5第五章 代谢调控育种

⑷利用营养缺陷型回复突变株或条件突变株的方法， 解除终产物对关键酶的调节；
⑸应用遗传工程技术，创造理想微生物（即构建目 的工程菌株）。
此外，发酵条件如pH值、NH3的供应、溶氧水平、 营养浓度控制及表面活性剂的使用等也非常重要。
一. 切断支路代谢
1. 营养缺陷突变株的应用
营养缺陷型即菌株发生基因突变，合成途径中某一 步骤发生缺陷，丧失了合成某些物质的能力，必须在 培养基中添加该营养物质才能生长。
第五章 微生物 代谢控制育种
第一节 代谢控制育种的基础
代谢控制发酵理论的建立
代谢控制发酵理论最开始是应用于氨基酸高产菌株 的选育中；随后，核苷类物质发酵生产菌也以代谢控 制理论去选育，并奋起直追成为后起之秀。
随着研究的深入，代谢控制发酵理论的作用，已由 野生型菌株的发酵向高度人为控制的发酵转移，由依 赖于微生物分解代谢的发酵向依赖于生物合成代谢的 发酵，即向代谢产物大量积累的发酵转移。
一个菌株经过突变和回复突变后，某一结构基因 编码的酶会经历失活→恢复活性的过程，但酶的调节 部位的结构常常并没有恢复。所以经过此过程后，该 酶的反馈抑制被解除或削弱。因此可以利用营养缺陷 型的回复突变来获得解除反馈抑制从而提高产量的菌 株。
例如，先将金霉素生产菌绿链霉菌诱变成蛋氨酸 缺陷型，然后再回复突变成原养型，结果其中有85% 的回复突变株的金霉素产量提高了1.2~3.2倍。
通过选育某些营养缺陷型或结构类似物抗性突变株 以及克隆某些关键酶的基因，也可以使目的产物前体 的合成增加，从而有利于目的产物的大量积累。
1. 在分支合成途径中，切断控制共用酶的非目的终 产物的分支合成途径，增多目的产物的前体，使目的 产物的产量提高。
在谷氨酸棒状杆菌、北京棒状杆菌、黄色短杆菌、 大肠杆菌等微生物中，Lys、Thr、Met的合成关键酶是 天冬氨酸激酶，该酶受Lys、Thr的协同反馈抑制，即 天冬氨酸激酶在Lys或Thr单独存在时不受抑制，仅当 两者同时过量时才引起抑制作用。因此，在Thr限量培 养时，即使Lys过剩，也能进行由天冬氨酸生成天冬酰 磷酸的反应（即第一步反应）。
二. 酶合成的调控
微生物合成体系中，常通过代谢产物抑制酶的生物
合成或诱导酶的生物合成，来调节生物合成的代谢过程。
由代谢终点产物抑制酶合成的负反馈作用称为反馈阻遏
(feedback repression) ， 反 之 ， 正 反 馈 称 为 诱 导 作 用 (induction)。
根据生物合成途径的代谢模式，阻遏可以分成各种 类型。在单功能生物合成途径中，最简单的类型是协调 阻遏；另一种类型为代谢终产物阻遏第一个酶的生物合 成，但第一个酶所催化的中间产物能诱导第3、4个中间 产物的合成。
渗漏缺陷型的筛选方法是把大量营养缺陷型菌株接 种在基本培养基上，挑选生长特别慢而菌落小的菌株。
例如，使枯草芽孢杆菌腺嘌呤和组氨酸双重缺陷突 变株（Ade－His－）再带上黄嘌呤渗漏缺陷标记（L）， 结果使肌苷的积累量提高了近70%。
二. 解除菌体自身的反馈调节
1. 选育抗类似物突变株
类似物是指在结构上和代谢终产物相似的物质。它 们和终产物一样能和别构酶的调节中心（即别构中心） 结合，引起反馈抑制；区别在于终产物和酶的结合是 可逆的，而结构类似物对微生可将酶分为 调节酶、静态酶和潜在酶，其中调节酶常称为关键酶， 又包括变构酶、同工酶和多功能酶。
关键酶（Key enzyme or switching enzyme）是参与 代谢调节的酶的总称。作为一个反应链的限速因子， 对整个反应起限速作用。这些酶在代谢流的枢纽之处 形成支柱，对代谢流的质和量都起着制约作用。因此， 想要选育出某种目的产物生产菌，首先要了解这种物 质的生物合成途径、关键酶以及关键酶受怎样的反馈 调节，再考虑如何解除，随之设计出正确的育种方案 来。
一. 酶活力调节类型
1. 在单功能途径（unifunctional pathway）中 酶活性的调节类型
