酶工程第三章酶的生物合成法生产
酶的生物合成
生产酪氨酸脱羧酶、链激酶、链道酶、双链酶等(有溶解血栓、血 块，加速伤口愈合等作用)
产生葡萄糖异构酶
.
8
2、 放线菌
菌种
(1) 链霉菌属
(Streptomyces)
委内瑞拉链霉菌 (S. venezulae)
灰色链霉菌 (S. griseus) 白色链霉菌 (S. albus)
不产色素链霉菌 (S. achromogenes)
(4) 透明质酸酶
治疗关节损伤、关节周围炎症及膝外伤，传染性肝炎及肝硬 化等
用做药物扩散剂
.
22
四、 产酶微生物的来源
1、土壤中的产酶微生物 2、水体中的产酶微生物 3、空气中的产酶微生物 4、极端环境中的产酶土壤是微生物生活的大本营，为微生物生长繁 殖及生命活动提供了各种条件
用于分析组成和杂质浓度的分析方法的细节
酶或微生物的毒理数据
微生物必须是非致病性的 微生物一定不能产生真菌素或其他毒性化合物 微生物一定不能产生抗生素
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33
二、 微生物酶的发酵生产
1、酶的发酵生产方法 2、培养基的配制 3、种子培养 4、微生物发酵产酶的一般工艺
.
34
1、 酶的发酵生产方法
(1) 固体培养法 (2) 液体培养法
酶)
.
13
4、 霉菌
菌种 (4) 青霉(Penicillium)
酶及功能
点青霉 (P. notatum) 产紫青霉 (P. ururogenum)
产黄青霉 (P. chrysogenum)
橘青霉 (P. citrinum)
(5) 犁头霉(Absidia)
葡萄糖氧化酶
葡萄糖氧化酶，中性、碱性蛋白酶和青霉素V酰化酶 5’-磷酸二脂酶(水解RNA，生产4种5’-单核苷酸，肌苷酸和鸟苷
酶工程课程复习资料整理
绪论一．酶是生物催化剂酶是具有生物催化功能的生物大分子，按其化学组成的不同可以分为两类：蛋白类酶（P-酶）与核酸类酶（R-酶）。
理解：1、酶是由生物细胞产生2、酶发挥催化功能不仅在细胞内，在细胞外亦可二．酶学研究简史1897年，Buchner兄弟发现，用石英砂磨碎的酵母细胞或无细胞滤液能和酵母细胞一样进行酒精发酵。
标志着酶学研究的开始。
说明：酶分子不仅只是在细胞内起作用，而且在细胞外同样具有催化功能。
这一发现开启了现代酶学，乃至现代生物化学的大门。
三．酶工程的现状：目前大规模利用和生产的商品酶还很少。
第一章．酶学概论第一节．酶作为生物催化剂的显著特点一．酶作为生物催化剂的显著特点：高效、专一二．同工酶（概）：能催化相同的化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成不同的一组酶。
三．共价修饰调节1．概念：通过其它的酶对其结构进行共价修饰，从而使其在活性形式和非活性形式之间相互转变。
2．常见修饰类型：磷酸化与去磷酸化；腺苷酸化与脱腺苷酸化；尿苷酸化与脱尿苷酸化；泛素化；类泛素化3．例子：糖原磷酸化酶——磷酸化形式有活性（葡萄糖）n+Pi→（葡萄糖）n-1+1-磷酸葡萄糖4．常见磷酸化部位：丝氨酸/苏氨酸，酪氨酸和组氨酸四．酶活性调节方式要能判断所举酶的例子是什么类型调节1. 别构调节2. 激素调节：如乳糖合酶修饰亚基的水平是由激素控制的。
妊娠时，修饰亚基在乳腺生成。
分娩时，由于激素水平急剧的变化，修饰亚基大量合成，它和催化亚基结合，大量合成乳糖。
3. 共价修饰调节：如糖原磷酸化酶、磷酸化酶b激酶4．限制性蛋白水解作用与酶活性控制。
如酶原激活5．抑制剂和激活剂的调节6．反馈调节7．金属离子和其它小分子化合物的调节8．蛋白质剪接五．反馈调节（概）：催化某物质生成的第一步反应的酶的活性，往往被其终端产物所抑制。
这种对自我合成的抑制叫反馈抑制。
A-J ：代谢物实线箭头：酶促催化步骤虚线箭头：反馈抑制步骤代谢途径的第一步和共同底物进入分支途径的分支点是反馈抑制的最为重要的位点。
酶学与酶工程重点总结
酶学与酶⼯程重点总结第⼆章酶学基础⼀、酶的活性中⼼(active center，active site)（⼀）活性中⼼和必需基团1、与酶活性显⽰有关的，具有结合和催化底物形成产物的空间区域，叫酶的活性中⼼，⼜叫活性部位。
2、活性中⼼可分为结合部位和催化部位。
3、结合部位决定酶的专⼀性，催化部位决定酶所催化反应的性质。
4、酶结构概述（1）活性中⼼是⼀个三维实体。
（2）是有⼀些⼀级结构上可能相距较远的氨基酸侧链基团组成，有的还包含辅酶或辅基的某⼀部分基团。
（3）在酶分⼦表⾯呈裂缝状。
（4）酶活性中⼼的催化位点和结合位点可以不⽌⼀个。
（5）酶活性中⼼的基团都是必需基团，但必需基团还包括活性中⼼以外的基团。
5、酶分⼦中的氨基酸残基或其侧链基团可以分为四类1．接触残基2．辅助残基3．结构残基4．⾮贡献残基（⼆）酶活性中⼼中的化学基团的鉴别1．⾮特异性共价修饰：某些化学试剂能使蛋⽩质中氨基酸残基的侧链基团反应引起共价结合、氧化或还原修饰反应，使基团结构和性质发⽣变化。
如果某基团修饰后不引起酶活⼒的变化，就可初步认为此基团可能是⾮必需基团；反之，如修饰后引起酶活⼒的降低或丧失，则此基团可能是酶的必需基团。
2．亲和标记共价修饰剂是底物的类似物，可专⼀性地引⼊酶的活性中⼼，并具有活泼的化学基团(如卤素)，可与活性中⼼的基团形成稳定的共价键。
因其作⽤机制是利⽤酶对底物类似物的亲和性⽽将酶共价标记的，故称为亲和标记。
3．差别标记在过量底物或可逆抑制剂遮蔽活性中⼼的情况下，加⼊共价修饰剂，使后者只修饰活性中⼼以外的有关基团；然后去除底物或可逆抑制剂，暴露活性中⼼，再⽤同位素标记的向⼀修饰剂作⽤于活性中⼼的同类基团；将酶⽔解后分离带有同位素的氯基酸，即可确定该氨基酸参与活性中⼼。
