放线菌的筛选

• 2.2 拮抗菌株的初筛 将分离到的已纯化的放线菌菌株接种到高氏一 号平板上，于28℃下恒温培养。7d后，用打孔器 将菌苔打成直径为7mm的菌饼备用。以水稻稻瘟 病菌、小麦根腐病菌、燕麦镰孢菌、大豆丝核菌、 尖孢镰刀菌为供示病原菌，采用平皿对峙法对分 离到的放线菌进行初筛。 以PDA平板原点为中心划垂直十字，中央接入 直径为7 mm的供试菌菌饼，十字的每端接入不同 的放线菌菌饼。置于28℃培养箱中培养3-5 d，每 个处理重复3次。测量各待测菌株菌落边缘与供试 病原菌菌落边缘之间的抑菌带距离。如病原菌与 放线菌生长速度相差不多，菌饼可同时接入；病 原菌生长缓慢的，放线菌可延迟接入1-2 d。
放线菌菌落
放线菌的形态
放线菌的筛选
1.材料 2.方法 3.结论
放线菌的筛选
• 1材料 • 1.1供试土样 夏季从吉林省采集不同地区、不 同植被的土样,去表层土，挖5-20cm 深度的土壤数10g，装入已灭菌的牛 10g 皮纸袋，封好袋口待回实验室。 • 1.2供试菌株 水稻稻瘟病菌、尖孢镰刀菌、大豆丝 核菌、小麦根腐病菌和燕麦镰刀菌。
2.4抗菌谱的测定 用加入1％甘油的普通琼脂培养基 倒平板（A皿、B皿），A皿不添加抗 生素做对照，B皿加入抗生素。将试 验菌分区涂于琼脂培养基平板上并做 记号（A、B按同样的序号涂板）。 培养一定时间，观察菌体生长情况。
3结论
• 3.1土壤中放线菌的分离 利用稀释涂布法对采自全国不同省份、不同地区的48 份土样中的放线菌进行分离纯化，得到分离结果 • 3.2拮抗菌株的初筛 以水稻稻瘟病菌、尖孢镰刀菌、大豆丝核菌、小麦根 腐病菌及燕麦镰刀菌等5种病原真菌为供试菌，利用平皿 对峙法测定不同放线菌对不同病原菌的拮抗作用，以抑菌 带宽度的大小作为拮抗菌株的初筛依据。抑菌带宽度大于 20 mm的归入很强抑制作用类群，抑菌带在10-20 mm之 间的归入较强抑制作用类群。结果有放线菌对供试病原菌 具有较好的抑制作用，靠近拮抗菌株一侧的供试菌菌丝表 现为向上或向后延展生长。有菌株对水稻稻瘟病菌的抑制 作用最强，对小麦根腐病菌也有很好的抑制效果。因此， 将该菌株归为具有很强抑制作用类群。
• 1.3培养基 • （1）放线菌分离培养基 高氏一号培养基：可溶性淀粉20g，氯化钠0.5g，磷酸氢 二钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.5g，硝酸钾1g，琼 脂15g，蒸馏水1000mL，调pH值至7.2-7.4，于121℃下 灭菌30min。 • （2）放线菌液体发酵培养基 小米培养基：小米10g加入到1000mL蒸馏水中煮沸，30 min后过滤。加入葡萄糖10g，蛋白胨3g，氯化钠2.5g， 碳酸钙2g，补蒸馏水至1000mL，调pH值为7.2-7.4。每 125mL分装到500mL三角瓶内，于121℃下灭菌30min。 • （3）病原真菌及拮抗试验用培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：去皮马铃薯200g， 洗净切块后放入1000mL蒸馏水中煮沸，30 min后过滤。 加入葡萄糖20 g，琼脂20 g，补蒸馏水至1000 mL，于 121℃下灭菌30 min。
• 1.4 主要仪器 BCD-265冰箱 FA2004N电子天平 pH S-3C酸度计 TGL-16G型高速台式离心机 YXQ-L31-400蒸汽灭菌锅 GRP-9050隔水式恒温培养箱 DL-CJ-2N高性能无菌实验台 HZQ-Q全温振荡器 QL-901旋涡混合器