I型在氨基酸生物合成代 谢作用中多见；II-A型在分 解代谢中较常见；II-B性型 具有重要生理作用，可以理 解为终产物抑制的补偿性拮 抗 现 象 。 II-B 的 关 键 在 于 H→I 必 须 供 给 定 量 的 E ， 所 以H能激活A→B的反应。
但是该酶受Arg阻遏，如果培养基中存在过剩的Arg， Arg就会阻遏乙酰鸟氨酸酶的合成，使Lys不能生成， Lys－菌株就不能生长。所以在Arg存在下形成的菌落为 Lys＋，有可能就是乙酰鸟氨酸酶的去阻遏突变株。
在Lys－ 中乙酰赖 氨酸的代 替作用
3. 营养缺陷型回复突变株的应用
当难以找到合适类似物、反馈调节又很复杂时， 可选育营养缺陷型回复突变株来获得高产。
代谢控制发酵（Metabolic control fermentation）， 就是利用遗传学的方法或其他生物化学方法，人为地 在脱氧核糖核酸（DNA）的分子水平上，改变和控制 微生物的代谢，使有用目的产物大量生成、积累的发 酵。
代谢控制发酵的出现与发展，与以下几方面是密不 可分的：
⑴ 生物化学的发展确立了代谢图，随着代谢途径研 究的不断深入，发现了反馈调节机制，特别是酶的别 构动力学指出了许多酶活性调节的基本类型；
微生物遗传学的发展，发现了分解代谢途径操纵子 （如乳糖操纵子、组氨酸操纵子、麦芽糖调节子等） 和合成代谢途径操纵子（如色氨酸操纵子、苯丙氨酸 操纵子等）的调控机制，从而阐明了微生物代谢的调 节机制。
⑵ 分子生物学和分子遗传学的发展，可以人为地在 DNA分子水平上改变微生物的代谢，多方面利用微生 物代谢活性，使微生物的酶学性质按人为目的变化。
这是因为，在金霉素的合成过程中，甲基的供应 具有关键性的作用，而回复突变使得蛋氨酸的合成不 受反馈抑制，结果使得金霉素含量随蛋氨酸含量的提 高而提高。
Demain也将金霉素生产菌先诱变成不产抗生素的 菌株，然后再进行回复突变，结果从中获得了一株金 霉素高产菌，其金霉素产量提高了6倍。
三. 增加前体物的合成
抗类似物突变株也称为代谢拮抗物抗性突变株，不 再受代谢终产物的反馈阻遏和反馈抑制，即在终产物 积累的情况下仍可不断合成产物，生产较为稳定；另 外抗类似物突变株也不易发生回复突变，因此在发酵 生产上被广泛采用。
抗类似物突变株的产生可能是由于其别构酶的结构 基因发生突变，使别构部位不能再与代谢拮抗物结合 （别构酶脱敏）；也可能是由于其调节基因发生突变， 使阻遏物不能再与代谢拮抗物结合。选育此类突变株 用含有结构类似物的培养基，野生型细胞不能生长， 抗结构类似物突变株则能生长。
例 如 选 育 精 氨 酸 的 产 生 菌 。 将 Lys 营 养 缺 陷 型 （Lys－）菌株接种于添加乙酰赖氨酸（AC-Lys）和 过量Arg的戴维斯培养基中，培养后，从生长的菌落 中能够获得Arg生物合成酶系去阻遏的菌株。
因为在Arg生物合成酶系中，乙酰鸟氨酸酶的底物 专一性差，既可以以乙酰鸟氨酸为底物合成Arg，也 可以以AC-Lys为底物转换成Lys，所以Lys－菌株在有 AC-Lys存在时可以生长。
可以通过以下途径： ⑴使途径某一步骤发生缺陷，终产物不能积累。这 样就解除了终产物的反馈调节，使中间产物积累或另 一分支途径的末端产物积累； ⑵选育抗反馈调节的突变株。由于这样的菌株不再 受反馈调节作用的影响，使终产物得以积累； ⑶选育细胞膜通透型突变株。使最终产物在细胞内 不能积累到引起反馈调节的浓度；
多功能生物合成 途径中有两种类型： 一种是多价阻遏，几 个终产物共同协调阻 遏某一个酶的生物合 成；一种是积累阻遏， 每个分支合成途径的 终产物仅部分地阻遏 初始酶的合成。还有 就是同工酶的合成也 会受到终产物的阻遏。
第三节 代谢控制发酵的基本原理
代谢控制发酵能否获得成功，目的产物的产量高 低与否，取决于微生物细胞自我调节控制机制是否能 够被解除和解除的怎么样。最有效的方法就是造就从 遗传角度解除了微生物正常代谢控制机制的突变株。 突破微生物的自我调节控制的机制，而使代谢产物大 量积累。
