不同浓度、作用时间白花蛇舌草注射液对MG—63细胞凋亡效果-

不同浓度、作用时间白花蛇舌草注射液对MG—63细胞凋亡效果* 目的：探讨白花蛇舌草注射液对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡的诱导作用。方

法：采用一定浓度的乙醇提取白花蛇舌草有效成分，将其配制成50、100、200、

400 μL/mL 4种不同浓度的白花蛇舌草注射液，并注入到体外培养的人骨肉瘤MG-63细胞的培养液中。采用MTT法检测不同浓度白花蛇舌草注射液对人骨肉瘤MG-63细胞作用12、24、48 h后的细胞增殖抑制率，并采用RT-PCR半定量检测凋亡相关基因Bax的mRNA表达情况。同时拟用流式细胞仪（FCM）检测白花蛇舌草注射液对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡率。结果：MTT法检测结果显示，随着白花蛇舌草注射液浓度和作用时间的不断增加，人骨肉瘤MG-63细胞增殖抑制率均明显增大；当白花蛇舌草注射液浓度达100 μL/mL时，随着作用时间延长，Bax基因表达显著升高（P＜0.05）。流式细胞仪检测显示，经白花蛇舌草注射液处理后，人骨肉瘤MG-63细胞凋亡率随白花蛇舌草注射液浓度的增加而不断升高。结论：白花蛇舌草注射液通过上调Bax基因表达能诱导人骨肉瘤MG-63细胞凋亡，且随着白花蛇舌草注射液浓度增加，人骨肉瘤MG-63细胞凋亡率亦不断增加。

标签：白花蛇舌草注射液；MG-63细胞；细胞凋亡

在青少年中，骨肉瘤属于较为常见的恶性骨肿瘤，在恶性肿瘤中约占20%，传统治疗方法主要包括新辅助化疗、肿瘤切除或辅以化疗[1]。患有骨肉瘤患者，其5年生存率可达70%～80%，但骨肉瘤仍属于致残率、病死率较高的一种恶性肿瘤，对人们的生命健康造成严重的威胁[2]。采用中药辅助治疗法，具有前景好、价格低廉、不良反应少，药理作用广泛等优点。而中药白花蛇舌草是一种茜草科耳草属植物，中医学认为，白花蛇舌草具有清热解毒、活血散结、利水消肿的功效[3-5]。同时现代药理学研究表明，白花蛇舌草主要含有机酸类、黄酮类、多糖类等成分，具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤以及增强免疫力等作用。目前，国外对白花蛇舌草方面的研究很少，而国内相对较多。据文献[6]表明，白花蛇舌草能对肿瘤细胞具有诱导凋亡、体外抑制等作用。本研究通过体外培养MG-63细胞，将不同浓度（50、100、200、400μL/mL）白花蛇舌草注射液在不同时间（12、24、48 h）作用于该细胞，采用MTT法和流式细胞仪检测其对MG-63细胞增殖抑制率和凋亡率，现将报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料白花蛇舌草注射液购自安徽凤阳科苑药业有限公司（国药准字号Z34020595，批号120601）；MTT、二甲基亚砜（美国Sigma公司）；人骨肉瘤MG-63细胞由广西医科大学科学实验中心惠赠，来自于中国科学院上海细胞库。

1.2主要试剂胎牛血清、高糖DMEM培养基（美国Sigma公司）；PBS（1×）、胰蛋白酶（1∶250）购自索莱宝科技有限公司；细胞培养瓶、15 mL离心管、96孔板（Corning公司）；TRIzol试剂（Invitrogen公司）；引物合成由大连宝生物工程有限公司完成；逆转录试剂（TaKaRa公司）2×Taq PCR MasterMix（KT201-01）

MarkerI、SYBR试剂（TianGen公司）；8联管（Axygen公司）。

1.3 实验仪器CO2细胞培养箱、超低温冰箱MDF-U72V、MCO-18AIC（日本SANYO公司）；生物安全柜BHC-1300ⅡA/83（苏净集团安泰公司）；电热恒温水槽DK-8D型（上海精宏实验设备有限公司）；台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；倒置显微镜（Leica型号DMIL），酶标仪（Nultiskan MK3 Thermo），PCR 仪（BIO-RAD）；水浴箱；摇床。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养将人骨肉瘤MG-63细胞接种于培养瓶，加入10%（体积分数）胎牛血清的DMEM培养基5 mL，置于5% CO2、37 ℃细胞培养箱中培养，每2天传代1次，取对数生长期的细胞用于实验。

1.4.2 MTT法检测取对数生长期的细胞，并用0.25%胰酶消化，消化后加入培养基（DMEM）5 mL

并吹打成混悬液，计数后调整细胞浓度，取

150 μL（5×103个）接种于96孔板。采用一定浓度的乙醇提取白花蛇舌草有效成分，将其配制成浓度为50、100、200、400 μL/mL 4种不同的白花蛇舌草注射液，现配现用。待细胞贴壁后，弃去培养基，加入不同浓度含药液，并设立空白对照组（仅加入相同的培养基），每组5个复孔[7-9]。培养24 h后，加入20 μL的5 mg/mL MTT，再培养4 h后弃去含药液，加入150 μL DMSO，37 ℃恒温摇床震荡10 min后，在酶标仪上492 nm波长测定吸光度（A）值，取平均值，并计算细胞抑制率。计算公式：细胞增殖抑制率=（对照组A值-药物组A值）/对照组A值×100%。

1.4.3 Bax基因表达

1.4.3.1 提取总RNA 取对数生长期细胞，并调整为1×105个/mL，接种于培养瓶，待细胞贴壁后，加入100 μL/mL含药培养基5 mL，培养时间分别为12、24、48 h，根据Trizol提取试剂说明书提取总RNA。采用紫外分光光度计测量总RNA浓度，取A260/A280在1.80～

2.20用于RT-PCR。

1.4.3.2 cDNA合成参照逆转录试剂盒说明，将RNA逆转成cDNA。

1.4.3.3 PCR检测25.0 μL反映体系包括SYBR Permix Ex TaqⅡ1

2.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O

10.5 μL。将25.0 μL设5复孔，并加入8联管中，采用PCR仪行扩增，95 ℃变性30 s，95 ℃PCR反应50 s、63 ℃退火30 s，共计40个循环的PCR反应，重复实验3次，反应结束后，计算2-△△Ct值[10-12]。具体见表1。1.4.4 流式细胞仪检测取对数生长期细胞数为5×106/mL的MG-63细胞，分别接种于4个