;共表达;双质粒转化;毕赤酵母【作者】陈骞;万小平;肖永乐;唐健雪;赵世纪;高荣【作者单位】四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室，四川成都 610064;四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室，四川成都 610064;四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室，四川成都 610064;四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室，四川成都 610064;四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室，四川成都610064;四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室，四川成都 610064【正文语种】中文【中图分类】S818.9抗菌肽作为宿主防御肽，是机体天然的免疫保护屏障，不但具有良好的抗菌活性，还具有很强的稳定性与安全性[1]，因具有独特的抗菌机制，微生物对其产生耐药性的概率极低[2]。

In-Fusion克隆技术介绍

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主要内容
1 In-Fusion®克隆技术的原理 2 In-Fusion®优点及应用实例 3 In-Fusion®系列产品介绍 4 常见问答
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April 12, 2021
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In-Fusion®克隆技术的优点
1 简便、快速、高效的克隆技术 2 不附加任何多余序列 3 不受限制性内切酶酶切位点的限制 4 可同时克隆两个或多个DNA片段
不需要的碱基序列
PCR扩增
引物设计
与载体相同的 15 个碱基序列
不附加任何多余序列的重组载体
In-Fusion 连接反应15 min
无缝克隆：不附加任何多余序列
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April 12, 2021
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不受限制性内切酶酶切位点的限制
选择插入位点 PCR扩增
表达载体
目的DNA片段纯化
混合
引物设计 PCR扩增
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April 12, 2021
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In-Fusion Kit 常见问答
Q1.如何选择PCR酶？ A1.可以使用任何PCR酶。由于科研人员进行克隆表达的实验较多，我
们推荐使用高保真的PCR酶。
Q2.载体和插入的DNA片段末端结构有限制吗？ A2.没有特别的限制。无论是平滑末端、粘性末端或者末端有无A尾均可
任意载体任意基因片段
这是一款让您随心所欲地实现基因定向克隆的产品！
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April 12, 2021
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In-Fusion®基因克隆特点
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主要内容
1 In-Fusion®克隆技术的原理 2 In-Fusion®优点及应用实例 3 In-Fusion®系列产品介绍 4 常见问答
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infusion无缝克隆原理

infusion无缝克隆原理Infusion无缝克隆原理Infusion无缝克隆是一种将物体或者生物复制的技术，它可以在不损坏原始物体的情况下，制作出一个完全相同的复制品。

这种技术在科幻电影中经常出现，给人以想象力的空间。

然而，在现实世界中，无缝克隆仍然是一个具有挑战性的课题。

无缝克隆的原理可以简单地解释为将一个物体或者生物的所有特征和性质复制到另一个物体或者生物上。

这包括了物体或者生物的形态、结构、功能和行为等方面。

为了实现无缝克隆，科学家们需要解决几个关键问题。

无缝克隆需要获取原始物体或者生物的详细信息。

这可以通过对原始物体或者生物进行观察和测量来实现。

科学家们使用各种仪器和技术，如扫描仪、显微镜和遗传测序等，来获取尽可能多的数据。

这些数据包括了物体或者生物的结构、形态和遗传信息等。

科学家们需要找到一种适合的复制方法。

无缝克隆的方法有很多种，如基因克隆、细胞克隆和三维打印等。

每种方法都有自己的优缺点，适用于不同的情况。

科学家们需要根据实际需求选择合适的方法。

然后，无缝克隆还需要解决物体或者生物的复制过程中可能出现的问题。

这些问题包括了复制过程中的变异、损坏和不完整等。

科学家们需要通过优化复制过程和改进技术，来尽可能减少这些问题的发生。

无缝克隆还需要解决物体或者生物的复制品与原始物体或者生物之间的差异。

即使在成功复制了一个物体或者生物之后，复制品与原始物体或者生物之间仍然可能存在差异。

这些差异可能是由于复制过程中的误差或者原始物体或者生物的环境因素导致的。

科学家们需要不断改进技术，提高复制品与原始物体或者生物之间的相似度。

无缝克隆是一项具有挑战性的技术。

虽然目前还存在许多问题和困难，但随着科学技术的不断进步，无缝克隆有望实现。

这将会给人类带来许多新的机遇和挑战。

大连In-Fusion Cloning

In-Fusion反应液是不会将其环化的，除非载体末端带有相同的15 nt同源性碱基。
建立In-Fusion应体系
3.线性化载体的纯化必须胶回收，低电压运行，确保线性分子和环状分子载体彻底分离。
转化感受态细胞插入片段确认
反向PCR扩增
1.当找不到合适的酶切位点，可以采用反向PCR的方法。 2.同时这也是一种突变的方法（缺失，插入，点突变）。 3.引物设计时，15 nt悬挂的同源碱基可以来源于插入片段。 4.为了保证载体骨架完整性，推荐使用高保真酶，如CloneAmp HiFi PCR Premix（639298）。
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Q2：引物合成的纯化方式和修饰要求？ A2：脱盐处理即可，较长引物可以PAGE纯化。 3’-OH，而5’无需磷酸化处理。
Q4：引物除了15 bp的同源序列和目的基因的特异性序列，还可以包含其它的序列？
A4：可以，在15 bp同源序列之后引入其它适当序列，用于酶切位点构建、读码框的完整性和融合标签。15 bp+其它序列+GSP序列。
规格
10 rxns 50 rxns 100rxns 10 rxns 50 rxns 100rxns
Cloning Enhancer
Nucleo -Spin
Stellar Competent Cells
CloneAMP HiFiPCR Premix
Lyophilized
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推荐5:1或者10:1；插入片段50-100 bp时，推荐10:1或者 50:1。
A5：50 bp-15 kb，8-15 kb的克隆效率可能会下降。
Q7：PCR产物如何纯化？
A7：如果PCR产物电泳检测显示单一条带，可以采用Cloning Enhancer（639613）处理；小于350 bp的PCR产物，建议采用Cloning Enhancer（639613）处理；如果PCR产物含有非特异性背景，请采用切胶方式分离目的片段回收纯化，推荐NucleoSpin Gel and PCR Clean-up（740609）。