Octet BLI 小分子动力学检测亲和力数据分析-1第一章-Small Molecule Kinetics-by row
Octet BLI大分子结合动力学检测实验设计-Non-Small Molecule Kinetics
Kinetics Assay:概述：Octet系统可检测生物分子间相互作用，其中RED系列检测分子量下限可达150Da，而QK系列则可检测5kDa以上分子。
检测样品为分子量150 Da~1000 Da的小分子以及小于5kDa的分子，采用RED系列实现；分子量大于5kDa时，RED系列及QK系列均可满足要求。
该SOP默认待测样品为大分子，为其动力学检测提供通用标准化流程，针对具体分子及特殊情况，可能需要进一步考虑更多细节及优化。
考量及建议：1.采用Octet系统检测大分子时，应当根据样品特性综合考虑，以选择适当sensor（例如，SA sensor可loading生物素化的蛋白、抗体、化合物、核酸等以检测与之相互作用的大分子样品，而AHC sensor可直接loading人抗后检测与之相互作用的分子）；所使用sensor批次相同。
如用户对于sensor选择有任何疑问，请随时与ForteBio应用科学家联系。
2.蛋白或抗体生物素化操作请参阅ForteBio技术说明书。
化合物及核酸、糖类分子生物素化一般需合成实现。
核酸及糖类分子生物素化也可依据Pierce试剂盒操作实现。
3.Assay buffer没有特定要求，便于样品的稳定保存即可；值得注意的是，由于ForteBio大多通过氨基生物素化实现欧联，因此需生物素化样品的buffer不可为含Tris等氨基的缓冲液。
客户可根据需要采用Pierce相关试剂盒实现羧基端生物素化。
4.设置protocol时，一般需要1根sensor loading后在检测buffer中检测基线，作为空白对照。
5.用于loding的生物素化蛋白浓度可采用20ug-50ug/ml。
6.建议对样品进行两轮筛选。
例如，第1轮宽泛筛选，浓度为100,10,1,0.1uM，确定样品大概Kd范围；第2轮更精细筛选：30,10,3.3,1.1uM，获取高度可信的Kd。
（注意：所用浓度仅用于发挥导向性作用，实际浓度取决于初筛所获得Kd）。
Octet生物分子相互作用仪
Y = Y0 + A (1 - e-kobs*t) KD =
Y=Y0+Ae-kd*t kd ka
ka=
kobs – kd
[Conc Ag (M)]
Octet 系统测定动力学的工作流程
Baseline Baseline Loading
Octet Biosensors
Buffer Ligand-Biotin Protein of Interest
Test Samples
Time (sec)
120
•
• • •
利用标准品在不同浓度时结合速率的 差异来定量样品的浓度 15-30分钟可以分析各样品 标准曲线可以重复使用 病毒颗粒等其他样品也可定量
Binding Rate
Concentration
Octet 软件
• 可灵活输出各种格式， Excel表，JEPG格式等 • 动力学分析直接得到ka, kd and KD 结果 • 浓度分析直接得到，ug/ml, ng/ml等浓度计算 结果
1 nm
1,000
Small Molecules Atoms
Multiple Antibody Pairings
150
Antibody - Small Molecule
1
0.1 nm
Protein - Small Molecule
Current Octet assays within blue area
Dip and Read Immunogenicity Kit Dip and Read Residual Protein A Detection Kit
Yes Yes Yes Yes Yes
No No
Kits
Fortebio Octet BLI 实验设计及数据获取-小分子动力学
Small Molecule Kinetics Assay:概述：Octet可检测分子量为150 Da~1000 Da的小分子与蛋白间相互作用。
该SOP的目的在于为小分子动力学检测提供通用标准化流程，针对具体分子及特殊情况，可能需要进一步考虑更多细节及优化。
此外，该SOP假定所有使用者已经过ForteBio应用科学家上机培训，如若不然，请在培训完成后参考该SOP。
考量及建议：1.检测小分子时，应当使用SSA sensor（Cat# 18-0008 and 18-0009），该sensor是ForteBio公司目前唯一具备检测小分子灵敏度的传感器。
2.用于与小分子结合的蛋白或抗体必须先进行生物素化。