4．蛋⽩质⼯程这是研究酶必需基闭和活性中⼼的最先进⽅法，即将酶蛋⽩相应的互补DNA(cDNA)定点突变，此突变的cDNA表达出只有⼀个或⼏个氨基酸被置换的酶蛋⽩，再测定其活性，可以知道被置换的氨基酸是否为活⼒所必需。
酶工程 第三章酶的发酵生产 第三节发酵工艺条件及控制
第三节 发酵工艺条件及控制
无机元素是通过添加无机盐来提供的，一般采用水溶 性的硫酸盐、磷酸盐或盐酸盐等。有时也使用硝酸盐，在 提供无机氮的同时，提供无机元素。
4．生长因素 生长因素是指细胞生长繁殖所必不可缺的微量有机化 合物主要包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素，以及动 植物生长激素等。各种氨基酸是蛋白质和酶的组分；嘌呤 和嘧啶是核酸和某些辅酶的组分；维生素主要起辅酶作用； 动植物生长激素则分别对动物细胞和植物细胞的生长、分 裂起调节作用。有的细胞能够自己合成各种生长因素，而 有的细胞则缺少合成一种或多种生长因素的能力，需由外 界供给，才能正常生长繁殖，这样的细胞称为营养缺陷型。
第三节 发酵工艺条件及控制
在酶的发酵生产中，通常在培养基中加进玉米浆、酵 母膏等，以提供各种必需的生长因素。有时，也加进纯化 的生长因素，以供细胞生长繁殖之需。
现举例几种酶发酵培养基： （1）枯草杆菌BF7658α—淀粉酶发酵培养基：玉米粉 8%，豆饼粉4%，磷酸氢二钠0.8%，硫酸铵0.4%，氧化钙 0.2%，氯化铵0.15%。 （2）枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶发酵培养基：玉米 粉4%，豆饼粉3%，麸皮3.2%，米糠1%，磷酸氢二钠0.4%， 磷酸二氢钾0.03%。 （3）黑曲霉糖化发酵培养基：玉米粉10%，豆饼粉4%， 麸皮1%（PH4.4—5.0）。
第三节 发酵工艺条件及控制
不同细胞生长繁殖的最适PH有所不同。一般细胞和放 线菌的生长最适PH为中性或微碱性（PH6.5—8.0）；霉菌 和酵母的生长最适PH为偏酸性（PH4.0—6.0）；植物细胞 生长的最适PH为5—6。
酶工程第3版
一、动植物细胞的特点: 动植物细胞的特点
• 1、体积比微生物大； 、体积比微生物大； • 2、对剪切力敏感； 、对剪切力敏感； • 3、生长和代谢速率低，生长倍增时间和发酵 、生长和代谢速率低， 周期长； 周期长； • 4、动物细胞营养要求复杂； 、动物细胞营养要求复杂； • 5、发酵产物不同 、
三、动物细胞发酵
1、动物细胞可以生产多种具有较高价值的药物，特 、动物细胞可以生产多种具有较高价值的药物， 别是疫苗、激素、单克隆抗体和酶等。 别是疫苗、激素、单克隆抗体和酶等。 由动物细胞培养生产的酶有胶原酶， 由动物细胞培养生产的酶有胶原酶，血纤蛋白溶 酶原活性剂等。 酶原活性剂等。 2、动物细胞培养方法： 、动物细胞培养方法： 悬浮培养； 悬浮培养；固定化细胞培养 3、动物细胞发酵工艺植物细胞发酵技术和特点： 、植物细胞发酵技术和特点： 植物细胞发酵技术 发酵特点（与直接提取分离相比较而言）： 发酵特点（与直接提取分离相比较而言）： （1）提高产率； ）提高产率； （2）缩短周期 ）缩短周期; （3）易于管理、减轻劳动强度； ）易于管理、减轻劳动强度； （4）提高质量。 ）提高质量。
2、植物细胞发酵技术 、 (I)高产细胞系的选择： 主要有以下几个途径： 高产细胞系的选择： 高产细胞系的选择 主要有以下几个途径： 材料选择，克隆选择，抗性选择，诱变选择,细 材料选择，克隆选择，抗性选择，诱变选择 细 胞工程和基因工程选择； 胞工程和基因工程选择； (II)影响产物产量的因素： 材料来源 培养基成分， 影响产物产量的因素： 材料来源,培养基成分 培养基成分， 影响产物产量的因素 光照和温度， ，细胞形态分化程度等; 光照和温度，pH，细胞形态分化程度等 (III)提高产物产量的途径： 选择高产细胞系，控 提高产物产量的途径： 提高产物产量的途径 选择高产细胞系， 制细胞生长和分化程度，加入诱导物或前体， 制细胞生长和分化程度，加入诱导物或前体， 两相培养和产物释放，毛壮根培养技术。 两相培养和产物释放，毛壮根培养技术。 (IV)植物细胞培养系统专用的生物反应器。 植物细胞培养系统专用的生物反应器。 植物细胞培养系统专用的生物反应器
南京林业大学酶工程-3 动、植物细胞发酵产酶讲解
一般为无机氮源。 一般以蔗糖为碳源。
植物细胞培养的工艺条件及其控制（续）
（三）温度的控制 室温（25℃）、 （四）pH值的控制 微酸性（pH5～6） （五）溶解氧的调节控制 代谢慢，耗氧少，对剪切力敏感，搅拌不宜强烈。 （六）光照的控制 （七）前体的添加 提高次级代谢物的产量。 （八）刺激剂(electior)的应用 强化次级代谢产物的生物合成。常用微生物细胞 壁碎片和胞外酶。
动、植物细胞培养与微生物培养区别
动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固 体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨 基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血 清。动物细胞对环境敏感，包括pH、溶氧、温度、剪 切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测 和控制。 植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于植物细 胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养 产物，以及植物细胞生长较微生物要缓慢，长时间的 培养对无菌要求及反应器的设计也提出特殊的要求。
