DNA分子标记种类剖析
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
DNA分子标记种类剖析
1.1.1随机扩增多态性DNA(RAPD)
该技术用一个(有时用两个)随机引物(一般8～10个碱基)非 定点地扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分开扩增片段。不需要 DNA探针，用一个引物可扩增多个片段，技术简单，只需少量 的DNA样本，成本较低，RAPD标记一般是显性遗传（极少数 是共显性），但是RAPD分析中重复性不高，由于共迁移的存 在，在不同个体中出现相同分子量的滞后，并不能保证这些个 体拥有同一条(同源）的片段
和分布不同等均可导致这种多态性的产生。在RFLP技
术中成为分子ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ记的重复序列包括：(1)小卫星
(minisatellite)序列：重复单位(motif)约有碱基l0～60个
(也有16～100个碱基一说)，在基因组中多次出现。(2)
微卫星(microsatelite) 或简单重复序列 (simple
sepuencerepeats，缩写SSR)：重复单位含有1～5碱
DNA分子标记种类剖析
实验步骤
→ → PCR 电泳 分析
DNA分子标记种类剖析
应用
RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测， 也可用于构建基因组指纹图谱。
1、品种鉴定、系谱分析：用于识别种群、家族、 种内或种间的遗传变异，为生物血缘关系或分 类提供依据，还可以分析混合基因组样品等。
2、基因定位：例如定位了莴苣霜霉病抗性基因。
但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满
足以上所有要求
DNA分子标记种类剖析
DNA分子标记分类
一、第一代分子标记技术
以southern杂交为核心的分子标记技术：RELP标记等
二、第二代分子标记技术
基于PCR的DNA分子标记：RAPD标记、ISSR标记、SSR标 记、STS标记等
基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记：AFLP标记、 CAPS标记等
AP— PCR(arbitrarily primed po[ymerase chain reaclion) ： 在AP—PCR分析中，扩增分为三个部分，每个部分要求的条件 和组分的浓度存在差异；在第一个PCR循环中，引物浓度较高； 引物长度不定，并且常常来自为其它目的而设计的引物
MAAP(Multiple Arbitrary Pu‘nplicon Profiling)：这是 Caetano—Anolle（1994）创造的一个词，想用来统称所有这些 相关技术，但迄今为止这个词很少使用
DNA分子标记种类剖析
1.1.2加锚微卫星寡核苷酸(Anchored mi— cmsatellite oligonucleotides）
Zietkiewicz et a1．(1994)对STMS技术进行 了发展，他们用加锚微卫星寡核苷酸作引物， 对基因组节段而不是重复序列本身进行扩增。 在SSR的5 ‘端或3’ 端加上2～4个随机选择的 核苷酸，这可引起特点位点退火。这样就能导 致位于反向排列的间隔不太大的重复序列间的 基因组节段进行PCR扩增。这类标记又被称为 ISSR、ASSR或AMP-PCR。
三、第三代分子标记技术 基于单核苷酸多态性的DNA分子标记:SNP标记
四、其他几种新型分子标记
DNA分子标记种类剖析
一、第一代分子标记技术
限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP) 是发展最早的分子标记技术。RFLP技术的原 理是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的 特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切 位点变异的突变如点突变(新产生和去除酶切 位点)和一段DNA的重新组织(如插人和缺失造 成酶切位点问的长度发生变化)等均可导致 RFLP的产生。
DNA分子标记种类剖析
流程图
酶切→→电泳
→→标记探 针杂交→→
分析
DNA分子标记种类剖析
一般选择单拷贝探针
如果RFLP探针是来自拷贝数可变串联重复(Varible
number of tandem repeats，缩VNTR)．则产生另一类
因相同或相近序列的拷贝数变化所起的多态性。凡是
引起复单位的大小和序列不同、基因组中重复的数目
DNA分子标记种类剖析
RAPD技术的发展和相近的分子标记种类
DAF(DNA amplification fingerprinting）：与RAPD技术不同 的是，在DAF分析中，引物浓度更高，引物长度更短（一般5~8 个碱基）只有两个温度循环，并且往往用聚丙烯酰胺凝胶电泳， DAF通常会产生非常复杂的带型。在DAF技术的基础上，又展出 ASAP技术。