请参阅ForteBio技术说明书。
3.建议assay buffer为PBS+0.1%BSA+0.02%TW20+5%DMSO（如果为水溶性小分子，则无需加DMSO等有机溶剂）；4.设置protocol时，须设置两组SSA sensor，运行中第1组为实际检测用sensor，第2组为生物胞素（biocytin）封闭后、用作阴性对照的sensor。
5.检测sensor与对照sensor间运行步骤数以及各步运行时间必须一致——任何偏差将导致数据无法分析。
6.用于loding的生物素化蛋白浓度建议采用50ug/ml。
如蛋白很小或容易产生空间位阻，可能需要进行定量。
如蛋白较宝贵，其用量可以更低，但随后的结合效率可能会有所折扣（17kDa的蛋白在推荐浓度下3min后可产生2nm的shift）。
蛋白生物素化7.如果需要有机溶剂溶解小分子，稀释样品时DMSO最终浓度建议保持在5%以内（例如：溶于100%DMSO中20mM的样品，按照1:20溶于PBS后其浓度为1mM，DMSO为5%）。
8.建议对样品进行两轮筛选。
例如，第1轮宽泛筛选，浓度为100,10,1,0.1uM，确定样品大概Kd范围；第2轮更精细筛选：30,10,3.3,1.1uM（或者2被剃度稀释）获取高度可信的Kd。
BiacoreT200SPR详细操作流程-2亲和力及动力学测定和数据分析
BiacoreT200SPR详细操作流程-2亲和⼒及动⼒学测定和数据分析3) 在setup 对话框中，设置Startup 。
在运⾏正式样品前，通常都会运⾏若⼲Startup 循环，⽬的是让系统在开始阶段模拟运⾏样品，以达到稳定的基线和系统状态。
因此此时的样品⼀般都⽤缓冲液替代分析物样品。
在solution 中输⼊Buffer ，Number of Cycles 设为3（通常为3-5次）。
点击Next，进⼊下⼀步。
四测定亲和⼒和动⼒学（多循环）在这章节中，我们将应⽤向导程序设置多循环实验，完成亲和⼒和动⼒学数据的检测。
同时，我们也将介绍如何分析所得到的实验数据。
在第2章中，我们已经在芯⽚上偶联了配体（β2-microglobulin 抗体）。
在第3章中，我们确定了分析物（β2-microglobulin ）的浓度范围和再⽣试剂条件。
在这章节中，我们将会检测配体和分析物的亲和⼒和动⼒学。
4.1设置多循环动⼒学1) 打开New Wizard Template ，在Assay 中选择Kinetics/Affinity ，点击New 。
2) 在Injection Sequence 对话框中，Flow path 选择2-1，Chip type 选择CM5，点击Next ，进⼊下⼀步。
4) 在Injection Parameters对话框中，设置进样、解离和再⽣的相关参数。
在Sample中，Contact time是指分析物的进样时间，通常为1-5分钟，本次实验设为180s。
亲和⼒实验的Flow rate必须⼤于30µl/min，此处设为30µl/min。
Dissociation time是指解离时间，需根据样品的情况设置，此处设为300s。
在Regeneration中，Solution输⼊regeneration scouting结果中确认的再⽣试剂条件，Glycine-HCl 2.5。
Fortebio生物分子相互作用检测平台-中文版
Microplate Formats板型
Wide Fit Within Discovery and Development Process
Research 研究
Screening 筛选
Lead Characterization
Preclinical and Clinical临床前
期及临床
Manufacturing and QC
生产及质控
Assay development 实验发现
> 150 D 2, 5, or 10 Hz
16 1 - 16
2 Yes Yes 96 / 96HA 384 / 384TW 40 µL per well
50 ng/ml to 2 mg/ml
1 mM to 10 pM 2, 3, or 6 pM
Fortebio Octet 检测平台
Affinity characterization
> 5000 D
0.3 Hz or 0.6 Hz 2
1 - 16 2 Yes Yes
96 / 96HA 384 / 384TW 40 µL per well
> 150 D 2, 5, or 10 Hz
8 1-8
1 No No
96
180 µL per well
100 ng/ml to 700 ug/ml
Expression Monitoring
Octet BLI 小分子结合动力学检测实验设计Small Molecule Kinetics