紫草宁及其结构
植物细胞培养的特点（续）
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（2）缩短周期 发酵周期10～30天，种植周期几个月～几年。 （3）易于管理 减低劳动强度；不受地理环境和气候条件等影响。 （4）提高产品质量 主要产物浓度高，易于分离纯化，减少环境中各种有 害物质污染和侵蚀。 （5）其它 生物反应器的设计工艺条件注意的问题。
主要产物
醇类，有机酸， 色素，香精， 激素，疫苗， 氨基酸，抗生素， 药物，酶 单克隆抗体， 酶，核苷酸 酶
二、植物细胞培养的特点
（1）提高产率
例如,紫草宁(shikonin) 生产，发酵细胞中的紫 草宁比 紫菜根 (Lithospermum erythrorhizon)中高10 倍，比产率达到种植紫 草的830倍。
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生
丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生College of Life Sciences
米曲霉：半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，从梗孢科， 曲霉属真菌中的一个常见种。米曲霉菌落生长快， 10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变 为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状， 一直径150~300μm，也有少数为疏松柱状。分生孢 子梗2mm左右。
链霉菌
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生College of Life Sciences
3．酵母菌 酵母菌(yeast)是—类单细胞微生物，但不同于细菌，
属于真核微生物。
酿酒酵母 球拟酵母 假丝酵母
拟酵母
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生College of Life Sciences
4. 霉菌 霉菌是一类丝状真菌，用于酶的发酵生产的霉菌主
二、产酶微生物的来源
1．土壤中的产酶微生物 2．水体中的产酶微生物 3．空气中的产酶微生物 4．极端环境中的产酶微生物
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生College of Life Sciences
三、产酶微生物的分离和筛选
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生College of Life Sciences
第三章 酶的生物合成
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生
第一节 微生物发酵产酶
微生物发酵产酶的优点： 1）微生物种类繁多； 2) 微生物生长周期短，繁育快； 3) 微生物易改造，可通过多种手段育种。
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生College of Sciences
一、产酶微生物的种类 用于酶的生产的细胞必须具备几个条件 (1)酶的产量高 (2) 容易培养和管理 (3) 产酶稳定性好，不易变异退化，不易被感染 (4) 利于酶的分离纯化 (5) 安全可靠，无毒性
酶工程各章试题
酶工程第一章测试试题卷一填空每空1分,共20分1.1878年,____首次将酵母中酒精发酵的物质称为酶.2.1913年,Michaelis 和Menten根据中间产物学说,推导出酶催化反应的基本动力学方程----米氏方程,可用公式表示为_______.3.1982年Thomas Cech等人发现四膜虫的rRNA可以在没有蛋白质存在的情况下自身催化切除内含子,完成加工过程.这一具有催化活性的RNA的发现改变了传统的酶的化学本质是____________的概念;4.对同一种酶可同时采用系统命名和_____命名两种方法.5.乳酸脱氢酶可标识为1.1.1,其中EC代表_________.6.催化L-谷氨酸 D—谷氨酸的酶属于________酶.7.核酸类酶的基本组成单位是_________.8.酶的有机辅助因子在催化过程中起_______________的作用.9.在酶的二级结构β—片状折叠中,________式结构更稳定.10.酶的绝对专一性又称为___________专一性.11.PH对酶的影响主要是影响到了氨基酸的________状态.12.在测酶活力时,为了使酶反应速度不受底物浓度底限制,反应系统应使用足够高的底物浓度,一般要求:__________.13.酶分离纯化整个工作包括三个基本环节:抽取纯化和________.14.工业应用的三大酶制剂是蛋白酶 ________和脂肪酶.15 核酸类酶催化反应的类型,可以将R-酶分为三类:剪切酶,剪接酶和________酶.16、具有不同分子形式但却催化相同反应的酶称为__________.17、每毫克蛋白或RNA中所具有的酶活力数称为酶的_______.用u/mg表示.18、酶制剂可分为液体酶制剂,固体酶制剂,纯酶制剂和_______酶制剂.二. 选择题每题2分,共10分1.谷氨酸脱氢酶可有以下四种底物,由Km推断它的最适底物是 .A. 