基(也有2～8个碱基一说)
DNA分子标记种类剖析
二、第二代分子标记技术
1、 基于PCR的DNA分子标记 ①随机引物PCR标记：RAPD标记、ISSR标、 AP-PCR、DAF等 ②特异引物PCR标记:SSR标记、STS标记、 SCAR、SPAR、SSCAP、ddF等
2、基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记 ①限制性酶切片段的选择性扩增来显示片段的多 态性：AFLP标记等 ②对PCR扩增片段的限制性酶切来揭示扩增区段 的多态性：CAPS标记等
DNA分子标记种类剖析
1.1.3任意引物PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction， AP— PCR）
在AP—PCR分析中，所使用的引物较长（10 －50 bp) ， PCR反应分为两个阶段，首先寡核 苷酸引物在低严谨条件下与模板DNA退火，此时 发生了一些合成，以便稳定模板与引物之间相互 作用。然后进行高严谨退火条件的循环，两个位 点间那些序列在低严谨度退火条件下发生的引物 延伸可继续在高严谨条件下扩增。采用变性聚丙 烯酰胺凝胶电泳分析PCR产物，最终反应结果与 RAPD类似。只要设计的引物在低严谨退火条件 下能减少引物产生人为产物，应用成对组合的引 物可以产生新的AP—PC R谱带，DNA分子标记种类剖析
DNA分子标记的种类以及进展
DNA分子标记种类剖析
分子标记的定义
广义的分子标记(molecular marker)是指可遗 传的并可检测的DNA序列或蛋白质。
狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个 界定现在被广泛采纳。
DNA分子标记种类剖析
理想分子标记的界定
(1)具有高的多态性 (2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂台和纯台基因型 (3)能明确辨别等位基因； (4)遍布整个基因组； (5)除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组； (6)选择中性(即无基因多效性)； (7)检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)； (8)开发成本和使用成本尽量低廉； (9)在实验室内和实验空间重复性好(便于数据交换)。
1.1.1随机扩增多态性DNA(RAPD)
该技术用一个(有时用两个)随机引物(一般8～10个碱基)非 定点地扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分开扩增片段。不需要 DNA探针，用一个引物可扩增多个片段，技术简单，只需少量 的DNA样本，成本较低，RAPD标记一般是显性遗传（极少数 是共显性），但是RAPD分析中重复性不高，由于共迁移的存 在，在不同个体中出现相同分子量的滞后，并不能保证这些个 体拥有同一条(同源）的片段
和分布不同等均可导致这种多态性的产生。在RFLP技
术中成为分子ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ记的重复序列包括：(1)小卫星
(minisatellite)序列：重复单位(motif)约有碱基l0～60个
(也有16～100个碱基一说)，在基因组中多次出现。(2)
微卫星(microsatelite) 或简单重复序列 (simple
sepuencerepeats，缩写SSR)：重复单位含有1～5碱
DNA分子标记种类剖析
实验步骤
→ → PCR 电泳 分析
DNA分子标记种类剖析
应用
RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测， 也可用于构建基因组指纹图谱。
1、品种鉴定、系谱分析：用于识别种群、家族、 种内或种间的遗传变异，为生物血缘关系或分 类提供依据，还可以分析混合基因组样品等。
2、基因定位：例如定位了莴苣霜霉病抗性基因。
但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满
足以上所有要求
DNA分子标记种类剖析
DNA分子标记分类
一、第一代分子标记技术
以southern杂交为核心的分子标记技术：RELP标记等
二、第二代分子标记技术
基于PCR的DNA分子标记：RAPD标记、ISSR标记、SSR标 记、STS标记等
基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记：AFLP标记、 CAPS标记等
AP— PCR(arbitrarily primed po[ymerase chain reaclion) ： 在AP—PCR分析中，扩增分为三个部分，每个部分要求的条件 和组分的浓度存在差异；在第一个PCR循环中，引物浓度较高； 引物长度不定，并且常常来自为其它目的而设计的引物