Small Molecule Kinetics Assay:概述：Octet RED系列可检测分子量为150 Da~1000 Da的小分子与蛋白间相互作用。
该SOP的目的在于为小分子动力学检测提供通用标准化流程，针对具体分子及特殊情况，可能需要进一步考虑更多细节及优化。
此外，该SOP假定所有使用者已经过ForteBio应用科学家上机培训，如若不然，请在培训完成后参考该SOP。
考量及建议：1.采用RED系列检测小分子时，应当使用SSA sensor（Cat# 18-0008 and 18-0009），该sensor是ForteBio公司目前唯一具备检测小分子灵敏度的传感器。
2.用于与小分子结合的蛋白或抗体必须生物素化。
请参阅ForteBio技术说明书。
3.建议assay buffer为PBS+5%DMSO；4.设置protocol时，须设置两组SSA sensor，运行中第1组为实际检测用sensor，第2组为生物胞素（biocytin）封闭后、用作阴性对照的sensor。
5.至关重要的是，检测sensor与对照sensor间运行步骤数以及各步运行时间必须一致-任何偏差将导致所得数据无法于Octet RED软件上分析。
6.用于loding的生物素化蛋白浓度建议采用50ug/ml。
如蛋白很小或容易产生空间位阻，可能需要进行定量。
如蛋白较宝贵，其用量可以更低，但随后的结合效率可能会有所折扣（17kDa的蛋白在推荐浓度下3min后可产生2nm的shift）。
7.稀释样品，DMSO最终浓度为5%（例如：溶于100%DMSO中20mM的样品，按照1:20溶于PBS后其浓度为1mM，DMSO为5%）。
8.建议对样品进行两轮筛选。
例如，第1轮宽泛筛选，浓度为100,10,1,0.1uM，确定样品大概Kd范围；第2轮更精细筛选：30,10,3.3,1.1uM，获取高度可信的Kd。
（注意：所用浓度仅用于发挥导向性作用，实际浓度取决于初筛所获得Kd）。
Fortebio Octet 生物膜干涉技术(BLI)常见问题解答-第二版
生物膜干涉技术(BLI) 常见问题解答（第二版）目录缩写说明 (2)动力学相关术语 (2)传感器和仪器相关术语 (2)生化相关术语 (3)1 实验基本常识 (3)1.1如何自学 (3)1.2关于动力学 (3)1.3关于耗材与样品要求 (5)1.4关于生物膜干涉技术 (7)1.5软件与硬件性能参数 (8)1.6关于应用 (11)1.7关于基本操作 (11)2 动力学实验设计与操作 (15)2.1 关于固化和传感器的选择 (15)2.2 关于结合和解离 (19)2.3 关于传感器再生 (20)2.4 小分子检测 (21)2.5 动力学实验操作 (23)2.6 动力学实验数据处理 (29)2.7实验常见问题（动力学部分） (39)3 定量实验设计与操作 (44)3.1定量实验设计 (44)3.2 定量实验操作 (46)3.3定量实验数据处理 (48)3.4实验常见问题（定量部分） (51)4 仪器维护与硬件问题 (51)5 联系我们 (55)缩写说明动力学相关术语k on或k a：结合速率常数，单位M-1s-1k off或者k d：解离速率常数，单位s-1K D：亲和力常数（解离平衡常数），单位Mk obs：表观结合常数[C]：分析物浓度Ligand：配体，即固化在传感器上的物质Analyte：分析物，即与固化物质结合的物质R max：理论上分析物结合信号的最大值，即所有ligand均被analyte结合后所获得的信号Req：分析物结合达到平衡时的信号值Initial slope：起始斜率BLI：生物膜干涉技术Baseline：平衡步骤Association：结合步骤Dissociation：解离步骤Loading：固化步骤传感器和仪器相关术语SA：链霉亲和素传感器SSA：超级链霉亲和素传感器APS：氨基丙基硅烷传感器AR2G：氨基偶联传感器AHC：抗人免疫球蛋白Fc段传感器AHQ：人免疫球蛋白定量传感器AMQ：鼠免疫球蛋白定量传感器AMC：抗鼠免疫球蛋白Fc段传感器NTA：镍离子传感器anti-His：抗组氨酸标签传感器anti-GST：抗GST标签传感器Capture类传感器：除去SA，SAX，SSA，AR2G，APS外的传感器Octet：Octet家族仪器，包含Octet RED，RED96，QK，QKe，QK384，RED384，HTX，K2RED系列仪器：RED，RED96，RED384，K2QK系列仪器：QK，QKe，QK384生化相关术语EDC：1-(3-二甲基氨丙基) -3-乙基-碳化二亚胺NHS：N-羟基琥珀酰亚胺HRP：辣根过氧化物酶DAB：二氨基联苯胺，一种HRP的底物，在HRP催化后可以生成金属沉淀EMSA：电泳迁移率实验，用来研究DNA和蛋白的结合Epitope