石蜡切片制作

石蜡切片操作

一、试剂配制

1、固定剂：36％~40％福尔马林液5ml ；冰醋酸5m1；50%酒精89ml；

2、1%番红染液：番红2g，乙醇100ml，水100ml

3、0.5%固绿溶液：固绿0.5g，乙醇95ml，水5ml

4、各级浓度酒精的配制70%；85%；95%；100%酒精。70%和85%酒精用95%酒精配制；（取70ml95%酒精，加水至95ml，即为70%酒精）

6、粘片剂：鸡蛋清一个，打碎，除去泡沫，加入等量的甘油

二、实验步骤

1、固定：组织块大小：1.5×1.5×0.2 CM 固定液> 4倍组织体积

福尔马林固定液12—24 h后用蒸馏水洗

2、脱水：

70%乙醇1h 85%乙醇1h 95%乙醇1h 100%乙醇0.5—1h 100%乙醇0.5-1h

3、透明：

100%乙醇：二甲苯（1：1）2h (加少量番红) 二甲苯1.5h

二甲苯1.5h （溶液占瓶子1/3，不倒掉，直接加小蜡块透明）注意：时间太长变脆

4、浸蜡：材料和蜡块不相接触，置换组织中的透明剂，为包埋做准备。

方法一：石蜡熔点52—56℃温箱：56℃二甲苯：石蜡（1：1）1-2小时；石蜡1-2小时；石蜡1-2小时

方法二：1）常温加蜡至饱和（大概加6-7快）；2）35℃加蜡块3-6h，不溶为止，可过夜3）60℃盖瓶盖2h(3-4块)，开盖6h（溶液是原来的2倍，占瓶子2/3），至二甲苯完全挥发，可过夜

4）纯蜡（60℃-65℃）2h

5）纯蜡（60℃-65℃）2h

5、包埋

准备包埋蜡：硬蜡（56~58℃或60~62℃）为好，所用的石蜡要求透明无杂质，新的石蜡要反复熔凝，并有一定的粘韧性。

②折纸盒，写好标签。

③点燃酒精灯，准备好无齿尖镊子

④在纸盒中倒入56℃-58℃的石蜡，然后用无齿镊子取组织块放入石蜡中，置好方向。可室温下冷却。

⑤当纸盒内的蜡逐渐凝结，若表面已凝结形成一层固体状，即可放入冷水中，加速其凝固。

⑥待蜡块完全凝固以后，便可拆开纸盒，取出蜡块。

6、切片

（一）切片前的准备

1．磨刀：传统的切片刀在使用之前，一定要在显微镜下检查刀口的损伤程度，然后进行磨刀。现在也可以使用一次性刀片，可省去磨刀。

2．修整蜡块：切去组织周围过多的石蜡，一般情况下在组织周围留有约1~2mm的石蜡边，上下两边必须平行。

3．蜡块固定：修整好的蜡块先固定在事先准备好的小方木块或者金属块上，固定方法是把蜡铲先在酒精灯上加热，再将蜡块底部烙熔，迅速烙粘在小方木块或金属块底座上。

5．准备好毛笔、镊子、染色架。

6．调好展片器内水的温度（45℃），有时也可以加些酒精到水中。

（二）切片

a．将切片刀装在刀片机的刀架上并固定紧，固定蜡块底座或蜡块，调整蜡块与刀至合适位置，刀刃与蜡块表面呈5度角。

b．切片多使用轮转式切片机，切片时，左手执毛笔，右手转切片机转轮，先修出组织块。c．调整切片机上的切片厚度为4~7µm，然后切片。

7、展片和捞片：

（1）直接展片法：在载玻片上滴加几滴蒸馏水，然后把切片铺在小水滴上面，用酒精灯在载玻片下面加热，待完全展平，倾斜载玻片，倒弃多余水分，同时摆正切片。

（2）温水漂浮法：先使恒温水浴箱水温保持在45℃左右，用左手拿毛笔轻轻托起切片，用右手用眼科镊子夹起切片的一角，光面向下轻轻平铺放于水面上，动作要轻快，切好的石蜡切片漂浮在温水中受热后及在表面张力的作用会自然平整地展开，必要时可用镊字轻轻拔开，然后将涂过少许蛋白甘油的载玻片沉至切片下面，然后将切片从水面取出。最后将切片置于50℃保温箱内烘干，小片组织30分钟即可，大的需5~24小时，烤干备用，并及时编号。8、HE染色法

1) 脱蜡二甲苯I 45 min—1h (45℃)；二甲苯II 10 min (45℃)

2) 水化(复水)

1/2二甲苯+1/2100%酒精10min ——无水酒精5min ——95%酒精5min ——

85%酒精5min ——70%酒精5 min—先用自来水而后用蒸馏水洗0.5min

3）苏木精染色

苏木精40℃染色5-10分钟（有时染色时间会更长），自来水洗15-20分钟，直到切片变蓝盐酸酒精分化15秒（依切片兰色而定，兰色深多分化几秒，时间不能太长）

自来水洗或蒸馏水洗几次，70%酒精1分钟

4）0.5%伊红染色不到1分钟（依条件而定有时就几秒）

85%酒精5分钟——95%酒精5分钟——100%酒精5分钟——100%酒精5分钟

——1/2二甲苯+1/2100%酒精5分钟——二甲苯I 5分钟——二甲苯II 5分钟

5）封片中性树胶封片上述处理好的玻片，取中性树胶滴入载玻片的组织上，取盖玻片从一端逐步盖下去，避免发生气泡

9、番红-固绿染色

二甲苯10分钟一—二甲苯10分钟一一1/2100%乙醇+l/2二甲苯10分钟一一1/2100%乙醇+l/2二甲苯10分钟一一100%乙醇5分钟一—100%乙醇5分钟一95%乙醇5分钟.一85%乙醇5分钟一70%乙醇5分钟一1%番红酒精溶液染色24小时一一70%乙醇5分钟一85%乙醇5分钟一固绿染色1分钟一.—95%乙醇5分钟一一100%乙醇5分钟一.一——100%乙醇5分钟一,.一1/2100%乙醇+l/2二甲苯10分钟一—1/2100%乙醇+l/2二甲苯10分钟一—二甲苯10分钟一一二甲苯10分钟一一中性树胶封片