谷氨酸Km=B. α-酮戊二酸Km=C. NAD氧化形 Km=D. NAD 还原形 Km=2. D EA B CF G图示抑制模式属于:A累积反馈抑制Ｂ无分支途径中酶活性反馈抑制C 顺序反馈抑制D 协调反馈抑制3．有两种蛋白酶样品,A样品32mg,酶活力单位数为样品52mg ,酶活力单位数为190U,则两样品纯度为:A A >B B. A < B C. A = B D. 不能断定.4．某酶四种底物的Km 如下,与酶亲和力最大的底物是:A ×10-2B × 10-1C ×10-2D ×10-65．从世界范围看,酶制剂在哪一行业中的应用占比例最高A 淀粉业B 乳制品C 洗涤剂业D 制酒业三. 名词解释每题3分,共12分1.调节酶2.别构效应3.固定化酶四. 判断题每题1分,共7分2.1/Km越大,酶与底物亲和力越大.3.酶的最适温度是一个固定不变的常数,其数值不受底物的种类.作用时间而改变.4.盐析法分离蛋白质时,应将溶液PH调至蛋白质等电点附近.5.酶浓度越高,酶结晶越大.6.调节酶就是别构酶.7.大肠杆菌丙酮酸脱氢酶是多酶复合体.五. 说明题共6分1.图示并说明竞争性抑制和非竞争性抑制的区别.6分六. 简答题共21分1.简介酶分子中氨基酸残基种类及作用.8分2请比较说明吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析的原理.8分3、固定化酶的制备原则是什么5分酶工程第一章测试参考答案一填空每空1分,共18分1.库尼 =vmaxS/Km+S 3.酶是具有生物催化功能的蛋白质.4.习惯5.国际酶学委员会6.异构酶7.核糖核苷酸8.传递电子原子和基团的作用.9.反平行10.立体异构11.解离 12.S>5Km 13.制剂. 14淀粉酶 15多功能酶16同工酶 17酶的比活力.18固定化酶制剂二. 选择题每题3分,共15分. 4D三. 名词解释每题5分,共15分1.调节酶: 在代谢途径和物质转化体系中起调节作用的关键酶.2.别构效应:一种化合物与酶的活性中心以外的部位结合,引起酶的构象发生变化的现象.3.固定化酶:在一定空间内呈闭锁状态存在的酶,能连续地进行反应,反应后酶可以回收重复使用.四. 判断题每题2分,共14分1.正确2.错误3. 正确4. 错误5. 错误6. 正确7. 正确五、图示说明题共12分2.图示并说明竞争性抑制和非竞争性抑制的区别.6分竞争性抑制剂结构往往与正常底物非常相似,从而与底物竞争酶分子上同一个结合部位活性中心,阻止底物和酶的结合.因而酶不能与抑制剂和底物同时结合.ESI复合物缺乏反应活性基团不能继续分解成产物,形成死端复合物.图4分,解释2分不论底物分子是否与酶结合, 非竞争性抑制剂都能与酶分子结合产生死端复合物. 非竞争性抑制剂与活性中心以外的基团结合,其结构肯与底物分子毫无相关之处,两者没有竞争作用,但ESI不能进一步分解成产物. 图4分,解释2分七. 简答题共26分1.请比较说明吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析分离酶的原理.16分1维持酶的催化活性和专一性.2应有利于生产自动化.连续化.3与载体牢固结合4载体不与底物.产物和反应物发生化学反应.5成本要低,利于工业使用.第二、三章酶的生物合成法生产测试题填空题1、SOD是_________酶,具有____________________的功效;2、依据在体外培养时对生长基质依赖性差异,动物细胞可分为两类：__________、______________;3、动物细胞培养的PH应控制在______________；温度控制在_______,允许波动_______;判断题谷草芽孢杆菌是应用最广泛的产酶微生物;√大多数产酶微生物采用淀粉或其水解产物为碳源,植物细胞一般以蔗糖为碳源;√植物细胞培养要求的氮源一般为有机氮源;×动物细胞培养主要用于各种功能蛋白质的生产;√动物细胞传代培养时可以用胃蛋白酶分散细胞;×简答题：1、固定化原生质体产酶有何特点2、植物细胞培养产酶的工艺流程3、酶的生物合成有哪几种模式各有何特点P36-384、影响酶生物合成的主要因素有哪些结合酶的生物合成模式,分析说明怎样提高产酶效率;P39答案：填空题1、抗辐射、抗氧化、抗衰老2、贴壁依赖型细胞,非贴壁依赖型细胞3、－微碱性,℃ ,允许波动范围在＋－℃简答题1、1、变胞内产物为胞外产物固定化黑曲霉原生质体生产葡萄糖氧化酶,使细胞内葡萄糖氧化酶的90％以上分泌到细胞外;2、提高产酶率固定化枯草芽孢杆菌原生质体生产碱性磷酸酶,使原来存在于细胞间质中的碱性磷酸酶全部分泌到发酵液中,产酶率提高36％;3、稳定性好4、易于分离纯化2、外植体诱导愈伤组织细胞培养分离纯化酶第四章酶的提取与分离纯化测试题填空题1、酶在结晶之前,酶液必须经过纯化达到一定的纯度;通常酶的纯度应当在_______以上,方能进行结晶;2、酶结晶的主要方法有：________、________、________、________;3、酶的剂型有：_____、______、________和固定化酶制剂；通常用作分析试剂或用作医疗药物的酶制剂要求是___________ ;4、注射用的医用酶应设法除去____________;判断题1、一般采用稀盐溶液进行酶的提取,盐的浓度一般控制在～ mol／L ;√2、常用硫酸铵盐析沉淀酶蛋白;√3、盐析沉淀酶蛋白时,溶液的pH值应调节到远离酶的等电点;×4、等电点结晶是通过缓慢改变浓酶液的pH值,使之逐渐远离酶的等电点,而使酶析出结晶的过程;×名词解释：1、选择性变性沉淀法2、酶的提取3、亲和层析简答题：1、酶的分离纯化工作的基本原则2、举例说明细胞破碎的几种方法及原理;3、稳定酶的方法有哪些答案：填空题1、50％;2、盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶法、等电点结晶法;3、固体酶制剂、液体酶制剂、纯酶制剂、固定化酶制剂；纯酶制剂;4、热源物质名词解释1、选择性变性沉淀法：选择一定的条件使酶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀,而不影响所需的酶,这种分离方法称为选择性变性沉淀法2、酶的提取是指在一定的条件下,用适当的溶剂处理含酶原料,使酶充分溶解到溶剂中的过程,也称为酶的抽提;3、亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力,使酶等生物分子分离纯化的技术;简答题1、1、防止酶变性失效凡用于预防蛋白质变性失效的方法与措施都应考虑用于酶的分离纯化;A、除少数例外外,所有操作都必须在低温条件下进行,特别是在有机溶剂存在的情况下更应小心;B、大多数酶在PH<4或PH>10的情况下稳定,应控制整个系统不要过酸、过碱,同时要避免在调整PH时局部过酸或过碱;C、重金属能使酶失效,有机溶剂能使酶变性,微生物污染以及蛋白酶的存在都能使酶分解破坏,所有这些都应周全考虑;可以加入蛋白酶抑止剂,杀菌剂,稳定蛋白质构象和酶活性的还原剂;2、酶活性测定贯串纯化过程的始终也就是说,从原理开始,整个过程的每一步都要进行比活力与总活力的检测与比较,以便知道每一步骤中可采用什么方法与什么条件,分别使酶的纯度提高了多少,回收了多少酶,从而决定其取舍;3、选择有效的纯化方法凡用于蛋白质纯化的一切方法同样适用于酶;应根据目的酶的物理、化学性质选取;4、原料来源要方便,成本要低1、添加底物、抑止剂和辅酶2、添加－SH保护剂如谷胱甘肽、二巯基乙醇3、低温0－4℃4、添加某些低分子无机离子 Ca2＋保护淀粉酶,Mn2+能稳定溶菌酶,CL－能稳定透明质酸酶等5、固体酶制剂稳定性高可保存数月或几年以上；热敏性酶多用冷冻干燥法,例如注射用酶等;6、固定化酶也是提高酶的稳定性的好方法;第四章酶的提取与分离纯化测试题填空题1、酶在结晶之前,酶液必须经过纯化达到一定的纯度;通常酶的纯度应当在_______以上,方能进行结晶;2、酶结晶的主要方法有：________、________、________、________;3、酶的剂型有：_____、______、________和固定化酶制剂；通常用作分析试剂或用作医疗药物的酶制剂要求是___________ ;4、注射用的医用酶应设法除去____________;判断题1、一般采用稀盐溶液进行酶的提取,盐的浓度一般控制在～ mol／L ;√2、常用硫酸铵盐析沉淀酶蛋白;√3、盐析沉淀酶蛋白时,溶液的pH值应调节到远离酶的等电点;×4、等电点结晶是通过缓慢改变浓酶液的pH值,使之逐渐远离酶的等电点,而使酶析出结晶的过程;×名词解释：1、选择性变性沉淀法2、酶的提取3、亲和层析简答题：1、酶的分离纯化工作的基本原则2、举例说明细胞破碎的几种方法及原理;3、稳定酶的方法有哪些答案：填空题1、50％;2、盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶法、等电点结晶法;3、固体酶制剂、液体酶制剂、纯酶制剂、固定化酶制剂；纯酶制剂;4、热源物质名词解释1、选择性变性沉淀法：选择一定的条件使酶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀,而不影响所需的酶,这种分离方法称为选择性变性沉淀法2、酶的提取是指在一定的条件下,用适当的溶剂处理含酶原料,使酶充分溶解到溶剂中的过程,也称为酶的抽提;3、亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力,使酶等生物分子分离纯化的技术;简答题1、1、防止酶变性失效凡用于预防蛋白质变性失效的方法与措施都应考虑用于酶的分离纯化;A、除少数例外外,所有操作都必须在低温条件下进行,特别是在有机溶剂存在的情况下更应小心;B、大多数酶在PH<4或PH>10的情况下稳定,应控制整个系统不要过酸、过碱,同时要避免在调整PH时局部过酸或过碱;C、重金属能使酶失效,有机溶剂能使酶变性,微生物污染以及蛋白酶的存在都能使酶分解破坏,所有这些都应周全考虑;可以加入蛋白酶抑止剂,杀菌剂,稳定蛋白质构象和酶活性的还原剂;2、酶活性测定贯串纯化过程的始终也就是说,从原理开始,整个过程的每一步都要进行比活力与总活力的检测与比较,以便知道每一步骤中可采用什么方法与什么条件,分别使酶的纯度提高了多少,回收了多少酶,从而决定其取舍;3、选择有效的纯化方法凡用于蛋白质纯化的一切方法同样适用于酶;应根据目的酶的物理、化学性质选取;4、原料来源要方便,成本要低1、添加底物、抑止剂和辅酶2、添加－SH保护剂如谷胱甘肽、二巯基乙醇3、低温0－4℃4、添加某些低分子无机离子 Ca2＋保护淀粉酶,Mn2+能稳定溶菌酶,CL－能稳定透明质酸酶等5、固体酶制剂稳定性高可保存数月或几年以上；热敏性酶多用冷冻干燥法,例如注射用酶等;6、固定化酶也是提高酶的稳定性的好方法;第五章酶分子的修饰与应用测试题填空题1、酶分子修饰的意义是：_____________,______________,_________;名词解释1、酶分子修饰通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变,从而改变酶的某些特性和功能的过程称为酶分子修饰;2、金属离子置换修饰3、酶分子的物理修饰简答题：1、什么是酶分子的侧链修饰酶分子侧链修饰有何意义2、请举例说明酶分子修饰的应用答案填空题：1、提高酶的活力；增强酶的稳定性；降低或消除酶的抗原性;名词解释1、酶分子修饰：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