binning：表位分析His-tag：组氨酸标签Co-IP：免疫共沉淀PBS：磷酸盐缓冲液BSA：牛血清白蛋白hIgG：人免疫球蛋白mIgG：鼠免疫球蛋白1:1反应：一份的ligand与一份的analyte形成一份的产物，即两者只有一个结合位点2:1反应：Ligand上有2个可以和analyte的结合位点，并且两者独立1:2反应：Analyte上有2个可以和ligand结合的位点，并且两者独立1 实验基本常识1.2关于动力学1.2.1 k on, k off, K D值各代表什么意义？生物分子间的相互作用一般视为可逆反应。
分子动力学结果分析
分子动力学模拟通常包括初始化、平衡和采样三个步骤。初始化是为系统设定初始构型和 速度；平衡是让系统达到热力学平衡状态；采样是在平衡状态下对系统进行长时间的模拟 ，以获取所需的物理量。
适用范围
分子动力学模拟适用于各种尺度的系统，从简单的无机物到复杂的生物大分子、纳米材料 等。它可以模拟不同温度、压力和化学环境下的系统行为，为实验提供重要的补充和验证 手段。
结合自由能计算和构象变化分析
结合自由能计算方法
介绍用于计算药物与受体结合自由能的方法，如 MM/PBSA、MM/GBSA等。
结合自由能计算结果
展示结合自由能的计算结果，并分析其与实验结果的 一致性。
构象变化分析
通过分析模拟过程中药物和受体的构象变化，探讨药 物对受体功能的影响以及可能的副作用。
06
02
分子动力学模拟过程
模拟软件及参数设置
常用软件
LAMMPS、GROMACS、NAMD等
时间步长
通常选择1-2 fs，需根据体系特性和力场 参数进行调整
温度和压力控制
采用Nose-Hoover热浴和ParrinelloRahman压浴等方法
模拟时长
根据研究目的和体系大小，选择合适的模 拟时长，通常为数纳秒至微秒级别
折叠路径和能量变化分析
1
通过分析模拟轨迹，可以识别出蛋白质折叠的不 同路径和中间态，了解折叠过程的多样性。
2
能量分析可以揭示折叠过程中的能量变化和热力 学稳定性，包括自由能计算和能量图谱的构建。
3
结合实验数据和理论分析，可以对模拟结果进行 验证和补充，为蛋白质设计和药物研发提供指导 。
05
典型案例分析：药物与受体相互作用研究
挑战与展望
Biacore T200 SPR 详细操作流程-2亲和力及动力学测定和数据分析
3) 在setup 对话框中，设置Startup 。
在运行正式样品前，通常都会运行若干Startup 循环，目的是让系统在开始阶段模拟运行样品，以达到稳定的基线和系统状态。
因此此时的样品一般都用缓冲液替代分析物样品。
在solution 中输入Buffer ，Number of Cycles 设为3（通常为3-5次）。
点击Next，进入下一步。
四 测定亲和力和动力学（多循环）在这章节中，我们将应用向导程序设置多循环实验，完成亲和力和动力学数据的检测。
同时，我们也将介绍如何分析所得到的实验数据。
在第2章中，我们已经在芯片上偶联了配体（β2-microglobulin 抗体）。
在第3章中，我们确定了分析物（β2-microglobulin ）的浓度范围和再生试剂条件。
在这章节中，我们将会检测配体和分析物的亲和力和动力学。
4.1设置多循环动力学1) 打开New Wizard Template ，在Assay 中选择Kinetics/Affinity ，点击New 。
2) 在Injection Sequence 对话框中，Flow path 选择2-1，Chip type 选择CM5，点击Next ，进入下一步。
4) 在Injection Parameters对话框中，设置进样、解离和再生的相关参数。
在Sample中，Contact time是指分析物的进样时间，通常为1-5分钟，本次实验设为180s。
亲和力实验的Flow rate必须大于30μl/min，此处设为30μl/min。
Dissociation time是指解离时间，需根据样品的情况设置，此处设为300s。
在Regeneration中，Solution输入regeneration scouting结果中确认的再生试剂条件，Glycine-HCl 2.5。
Contact time设为30s，Flow rate设为30μl/min。
如果再生试剂选择的是NaOH，建议在Stabilization period中设置60s的稳定时间。
分子动力学模拟案例分析
分子动力学模拟经典案例分析雷特格韦（Raltegravir）是第一个通过FDA审查的HIV-1整合酶抑制剂，前期研究发现它与最佳背景疗法结合，抗HIV能力强于单用最佳背景疗法。