MAAP(Multiple Arbitrary Pu‘nplicon Profiling)：这是 Caetano—Anolle（1994）创造的一个词，想用来统称所有这些 相关技术，但迄今为止这个词很少使用
DNA分子标记种类剖析
1.1.2加锚微卫星寡核苷酸(Anchored mi— cmsatellite oligonucleotides）
Zietkiewicz et a1．(1994)对STMS技术进行 了发展，他们用加锚微卫星寡核苷酸作引物， 对基因组节段而不是重复序列本身进行扩增。 在SSR的5 ‘端或3’ 端加上2～4个随机选择的 核苷酸，这可引起特点位点退火。这样就能导 致位于反向排列的间隔不太大的重复序列间的 基因组节段进行PCR扩增。这类标记又被称为 ISSR、ASSR或AMP-PCR。
三、第三代分子标记技术 基于单核苷酸多态性的DNA分子标记:SNP标记
四、其他几种新型分子标记
DNA分子标记种类剖析
一、第一代分子标记技术
限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP) 是发展最早的分子标记技术。RFLP技术的原 理是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的 特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切 位点变异的突变如点突变(新产生和去除酶切 位点)和一段DNA的重新组织(如插人和缺失造 成酶切位点问的长度发生变化)等均可导致 RFLP的产生。
DNA分子标记种类剖析
流程图
酶切→→电泳
→→标记探 针杂交→→
分析
DNA分子标记种类剖析
一般选择单拷贝探针
如果RFLP探针是来自拷贝数可变串联重复(Varible
number of tandem repeats，缩VNTR)．则产生另一类
因相同或相近序列的拷贝数变化所起的多态性。凡是
引起复单位的大小和序列不同、基因组中重复的数目
DNA分子标记种类剖析
RAPD技术的发展和相近的分子标记种类
DAF(DNA amplification fingerprinting）：与RAPD技术不同 的是，在DAF分析中，引物浓度更高，引物长度更短（一般5~8 个碱基）只有两个温度循环，并且往往用聚丙烯酰胺凝胶电泳， DAF通常会产生非常复杂的带型。在DAF技术的基础上，又展出 ASAP技术。
基(也有2～8个碱基一说)
DNA分子标记种类剖析
二、第二代分子标记技术
1、 基于PCR的DNA分子标记 ①随机引物PCR标记：RAPD标记、ISSR标、 AP-PCR、DAF等 ②特异引物PCR标记:SSR标记、STS标记、 SCAR、SPAR、SSCAP、ddF等
2、基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记 ①限制性酶切片段的选择性扩增来显示片段的多 态性：AFLP标记等 ②对PCR扩增片段的限制性酶切来揭示扩增区段 的多态性：CAPS标记等
DNA分子标记种类剖析
1.1.3任意引物PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction， AP— PCR）
在AP—PCR分析中，所使用的引物较长（10 －50 bp) ， PCR反应分为两个阶段，首先寡核 苷酸引物在低严谨条件下与模板DNA退火，此时 发生了一些合成，以便稳定模板与引物之间相互 作用。然后进行高严谨退火条件的循环，两个位 点间那些序列在低严谨度退火条件下发生的引物 延伸可继续在高严谨条件下扩增。采用变性聚丙 烯酰胺凝胶电泳分析PCR产物，最终反应结果与 RAPD类似。只要设计的引物在低严谨退火条件 下能减少引物产生人为产物，应用成对组合的引 物可以产生新的AP—PC R谱带，DNA分子标记种类剖析
DNA分子标记的种类以及进展
DNA分子标记种类剖析
分子标记的定义
广义的分子标记(molecular marker)是指可遗 传的并可检测的DNA序列或蛋白质。
狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个 界定现在被广泛采纳。
DNA分子标记种类剖析
理想分子标记的界定
(1)具有高的多态性 (2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂台和纯台基因型 (3)能明确辨别等位基因； (4)遍布整个基因组； (5)除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组； (6)选择中性(即无基因多效性)； (7)检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)； (8)开发成本和使用成本尽量低廉； (9)在实验室内和实验空间重复性好(便于数据交换)。