变,从而改变酶的某些特性和功能的过程称为酶分子修饰;2、把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子,使酶的功能和特性发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰;3、通过各种物理方法使酶分子的空间构象发生某些改变,从而改变酶的某些特性和功能的方法称为酶分子的物理修饰;简答题1、采用一定的方法一般为化学法使酶的侧链基团发生改变,从而酶分子的特性和功能的修饰方法称为侧链基团修饰;意义：1、通过酶分子侧链基团修饰,可以研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响,并可以用于研究酶的活性中心的必须基团;如果某基团修饰后不引起酶活力的显着变化,则可以认为此基团属于非必须基团;2、通过酶分子侧链基团修饰,可以测定某一种基团在酶分子中的数量,例如,采用三硝基苯磺酸测定氨基的数量；用对汞苯甲酸测定巯基的数量；用碳二亚胺测定羧基的数量；用四唑重氮盐测定咪唑基的数量等;3、酶分子侧链基团修饰,在酶工程方面可以提高酶的活力、增加酶的稳定性、降低酶的抗原性,并且可以引起酶催化特性和催化功能的改变,以提高酶的使用价值;4、酶分子侧链基团修饰,还可以获得自然界原来不存在的新酶种,例如,某些抗体酶和人工改造的核酸类酶;第六章酶、细胞、原生质体固定化与应用测试题填空题1、固定化酶的制备方法主要有：______、_______、________、_________;2、交联法常用的双功能试剂是：_____________;判断题1、酶经固定化后,其作用的最适pH值往往会发生一些变化;√2、固定化酶的最适作用温度与游离酶相比没有变化;×3、一般来说,用带负电荷的载体制备的固定化酶,其最适pH值比游离酶的最适pH值为高即向碱性一侧移动；用带正电荷载体制备的固定化酶的最适pH值比游离酶的最适PH为低即向酸性一侧移动√4、一般说来,催化反应的产物为酸性时,固定化酶的最适pH值要比游高酶的最适PH低一些；产物为碱性时,固定化酶的最适pH值要比游离酶的最适pH值高一些;×5、固定化酶的底物特异性变化与底物分子量的大小有一定关系;√名词解释1、交联法2、载体活化3、固定化细胞;简答题1、什么是固定化酶有何显着优点2、请举例说明固定化酶、细胞、原生质体技术的应用答案填空题1、吸附法、包埋法、结合法、交联法和热处理法等;名词解释1、交联法：借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用,制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法;2、载体活化：要使载体与酶形成共价键对酶进行固定化,必须首先使载体活化,即借助于某种方法,在载体上引进一活泼基团;然后此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应,形成共价键;3、固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞;简答题1、什么是固定化酶有何显着优点固定化酶是指固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶;固定化酶既保持了酶的催化特性,又克服了游离酶的不足之处,具有增加稳定性、可反复或连续使用以及易于和反应产物分开等显着优点;2、略第七章酶非水相催化测试题判断题1、有机溶剂往往会使酶变性失活,因此只有在水溶液中酶才有催化活性;2、在有机介质中,由于酶分子活性中心的结合部位与底物之间的结合状态发生某些变化,致使酶的底物特异性发生改变;3、许多酶在有机介质中的热稳定性比在水溶液中的热稳定性更好;4、目前世界上化学合成药物中的40％左右属于手性药物;在这些手性药物中,大多数仍然以外消旋体形式使用;5、常用的消炎解热镇痛药萘普生Neproxen的两种对映体中,S +-萘普生的疗效是R-－-萘普生疗效的28倍;6、镇静剂反应停的S-构型有镇静作用,R-构型也有镇静作用,但疗效甚微;7、一些消旋体药物可以在有机介质体系中用酶法进行拆分,获得单一对映体;名词解释1、酶的对映体选择性2、手性化合物第八章酶定向进化复习题一、填空题：酶基因随机突变的方法有：________、____________、_________;二、名词解释：酶定向进化易错PCR技术三、简答题：1．酶定向进化的特点2.酶随机突变的三种方法是什么请解释并比较分析;3.举例说明酶定向进化技术的应用;第九章酶反应器复习题P240复习题1、2、5第十章 1 酶在医药方面的应用测试题一、填空题1、指示肝功能异常的常用酶有：____、______、_______;2、_________酶可以检测癌细胞;3、治疗消化不良、食欲不振的酶有：______、______、________;4、具有抗癌作用的酶有：______、______、_______、__________;5、_________酶可以治疗各种出血;6、_____________酶可以治疗龋齿;7、___________酶可以溶血栓;8、____________酶可以治疗白血病;9、____________酶用于制造抗肿瘤人参皂苷;10、___________酶可用于制造人胰岛素;二、判断题1、乳酸脱氢酶广泛存在于各种组织以及红细胞中,在正常情况下,血清中乳酸脱氢酶的含量很低,但是在肝癌、急性肝炎、心肌梗塞等疾病的患者血清中,该酶活力显着升高;√2、蛋白酶可用于治疗多种疾病,是在临床上使用最早、用途最广的药用酶之一,它可作为消化剂、消炎剂并可用于治疗高血压;√三、请写出以下药品的酶法生产反应式6－氨基青霉烷酸6-APA多巴四、分析说明题1、请分析说明尿糖试纸检测尿糖的原理2、绘图并说明血液透析装置及装置中酶法除去尿素的原理;3、举两例分析说明酶在药物制造方面的应用价值;4、请分析说明溶菌酶的应用价值5、请分析说明SOD的应用价值答案填空题1、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、胆碱酯酶2、端粒酶3、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶4、L-精氨酸酶、L-组氨酸酶、L－蛋氨酸酶、谷氨酰胺酶5、凝血酶6、右旋糖酐酶7、溶纤酶8、L- 