下面是它的三维立体结构以及它与HIV-1整合酶结合的口袋位置图：图5 左图表示 Raltegravir 的三维立体结构，右图是HIV-1整合酶的口袋区域，蓝色小分子在晶体结构中已存在，黄色小分子是对接时筛选到的。
案例一：寻找新的HIV-1抑制剂8。
1. 研究者通过构建HIV-1整合酶的三维结构，寻找它的结合口袋，如上图所示。
2. 通过文献调研，寻找到31个已知的具有不同结构类型的HIV-1抑制剂；并且新发现9个具有潜在效用的小分子（研究者从实验中发现，或者从虚拟筛选中得到）。
3. 选取在分子对接中能量超过一定数值（这里是-50kcal/mol）的小分子做分子动力学模拟，通过动力学轨迹分析了解蛋白与小分子的结合情况，并计算它们的结合自由能，一般是分子动力学中的MM/PBSA 或者MM/GBSA方法。
4. 下表的数据中分别列出了抑制剂的IC50值（达到最大抑制一半时小分子的浓度）、分子对接中的能量、MM/GBSA方法计算得到的结合自由能、MM/PBSA方法计算得到的结合自由能。
L01是晶体结构中存在的配体小分子，L02即为Raltegravir，L02t是Raltegravir的钾盐，从L32到LGE是新发现的那九个小分子。
分析数据表明，Raltegravir盐类比Raltegravir本身的抑制效果更好，适合成药，实际上也是如此。
LGA和LGB两个新发现的小分子与蛋白的结合紧密程度比Raltegravir盐类更好，可能用作下一步的生物活性分析。
5. 最后我们可以通过分析蛋白与小分子复合物的三维结构分析它们的结合模式。
例如Raltegravir与蛋白结合，形成了一些特殊的氢键，最重要的是它们都要与蛋白质中的金属离子形成配位结构。
Fortebio Octet BLI数据分析-小分子动力学-1
The being detected thing is small molecular, and the sensor is immobilized with macromolecular. The detected way is by column. For example , the bio-protein A with IgG.1.双击数据分析软件图标，打开数据分析软件，在软件Data Selection界面左下侧子窗口路径下选中待分析kinetics数据：2.双击后载入左上侧子窗口Loaded Data Kinetics文件夹下3.左键单击所载入待分析数据，右侧窗口显示Sensor Tray按钮下界面，即该检测中sensor所在sensor tray上位置，在此可选择分析哪些sensor采集的数据，本例分析所有sensor的数据等。
5.选择所需分析sensor后，点击Processing进行数据处理：6.数据处理界面如下，该窗口左侧依次包括Step1:Data Selection，Step2:Subtraction，Step3:Align Y Axis，Step4:Inter-step Correction，Step5:Process，Step6:View Results，Step7: Save Results；右侧窗口默认为Raw Data View下界面，即原始数据预览。
7.点击Step 1下Sensor Selection按钮，界面如下：8.对于非经典小分子实验，在实验设计上包括sensor对照和孔对照（间经典小分子实验设计SOP），与经典小分子实验相比其差别在于浓度梯度按列排列，1个浓度1根sensor（经典小分子实验浓度梯度安行排列，所有浓度采用同一根sensor从低到高顺序检测）；数据处理时需分别扣除对照孔及对照sensor引入的干扰；选中对照孔，右键下选择Change Well Type…下的Refference Well：设置Refference Well后界面如下：9.在Sensor Tray下选中对照Sensor，右键选择Change Sensor Type…下的Refference Sensor：设置Refference Sensor后的界面如下：10.在Step 2下选中Double Subtraction，即扣除对照空及对照sensor可能引入的干扰：。
BiaCore应用
-5
-10
25
-15 40 46 52 58 64 70 76 82 Time
20
88
94
100
106
112
118
124
130 s
15
Rmax = 20RU KD = 127μM
10
5
0 0 5e-4 1e-3 1.5e-3 2e-3 2.5e-3
动力学分析
•
Biacore Training
分子复合物的生成和解离的速度有多快?
