结核分枝杆菌实验活动风险评估方案报告

第六节结核分枝杆菌实验活动风险评估报告

一、生物因子

（一）一般特性

结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis)，于1882年由德国微生物学家Koch发现并证实为结核病的病原菌。1886年，Lehman和Neuman正式将其命名为结核分枝杆菌，又称结核菌。

1.形态与染色

结核分枝杆菌细长略弯曲，端极钝圆，大小约（1～4)μm×(0.3～0.6)um ,呈单个或分枝状排列，有时呈V、Y、人字型排列，无鞭毛和芽孢。多数学者认为结核分枝杆菌无荚膜。结核分枝杆菌常用萋-尼氏（Ziehl- Neelsen)抗酸性染色法染色，染色后结核分枝杆菌呈现红色，其他非抗酸性细菌呈蓝色。结核分枝杆菌除正常典型杆状形态外，在陈旧的病灶和培养物中，形态常不典型，可呈颗粒状，串球状，短棒状，长丝形等；或受物理因素、化学因素，以及药物等因素的影响，而呈现异常变化；另外，还有可通过在内在电镜下观察细菌滤膜的滤过型、细胞壁缺损或丧失的细胞壁缺陷L型，以及存在于结核病灶、浆液性渗出液等样品可看到的革兰染色阳性颗粒的球状微粒型。

2.生长特性和培养

结核分枝杆菌为缓慢生长细菌，较普通细菌生长十分缓慢，在动物体内繁殖代时约为15h,在家兔角膜中约需要20～22h，在巨噬细胞内月需要15～20h。体外生长时营养要求高，可在含有蛋黄、马铃薯、甘油和天门冬素或动物血清等的固体培养基上生长。最适PH6.4～7.0，在35～40℃可生长，最适温度为35～37℃。常用的培养基有罗氏培养基、小川培养基、油酸血清（白蛋白）琼脂培养基和苏通液体培养基等，在良好的培养条件下，生长代时约18～24h，培养2～4周才出现肉眼可见的菌落。在固体培养基上菌落呈颗粒、结节或花菜状，乳白色或米黄色，不透明；而在液体苏通培养基内呈粗糙皱纹状菌膜生长。

3.生化反应

结核分枝杆菌能够产生硝酸盐还原酶，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐；在酸性条件下，亚硝酸盐与氨基苯磺胺、N-甲萘基乙烯二铵盐酸盐形成红色偶氮化合物。牛分枝杆菌和部分非结核性分枝杆菌不能产生硝酸盐还原酶，因此可用于结核分枝杆菌与牛分枝杆菌的鉴别。结核分枝杆菌缺乏烟酸酶，故不能分解代谢过程中产生的烟酸，在培养中，结核分枝杆菌生长时的烟酸聚集量较牛分枝杆菌及其他分枝杆菌高。烟酸砒啶环的氮与联苯胺及溴化氰作用后，呈现桃红色或红色沉淀反应。通过烟酸试验可以将结核分枝杆菌同其他分枝杆菌区分。

4.免疫学特性

抗结核免疫反应在结核分枝杆菌感染中起着根本作用，免疫系统能有效地抵抗大多数感染，感染结核分枝杆菌的大多数人（约90%）在其一生中并不能发展成患有结核病。然而，当与免疫系统疾病同时存在时，如合并感染人类免疫缺陷病毒（HIV）,发展为结核病的机会就会大大增加。

结核分枝杆菌是胞内感染菌，其免疫主要是以T细胞为主的细胞免疫。当结核分枝杆菌侵入人体内，被巨噬细胞吞噬后，未活化的巨噬细胞的抗菌活性弱，不能防止所吞噬的结核分枝杆菌生长，但可递呈抗原，使周围T淋巴细胞致敏。致敏淋巴细胞可产生多种淋巴因

子，如IL-2、IL-6、INF-γ。这些因子与TNF-α的共同作用可杀死结核分枝杆菌。

结核分枝杆菌的免疫属于感染免疫，又称有菌免疫，即只有当结核分枝杆菌或其组分存在体内时才有免疫力。一旦体内的结核分枝杆菌或其组分全部消失，则免疫也随之不存在。

5.遗传特性

结核分枝杆菌基因序列有4400多万bp，包含了4000多个基因，有很高的鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）含量。结核分枝杆菌基因组在进化过程中形成了不同的分枝，主要有北京家族、东非-印度分枝、中亚或德里家族、哈勒姆家族、拉丁美洲和地中海家族等，其中北京家族有高毒力和高致病性。

6.耐药性

结核分枝杆菌产生耐性的机制主要是靶编码基因的突变所致。结核分枝杆菌的自然耐药突变率为10-10～10-5之间。当结核分枝杆菌的编码基因发生突变后，其对耐药的敏感性表型发生改变，这样的突变是随机、自发的，并和是否与药物接触无关。在一个菌群中，耐药个体的出现是以一定频率产生的，并随着药物对敏感菌体杀灭的选择作用，耐药菌体的比例逐渐增加，直至成为耐药菌优势菌群。耐药结核分枝杆菌可以分为原发耐药、初始耐药和继发耐药，但结核分枝杆菌会出现交叉耐药的情况，即对一种药物产生耐药后，同时又对另一个药物也产生敏感性的改变。

（二）来源

结核杆菌可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病是一种古老的疾病，也许有了人类之后，不久就有了它的存在。1965年，法国学者Sylvius根据解剖了死于所谓“消耗病”或“痨病”人的尸体，发现肺脏及其他器官有颗粒状的病变，根据其形态特征称之为“结核”。1973年，湖南长沙马王堆汉墓出土的2100年前的女尸身上发现左上肺门均有结核病灶。因而，结核的名称就此被应用至今。

（三）传染性

因结核病病变进展的患者痰中带有大量的结核杆菌，故这类患者是结核病的主要传染源，痰中的结核杆菌越多，传播的危险性就越大。病人出现痰涂片阳性，若1mL痰液中含菌量为1000～10000，则其痰涂片阳性率为40%～50%。病人排菌量越大，其密切接触者的感染率也就越高。结核杆菌菌株之间毒力有较大差异，不同类型的病人排出结核杆菌不仅在数量上不同，其毒力也不同，因而其传染性亦不同。感染的结核杆菌活力越强，数量越大，传染性也越强。

感染药物敏感菌的结核病患者在未治疗时的相对传染性为100%。通常，结核病患者经一段时间治疗后，结核杆菌对人的感染能力减弱，相对传染性降为25%；感染耐药菌的病人未治疗时相对传染性为100%，在治疗时则降为27.3%。

(四)传播途径

结核分枝菌主要通过呼吸道传播，传染源主要是排菌的肺结核病人（尤其是痰涂片阳性，未经治疗者）的痰。飞沫感染为最常见的方式，健康人吸入患者咳嗽、打喷嚏时喷出的飞沫而受感染。直径小于10um的痰滴可进入肺泡腔，或因其重量轻而漂浮于空气中较长时间，在室内通风不良环境中的带菌飞沫，亦可被吸入引起感染。感染的次要途径是经消化道进入体内。少量、毒力弱的结核分枝杆菌多能被人体免疫防御机制所杀灭。仅当受大量毒力强的