天冬酰胺酶9、β－D－葡萄糖苷酶 10、无色杆菌蛋白酶请写出以下药品的酶法生产反应式1、6－氨基青霉烷酸6-APA青霉素青霉素酰化酶 6－氨基青霉烷酸6-APA2、多巴酪氨酸β－酪氨酸酶多巴邻苯二酚＋丙酮酸＋氨β－酪氨酸酶多巴分析说明题4、溶菌酶主要从蛋清、植物和微生物中分离得到;作用机理：溶菌酶作用于细菌的细胞壁,可使病原菌、腐败性细菌等溶解消灭,对抗生素有耐药性的细菌同样起溶菌作用,具有显着疗效而对人体的副作用很小,是一种较为理想的药用酶;应用价值：临床上主要用于治疗各种炎症,溶菌酶与抗生素联合使用,可显着提高抗生素的疗效,常用于难治的感染病症的治疗；还可用于食品保鲜；在护肤品中添加可以消除皮肤表面黏附的细菌,起到杀菌消炎的作用;5、SOD即超氧化物歧化酶,具有抗氧化、抗衰老、抗辐射的功效,添加到护肤品中可以有效防治紫外线对人体的伤害,消除自由基的影响,减少色素沉着;在医疗领域,用于预防辐射损伤,治疗红斑狼疮,皮肌炎,结肠炎,氧中毒;第十章2 酶在食品方面的应用测试题填空题1、_______酶和__________酶可用于食品保鲜;2、______________酶可将蔗糖原料中的棉子糖分解成蔗糖与半乳糖,提高蔗糖的收得率;3、果胶酶pectinase是催化果胶质分解的一类酶的总称,主要包括______和___________;4、_________酶可用于呈味核苷酸的酶法生产;判断题1、糊精是淀粉低程度水解的产物,广泛应用于食品增稠剂、填充剂和吸收剂;√2、写出以下产品酶法生产的反应式1、L－氨基酸的生产2、低乳糖奶的生产3、L-苹果酸的生产4、天苯肽的酶法生产写出以下工艺过程酶法处理的反应式1、柑橘制品脱苦处理2、果蔬制品的脱色简答题1、请分析说明果葡糖浆生产的工艺流程及条件控制2、请分析说明右旋糖酐酶的应用价值3、请分析说明酶在啤酒发酵生产中的应用答案填空题1、葡萄糖氧化酶,溶菌酶2、蜜二糖酶α－半乳糖苷酶3、果胶酯酶PE,聚半乳糖醛酸酶PG4、5,磷酸二酯酶写出以下产品酶法生产的反应式1、L－氨基酸的生产N－酰基DL－氨基酸氨基酰化酶 L－氨基酸蛋白质蛋白酶 L－氨基酸延胡索酸＋氨天冬氨酸酶 L－天冬氨酸α－酮戊二酸＋NH3＋NADPH谷氨酸脱氢酶 L－谷氨酸+H2O＋NADP+a-酮戊二酸+L-氨基酸转氨酶 L-谷氨酸+α-酮酸2、低乳糖奶的生产乳糖乳糖酶β半乳糖苷酶半乳糖＋葡萄糖3、L-苹果酸的生产延胡索酸＋水延胡索酸酶 L－苹果酸4、天苯肽的酶法生产L-Asp +L-Phe-Ome嗜热菌蛋白酶L-Asp-L-Phe-OmeL-天冬氨酸 L-苯丙氨酸甲酯天苯肽写出以下工艺过程酶法处理的反应式1、柑橘制品脱苦处理柚苷柚配质－7－芸香糖苷柚苷酶β－鼠李糖苷酶鼠李糖＋无苦味的普鲁宁柚配质一7一葡萄糖苷2、果蔬制品的脱色花青素花青素酶β－葡萄糖和它的配基简答题1、请分析说明果葡糖浆生产的工艺流程及条件控制工艺流程：淀粉浆a-淀粉酶,Ca2＋,80～90℃液化液糖化酶葡萄糖DE>96％层析去Ca2＋,pH值为6．5～7．0,加入0．01 mol／L的硫酸镁,在60～70℃的温度条件下,葡萄糖异构酶果葡糖浆;控制条件：1、钙离子对a-淀粉酶有保护作用,在淀粉液化时需要添加,但它对葡萄糖异构酶却有抑制作用,所以葡萄糖溶液需用层析等方法精制;2、控制PH3、控制温度葡萄糖转化为果糖的异构化反应是吸热反应;随着反应温度的升高,反应平衡向有利于生成糖的方向变化,异构化反应的温度越高,平衡时混合糖液中果糖的含量也越高;但当温度超过70℃时,葡萄糖异构酶容易变性失活,所以异构化反应的温度以60～70℃为宜;2、请分析说明右旋糖酐酶的应用价值制糖设备中存在大分子黏性葡聚糖,堵塞管道,妨碍设备清洗及蔗糖的结晶;用右旋糖酐酶内切α－1,6－葡聚糖酶处理,可使右旋糖酐分解为异麦芽糖与异麦芽三糖,黏度迅速下降;右旋糖酐酶还可用于防龋;3、请分析说明酶在啤酒发酵生产中的应用在啤酒酿造过程中,制浆和调理两个阶段是要使用酶制剂的1、浸泡麦芽浆时,温度约65℃,有利于蛋白酶,β－葡聚糖酶,α－淀粉酶,发挥作用,使麦芽中的多糖及蛋百类物质降解为酵母可利用的合适的营养物质;2、加啤酒花前,煮沸麦芽汁使上述酶失活;在发酵完毕后,啤酒需要加一些酶处理,以使其口味和外观更易于为消费者接受;蛋白酶降解使啤酒混浊的蛋白质成分,防止啤酒的冷混浊,延长啤酒的储存期;糖化酶能够降解啤酒中的残留糊精,一方面保证了啤酒中最高的乙醇含量,另一方面不必添加浓糖液来增加啤酒的糖度;这种低糖度的啤酒糖尿病患者也可以饮用;第十章 3 酶在其他领域的应用测试题填空题1、造纸业的主要用酶有：___________和___________;2、________酶可以水解RNA,生产四种5,核苷酸;3、生丝脱胶和羊毛除垢可以用____________酶;4、利用__________酶检测有机磷农药污染5、利用_________酶的同工酶监测重金属污染6、通过___________监测大肠杆菌污染名词解释：酶标记免疫反应检测请分析说明蛋白酶在轻工、化工业中的应用;加酶洗涤剂应该满足什么条件加酶洗涤剂有何优势酶法检测必须具备什么条件答案填空题1、木质素酶,木聚糖酶2、5,-磷酸二酯酶3、蛋白酶4、胆碱酯酶5、乳酸脱氢酶6、β-葡聚糖苷酸酶名词解释：酶标记免疫反应检测是将酶的检测技术与免疫检测技术相结合,用于测定样品液中抗体。