biacore技术应用原理和典型的实验结果多重结合分析multiplebindingbiacore实验设计的灵活性很高能方便地进行交叉反应和特异性结合的测试多重结合分析multiplebinding通过测试多个抗体和同一个抗原的连续结合测定抗原决定簇标准曲线calibrationcurveresponse浓度样品不同测试种类浓度分析由于结合和解离的速率太快不能得到精确的结合和解离的速率测量结果细胞受体和mhcclassii的亲和力计算亲和力常数monitorbindingcurvesactivesurfacereferencesurfacesubtractbulkeffectsusesteadystatecalculateaffinityeq50150350550750950115013501550175070140210280350420490560630700亲和力分析典型的实验结果1510510152025303540465258647076828894100106112118124130ru101520255e41e315e32e325e3360和其mab结合mab偶联于传感芯片上152000m8种样品浓度每个浓度重复3次分子复合物的生成和解离的速度有多快
Fortebio生物分子相互作用检测平台-中文版
Intensity λ =
ƒ(λ, ℓ)
Biolayer Interferometry（BLI）技术的原理
可实时检测到两个反射表面间距的改变
100% Relative Intensity 0
Distance between the two reflecting
nm shift
Wavelength (nm)
Octet Solution
ForteBio Inc.—艾瑞生物技术（上海）有限公司
• 公司的历史：
• • 2004年成立，在美国加州Menlo Park, 英国London, 和中国 上海建有生产和技术中心
• 独到的技术：
• • • • • • • • 新一代的label-free technology 生物膜干涉技术BioLayer Interferometry Technology（ BLI ）
buffer、预湿试剂、洗涤试剂分 别放置在不同的微孔板中
- 384样品板利用率100%
- 两个板位可独立使用96-plate或 384plate
Octet 系统与工作站联用
• Automated door and plate stage • Works with articulated arm and track-style robotic systems • Plate stage presents the biosensor tray, sample and reagent plates for robot • Octet software has automation hooks enabled to interact with robot software
• 皮克到毫克级的动态范围 污染物检测
Octet BLI 小分子动力学检测亲和力数据分析-2第二章-Small Molecule Kinetics-by column
1.双击数据分析软件图标，打开数据分析软件，在软件Data Selection界面左下侧子窗口路径下选中待分析kinetics数据：2.双击后载入左上侧子窗口Loaded Data Kinetics文件夹下3.左键单击所载入待分析数据，右侧窗口显示Sensor Tray按钮下界面，即该检测中sensor所在sensor tray上位置，在此可选择分析哪些sensor采集的数据，本例分析所有sensor的数据4.该窗口另一个按钮Summary按钮下界面如下，包括实验运行信息，检测程序的步骤及时间、板孔排列等。
5.选择所需分析sensor后，点击Processing进行数据处理：6.数据处理界面如下，该窗口左侧依次包括Step1:Data Selection，Step2:Subtraction，Step3:Align Y Axis，Step4:Inter-step Correction，Step5:Process，Step6:View Results，Step7: Save Results；右侧窗口默认为Raw Data View下界面，即原始数据预览。
