分子生物学第09章DNA分子标记技术

两个不同油菜品系的RAPD
RAPD的特点
➢虽然对具体的一个引物而言其检测DNA多态性的位 点是有限的，但是当采用一组引物时，检测区域几乎 可以覆盖整个基因组，从而得到整个基因组DNA的多 态性。
➢RAPD的特点是操作简便迅速，不需要标记探针。只 要有一套随机引物就能对任何物种进行RAPD操作。
➢RAPD标记也必须与表型相联系才能发挥指导遗传育 种的作用。
遗传标记的发展
形态标记→ 细胞学标记（染色体多态性）→ 蛋白质标记（同工酶，分子标记）→ DNA 标记（分子标记）
RFLP 分析
RFLP （ restriction fragment length polymorphism）称为限制性片段长度多态性。当用 某种限制性内切酶处理不同生物个体来源的DNA 时，由于个体间DNA序列的差异，所产生的切割 片段长度和数量可能不同，利用凝胶电泳可以将 这些片段分离并观察到差异，这种差异就是 RFLP。
RFLP 分析
换不同的限制性内切酶切割，配合不同 的标记探针，可以得到数目多得惊人的条带， 从而找到很多的分子标记。这些分子标记与 表型标记一样，可以用于遗传学的研究。但 分子标记没有显隐性之分，都是共显性的。
采用一种探针 作 6 个栽培品种的RFLP分析
RFLP所用探针的来源
RFLP分析的效率依赖于选择合适的探针。 由于用能探测重复序列的探针探测出的片段太 多，难以比较，所以探针一般来自单拷贝或低 重复序列。常用的RFLP探针主要来源于随机基 因组克隆和cDNA克隆。
RFLP所用探针的来源
由于基因组DNA中甲基化一般很少在表达 基因中发生，故用对甲基化敏感的限制酶切， 可得到长度为1～2kb的DNA片段，它们是单拷 贝或低重复序列，用这些片段制成文库，即可 用作RFLP探针。
如 果 用 cDNA 克 隆 作 探 针 ， 最 好 制 备 来 自 生物整体mRNA的cDNA文库。
3. 用不同探针可以探测出不同的RFLP标记，标记 的密度远远超过以性状为基础的图谱。
RFLP 的不足
虽然RFLP分子标记有这些优点，但实验步骤 较多，费工费时，费用也高，使其应用受到一定 的限制。
要使RFLP在指导遗传育种中发挥作用，还必 须将RFLP与已知性状联系起来，仅有RFLP标记 图使用价值不大。
MAAP技术比较
(Multiple arbitrary amplicon profiling)
AP-PCR：arbitrarily primed polymerase chain reaction
随机扩增多态DNA（RAPD）
RAPD （ randomly amplified polymorphic DNA）称为随机扩增DNA多态性。它是利用随 机引物（通常为10个核苷酸）对不同生物个体基 因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经电泳分离， 溴化乙锭染色，显示出扩增产物的多态性。不同 个体间差异的条带可以作为分子标记。
RFLP
标 记 的 共 显 性
什么是多态性
多态性是在不同个体之间比较得到 的差异带，来自于一个个体本身的长短 不等的片段不是多态性。
RFLP 标记的优点
1. RFLP标记无表型效应，不受环境条件和发育阶 段的影响。因此可在特征性状远未出现之前就可 以知道其基因型。
2. RFLP标记在等位之间是共显性的，因此不受杂 交方式的影响。不管是正交、反交、回交，总是 在F1代中含有两亲本各一组染色体的片段之和。
For example, one minisatellite has a repeat length of 64 bp, and is found in the population with the following distribution:
7% 18 repeats 11% 16 repeats 43% 14 repeats 36% 13 repeats 4% 10 repeats
VNTR一例
The cause of the variation between individual genomes at microsatellites or minisatellites is that individual alleles have different numbers of the repeating unit.
9 DNA分子标记技术
9.1 基于 Southern 杂交技术的分子标记 9.2 随机（或半随机）引物分子标记技术 9.3 序列标志位点技术 9.4 分子标记的应用领域
DNA分子标记的定义
DNA分子标记就是在同一物种不同个体间 DNA序列上的差异，某一特定的差异可以通过实 验的方法检测出来，测出来的特定差异就是特定 的DNA分子标记。利用不同的实验方法可以得到 许许多多的DNA分子标记，这些DNA分子标记 表明了这些个体间遗传物质上的差异。
可变数量串联重复（VNTRs）
在真核生物基因组中有小卫星和微卫星序列存 在，它们是短序列（核心序列）高度重复的序列， 在不同生物个体间，某一座位上的核心序列重复的 次数有很大差异，并且这些重复序列有多座位性， 因此形成了高度的多态性。用某种高度重复序列的 核心序列作探针，测定其RFLP，得到电泳后的杂交 图谱，这种图谱称为指纹图谱，可以用来鉴别个体、 亲子鉴定等。
VNTR差ห้องสมุดไป่ตู้带的检测
父
的 检 测 结
母 子 女 间
VNTR
果
VNTR应用举例
用33.15（探针名）进行白种人的DNA指纹分 析时，两个无血缘关系的个体具有相同DNA指纹 图谱的概率为3×10－11，而当把33.15和33.6两个 探针取得的结果综合分析时，两个个体指纹图谱 相同的概率更是降低到5×10－19。
RFLP 分析
RFLP产生的差异带可以作为分子标记，用于 遗传学的研究。
当 一 个 生 物 有 多 条 染 色 体 ， 且 DNA 分 子 很 大 时，用一种限制性内切酶切割出的DNA片段太多， 电泳后的条带无法分辨。
使用某一特定序列的标记探针，与电泳分离的 片段进行Southern杂交，再显示出杂交带，可以大 大减少被观察条带的数目，便于不同生物个体间的 比较和找出差异带。