一般是通过诱变选育各种突变株；通过转导、转化、 杂交、原生质体融合等细胞内基因重组方法获得目的 重组子；通过重组DNA技术构建工程菌等。
利用微生物进行发酵的沿革
⑶ 合理控制环境条件， 可以采用过程控制方法来 完善受控参数，对发酵过 程进行最优化控制，使目 的产物大量积累。
如图可以看出，利用 微生物进行发酵经历了天 然发酵、纯培养、通气培 养、代谢控制发酵、发酵 原料转变等过程，最终使 微生物发酵能广泛应用于 生物化学工业中。
在Thr－中，天 冬氨酸半醛可以进 一步转变成Lys和高 丝氨酸，高丝氨酸 又进而转变为Met， 却不能生成Thr， Lys即可大量生成。
2. 渗漏突变株的应用
渗漏缺陷型是一种特殊的营养缺陷型，是遗传性代 谢障碍不完全的突变型。其特点是酶的活力下降而部 完全丧失，能在基本培养基上少量生长，但生长特别 慢而菌落小；能少量合成代谢产物，又不造成反馈抑 制。其优点是不必添加限量的缺陷营养物。
2. 多功能途径（multifunctional pathway）中的 酶活性调节类型
单独无抑制作用
也称增效反馈抑制， 单独抑制部分
抑制作用累积
41%（50%） 16%（84%）
14%（43%） 13%（37.4%）
例如大肠杆菌谷氨酰胺合成酶共受8个最终产物的 积累反馈抑制。每种终产物发挥一部分抑制作用，8个 产物同时存在时，酶活力就被完全抑制。
随着代谢控制发酵理论的日臻完善，代谢工程应 运而生。
总之，代谢控制发酵的原理是工业微生物育种工 作的理论基础，它产生于生物化学、微生物遗传学的 基础研究，又促进了分子生物学的发展，并早已在发 酵工业中得到了广泛应用。
第二节 微生物细胞的调节机制
代谢控制机制的研究证明，酶的生物合成是受到 基因和代谢物的双重控制：一方面，酶的合成像普通 蛋白质的合成一样，受基因的控制，由基因决定形成 酶分子的化学结构；另一方面，仅仅有基因，并不能 保证大量产生某种酶，酶的合成还受代谢物（酶反应 的底物、产物及其类似物）的控制和调节，当有诱导 物存在时，酶的生成量可以几倍乃至几百倍的增加。
由于这种菌株是合成途径中发生缺陷，致使终产物 不能积累，因此也就遗传性地解除了终产物的反馈调 节，使得中间产物或另一分支途径的末端产物得以积 累。另外，也起到节省碳源的作用。
基本培养基
另外，在分支合成途径中，有时多个终产物 单独存在时都不能对其合成途径的关键酶实现 全部的反馈抑制或阻遏，因此可以利用这种机 制选育营养缺陷型菌株，使一个或两个终产物 合成缺陷而使另外的终产物得以积累。其中最 典型的例子就是用高丝氨酸营养缺陷型或苏氨 酸营养缺陷型菌株达到赖氨酸的积累。
F积累，抑制D→E
的反应，减少F的进
一步合成，更多的D
转到G，再由G合成I
或K；I积累，抑制
G→H的反应；K积累，
EⅠ EⅡ
同功酶的 反馈抑制
抑制G→J的反应，结 果造成G的积累，引 起G对A→B的反馈抑
制，使整个途径停止。
酶I和酶II都是催化A→B的同工酶。G过量时，酶II 停止活动，C也不能经过F到G；而与此同时，酶I活力 不受影响，A可以顺利到E，从而G过量不干扰E的合成。
此外，在微生物中，通过细胞膜的渗透性控制代 谢也是非常重要的。
主要内容包括： ⑴ 酶生物合成的控制机制
①诱导——促进酶的合成 ②阻遏——抑制酶的合成，包括：终产物阻遏、 分解代谢物阻遏 ⑵ 酶活性的控制机制 ①终产物抑制或激活 ②通过辅酶水平的活性调节 ③酶原的活化 ④潜在酶的活化 ⑶ 通过细胞渗透性控制代谢
精氨酸便可以通过选育抗类 似物突变株进行发酵生产。已 知与精氨酸合成有关的结构基 因以调节子的形式发挥作用。 当有精氨酸存在时，这些基因 所编码酶的合成都处于被阻遏 状态。
谷
氨
酸
棒
以 及 反 馈
调 节 部 位
杆 菌 中 精
氨 酸 的 生
物
合
成
途
径
2. 酶特性的利用
当找不到有效类似物时，如果目的产物生物合成 途径中的某一酶的底物专一性宽，则可利用该酶对其 他底物的利用活性，选育到代谢调节突变株。