7.点击Step 1下Sensor Selection按钮，界面如下：8.对于非经典小分子实验，在实验设计上包括sensor对照和孔对照（间经典小分子实验设计SOP），与经典小分子实验相比其差别在于浓度梯度按列排列，1个浓度1根sensor（经典小分子实验浓度梯度安行排列，所有浓度采用同一根sensor从低到高顺序检测）；数据处理时需分别扣除对照孔及对照sensor引入的干扰；选中对照孔，右键下选择Change Well Type…下的Refference Well：设置Refference Well后界面如下：9.在Sensor Tray下选中对照Sensor，右键选择Change Sensor Type…下的Refference Sensor：设置Refference Sensor后的界面如下：10.在Step 2下选中Double Subtraction，即扣除对照空及对照sensor可能引入的干扰：。
BiaCore动力学亲和力分析
6
平衡常数(Equilibrium constants)
At equilibrium:
Biacore Training
Association ka M-1s-1 [A] M [B] M
Dissociation kd s-1 [AB] M
The equilibrium constants:
KA
KD
ka kd kd ka
•
在Biacore中，所检测到的反应速率是物质迁移 现象和分子间的相互结合作用的综合结果
» 通过使用合适的反应环境，质量转移导致的影响能够 被最大程度地控制
12
什么是物质迁移? • 扩散的物质迁移
» 单一样品在静态的系统中
Biacore Training
分析物 梯度
•
经过一定的时间，靠近芯片表面的分析物的浓度将 会逐渐降低，并逐渐在溶液中形成一个分析物浓度 梯度
浓度 = 100 nM 浓度 = 1000 nM
所有靶位 点被占据
Response
(M-1s-1) (s-1)
kon
koff
10-2 10-3 10-4 10-5
30 min 60 min
106 105 104 103
30 min 60 min
时间
时间
4
用Biacore获得动力学和亲和力数据的3种方式
» 高流速有效减少了扩散距离
• •
可选的预设分析模式中已考虑了物质迁移效应
15
实验设计
实验设计
稳态实验--分析亲和力
Biacore Training
• • • • • •
通过一系列不同的分析物浓度，确定达到稳态的结合水平 较高的偶联水平 浓度范围至少应该覆盖芯片表面的 20-80% 饱和度(RMAX) 设置对照芯片表面 设置至少一个浓度的样品重复 设置零浓度样品
酶活力及其动力学常数的测定
3．动态法 该法连续监测酶反应进行的程度，同时记录不
同时间点产物生成(或底物减少)量，然后计算 出单位时间内产物的增加(或底物的减少)量即 酶活力，再计算出其比活力。
目录
4. 偶联酶法
许多反应的底物或产物不能直接被检测 两种方法解决： ①在反应终止后，加入一种新的物质，其可以和产物
目录
2．半动态法 于不同时间分别从反应体系中取出一定量的样
品，迅速置于反应终止液中，然后通过检测并 计算反应后不同时间样品中的底物减少量 (或 产物增加量)，从而计算出反应速度。
目录
本实验中的时间点间隔根据实验确定。 一般是酶活性高，时间间隔短；酶活性低，间隔可适当延长。
选用的时间点一般以3～5点为宜
0.5
temperature)：
酶促反应速度最快时的 环境温度。
* 低温的应用
0 10 20 30 40 50 60
温度 ºC
温度对淀粉酶活性的影响
目录
四、 pH对反应速度的影响
酶 活 性
最适pH (optimum pH)：
胃蛋白酶
淀粉酶
胆碱酯酶
酶催化活性最大 时的环境pH。
0
2
4
6
8 10 pH
选择使用底物时 1．应选择V-[S]曲线中的线性部分对应的底物浓度。 2．由于是双倒数作图，故选择[S]时，最好选用1／[S]呈
常数递增的数值， 3．理论上分析，[S]≈Km时，测定Km及Vm最准确，
目录
目录
目录
四、Km Km是酶活性部位的一半被底物占据或酶反应
达到最大反应速度一半时所需要的底物浓度， 是一定温度下酶的特征常数，又称米氏常数。 同一酶的不同底物有不同的Km。 1/Km表示酶底亲和常数， 1/Km愈大，则亲 和力愈大
蛋白质间分子动力学模拟及数据分析
精品课件
12
结合能的相关计算