• 2.方法 • 2.1土壤中放线菌的分离、纯化 • （1）土样的预处理 将采集到的土样自然风干，按1：10的比 例加入碳酸钙，28℃培养箱内放置5-7d。 • （2）土壤悬浮液的制备 研钵研磨预处理的土壤样品至颗粒均匀。 称取1g土样加入装有l0mL无菌水的试管中， 充分震荡10min，制成浓度为10-1的土壤稀 释液。吸取1mL上清液，加到装有9mL无菌 水的试管中震荡成10-2的稀释液。依照同种 方法制备浓度分别为10-3、10-4、10-5的土 壤稀释液。
• 平板计数法样品的稀释和稀释液的取样
• （3）稀释涂布法分离放线菌 移液枪吸取0.2mL浓度分别为10-3、10-4、 10-5的土壤稀释液，加入到高氏一号平板上， 无菌涂布棒涂布均匀，放入28℃培养箱内倒 置培养3-7 d。观察菌丝的生长速度、菌落 的颜色、大小等培养特征，记录菌株的培养 情况，及时将放线菌单菌落转接至新鲜的高 氏一号平板上。 • （4）菌种的纯化 采用划线分离法对菌株进行纯化。如果平 板上细菌或霉菌污染严重，可先将放线菌接 入分离培养基中，待长出单菌落后再转接斜 面上进行培养，7 d后放入4℃冰箱中冷藏。
• （3）管碟法测定滤液的拮抗作用 培养好的病原菌制成一定浓度的菌悬 液，与适量PDA培养基充分混匀，倒入 无菌培养皿内制成带菌平板。待培养基 凝固后，在板的中央放置1个牛津杯，加 入0.2mL发酵滤液，每个处理重复3次。 以加蒸馏水的PDA平板为对照。置28℃ 恒温箱中培养，5 d后利用十字交叉法测 量抑菌圈直径。 结合初筛及发酵滤液对病原菌的拮 抗试验，确定目的菌株。
• 3.3抑制菌丝生长速率法测定滤液的 拮抗作用 对初筛效果较好的放线菌进行液 体发酵培养，利用抑制菌丝生长速 率法测定发酵滤液对病原菌的抑制 作用，进一步筛选具有抑菌活性的 拮抗菌株。菌落直径增长越快，表 明病原菌菌丝生长越旺盛，放线菌 的抑制率越低；反之，放线菌抑制 病原菌菌丝生长的效果越好，抑制 率越高，得出研究结果。 • 3.4管碟法测定滤液的拮抗作用 将在抑制菌丝生长速率试验中具 有较强拮抗作用的放线菌进行管碟 法试验。
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• 2.3菌株发酵滤液的拮抗性测定 选择初筛拮抗效果较好的放线菌进行液体发酵培养， 利用抑制菌丝生长速率法和管碟法测定菌株 • 发酵滤液对不同病原菌的拮抗作用。 （1）发酵滤液的制备 将孢子浓度为108个/mL的放线菌接种到液体发酵培 养基中，于28℃，200 rpm/min摇床中恒温培养，5 d 后取发酵液于4500 rpm/min条件下离8min，上清液经 微孔滤膜过滤，得发酵滤液。 （2）抑制菌丝生长速率法测定滤液的拮抗作用 取1mL发酵滤液与9mL融化的PDA培养基充分混匀， 倒入无菌培养皿中制成带药平板。待培养基凝固后， 在板中央接入一直径为7 mm的病原菌菌饼（带有菌丝 的一面贴在培养基表面），每个处理重复3次，以加 1mL蒸馏水的PDA平板为对照。培养5d后，十字交叉 法测量供试病原菌菌落直径，通过下述公式计算抑制 率
放线菌 放线菌是一类广泛存在于自然界中且具有 极大应用潜力的微生物资源，其代谢产生 的抗生素、疫调节剂、酶等物质不仅在工 业、医学等领域得到广泛地应用，在植物 病害的生物防治中也占有极其重要的地位。 微生物代谢产生的上万种抗生素中，53% 以上是放线菌产生的，因此，放线菌在植 物病害的生物防治中很有开发应用的前景。 但目前就其在数量、质量及种类等方面还 远远不能满足现代农业生产发展的需要， 世界各国均在大力开展拮抗放线菌的筛选 工作，以期寻找到对植物真菌病害进行防 治的优良品种。