结合能可以用于确定受体和配体是否能够结合，还可以用来比较受体和不同配体结合 能力的不同。对于结合能的计算我们用的是Ambertools里面的MMPBSA.py 原理和更详细过程参见：/tutorials/advanced/tutorial3/py_script/ 步骤： (1) 生成mdcrd文件 在终端中输入以下命令： cptraj complex_water.prmtop >trajin complex.dcd >trajout complex.mdcrd >go （2）生成无水的prmtop 在终端中输入以下一条命令： ante-MMPBSA.py -p complex_water.prmtop -c complex.prmtop -r receptor.prmtop -l ligand.prmtop -s ':WAT,Na+,Cl-' -m ':1-85' #1-85为受体的氨基酸编号范围
grep -v '^.............H' complex.pdb > complex_NoH.pdb #删除H
精品课件
6
三、生成模拟需要的拓扑文件和坐标文件
原理: 用 NAMD进行分子动力学模拟需要坐标和拓扑文件,坐标文件记录了各个质点所座落的 坐标,拓扑文件记录了整个体系各质点之间的链接状况、力参数电荷等信息。这两个文 件是由Ambertools中的leap 程序生成的。
MMPBSA.py -O -i mmpbsa.in -o FINAL_RESULTS_MMPBSA.dat -sp complex_water.prmtop -cp complex.prmtop -rp receptor.prmtop -lp ligand.prmtop -y *.mdcrd& #焓和熵的运行命令是一样的，两者的区别在于配置文件mmpbsa.in里的内容不同 （5）结合能的最终结果 结合能=焓的结果-熵的结果 论文参考：《Computational Studies and PeptidomimeticHuman p53–MDM2 Complex》by Haizhen Zhong and Heather A. Carlson
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1.双击数据分析软件图标，打开数据分析软件，在软件Data Selection界面左下侧子窗口路径下选中
待分析kinetics数据，双击后载入左上侧子窗口Loaded Data Kinetics文件夹下：
2.左键单击所载入待分析数据，右侧窗口显示Sensor Tray按钮下界面，即该检测中sensor所在sensor tray
上位置，在此可选择分析哪些sensor采集的数据，本例分析所有sensor的数据
3.该窗口另一个按钮Summary按钮下界面如下，包括实验运行信息，检测程序的步骤及时间、板孔排列
等。
4.选择所需分析sensor后，点击Processing进行数据处理：
5.数据处理界面如下，该窗口左侧依次包括Step1:Data Selection，Step2:Subtraction，Step3:Align Y Axis，
Step4:Inter-step Correction，Step5:Process，Step6:View Results，Step7: Save Results；右侧窗口默认为Raw Data View下界面，即原始数据预览。
6.点击Step 1下Sensor Selection按钮，界面如下：
7.对于经典小分子实验，在实验设计上包括sensor对照和孔对照（间经典小分子实验设计SOP），数据
处理时需分别扣除对照孔及对照sensor引入的干扰；选中对照孔，右键下选择Change Well Type…下的Refference Well：
设置Refference Well后界面如下：
8.在Sensor Tray下选中对照Sensor，右键选择Change Sensor Type…下的Refference Sensor：
设置Refference Sensor后的界面如下：
9.在Step 2下选中Double Subtraction，即扣除对照空及对照sensor可能引入的干扰：
10.在Step 3下Step框下拉菜单中选择Baseline，起止时间可采用默认时间，也可适当将起始时间调整至
靠近中止时间5~10s（尤其在基线起始段有跳动或未平整时）。
注意：对于需要分析结合解离等参数样品，必须设置Baseline步骤！
11.勾中Step 4后小方框，选择Align to Dissociation，该步骤适用于解离与基线检测在相同板孔中进行，可
理解为交互步骤校正。
注意：如果实验设计中基线与解离在不同板孔中进行，不需勾中Step 4后方框！。