酶工程
②降低阻遏物浓度：设法从培养基中除去其终产物，以消除反馈阻遏；向培养基中加入代谢途径的某个抑制因子，切断代谢途径通路，可限制细胞内末端产物的积累，便可达到缓解其反馈阻遏的目的；
③促进分泌；
④添加产酶促进剂。
2、酶反应器的类型：
①搅拌罐型：分批反应器和连续流搅拌罐反应器；②固定床型；③流化床型；④膜式反应器；⑤鼓泡塔型；⑥连续搅拌罐式超滤型；⑦循环床型；⑧其他酶反应器。喷射式反应器
3、酶反应器的选择：（底物或产物的理化性质）
①酶催化反应产物的相对分子质量较大时，由于产物难于透过超滤膜的膜孔，不能达到反应与分离同时进行的目的，所以一般不用膜反应器；
⑵遗传控制：①改良菌种：使诱导型变为组成型；使阻遏型变成去阻遏型；②基因工程育种。
5、用于产酶细胞需具备哪些条件：
①酶的产量高；②容易培养和管理；③产酶性能稳定；④利于酶产品的分离纯化；⑤安全可靠。
第四章 酶的分离和纯化
1、细胞破碎方法：
①机械法：机械捣碎法、研磨破碎法、匀浆破碎法、改进高压法（X-press法）、超声波破碎法；
①网格型包埋法：
②微囊型包埋法：
③脂质体包埋法：
4、酶的各种固定化方法的比较：
固定化方法 载体结合法 交联法 包埋法
物理吸附法 离子结合法 共价结合法
制备难易 易 易 难 较难 较难
结合程度 弱 中等 强 强 强
酶活回收率 高，但酶易流失 高 低 中等 高
对底物专一性 不变 不变 可变 可变 不变
⑵交联法：利用双功能或多功能试剂在酶分子间，酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应，以共价键制备固定化酶的方法。优点：操作简便；缺点：交联反应的过程往往比较激烈，许多酶易在固定化过程中失效，酶回收率不高。
酶工程
滞后合成型：设法降低培养基中阻遏物的浓度 ，尽量减少甚 至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使酶 的生物合成提早开始；
中期合成型：在提高mRNA的稳定性以及解除阻遏两方面下 功夫，使其生物合成的开始时间提前， 并尽量 延迟其生物合成停止的时间。
生长因子：细胞生长繁殖所必需的微量有机化合物。
二、微生物培养基
碳源：淀粉或其水解产物 氮源：混合氮源
三、植物细胞培养基
特点：需要大量的无机盐；需要多种维生素和植物生长激素； 一般要求无机氮源；一般以蔗糖为碳源。
常用的培养基：MS培养基、B5培养基、White培养基、KM-8P培养基等。
配制方法：先配制母液； 大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、微生素 母液、植物激素母液。
第三节 产酶工艺条件及其调节控制
保藏细胞
原生质体
细胞活化 细胞扩大培养
固定化细胞
固定化原生质体
培养基
产酶
分离纯化
预培养
无菌空气
酶
图3-1 酶生产的工艺流程
一、细胞活化与扩大培养
将保藏的细胞接种于新鲜的培养基上，在一定的条件下进行 培养，使细胞的生命活性得以恢复的过程。
条件：适合细胞生长、繁殖的最适条件
四、固定化微生物细胞发酵产酶
固定化细胞：采用各种方法固定在载体上，在一定的空间范 围内进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。
（一）固定化细胞发酵产酶的特点
提高产酶率 可以反复使用或连续使用较长时间 稳定性好 缩短发酵周期，提高设备利用率 产品容易分离纯化 适用于胞外酶等胞外产物的生产
（二）固定化细胞发酵产酶的工艺条件控制
同，进行光照的调节控制； 前体的添加：目的代谢物代谢途径上游的物质。 刺激剂的应用：常用的刺激剂有微生物细胞的碎片和果胶酶、
《酶及酶工程》教学大纲
《酶及酶工程》教学大纲Enzyme and Enzyme Engineering课程编码：27A11419 学分： 4.0课程类别：专业必修课计划学时：80 其中讲课：48 实验或实践：32适用专业：生物技术推荐教材：郭勇主编，《酶工程原理与技术》第二版，高等教育出版社，2010年。
参考书目：付加芳编，《酶及酶工程实验》，济南大学出版，2015年。
郭勇主编，《酶工程》第三版，科学出版社，2009年。
课程的教学目的与任务学生通过该课程的学习，应熟悉从应用目的出发研究酶，掌握酶工程的基本原理、酶的生产方法、酶的提取与分离纯化、酶的改造方法、非水相酶催化、酶反应器以及酶的应用，根据需要通过人工操作，掌握酶的生产与应用的技术过程。
进一步了解酶在各行各业中实际应用的最新发展和发展趋势，在以后的毕业环节和工作中能够自觉地应用这些技术方法来指导自己的工作。
本课程实验部分是为《酶及酶工程》课所开的实验。
通过本实验，应使学生掌握酶基本的分离纯化、纯度及分子量测定方法，同时了解凝胶包埋固定脲酶的处理方法及活力、Km值的测定方法，掌握各个因素对脲酶活力的影响测定方法。
通过系统的实验训练，培养学生的独立实验、观察问题、分析问题和解决问题的能力。
课程的基本要求通过本课程的学习要求学生了解酶及工程的发展概况、应用领域及研究内容；掌握酶的生产及分离纯化、酶和细胞的固定化、酶分子的修饰和改造的理论基础；熟悉工业酶生产常用菌种的产酶特性；熟悉工业酶发酵的工业流程、培养条件的优化调控以及提高酶产量所采取的措施；了解固定化细胞、动、植物细胞发酵产酶的特点及工艺条件控制；掌握酶的结晶、浓缩与干燥的原理与常用方法；掌握酶和菌体固定的原理、方法，以及固定化酶的性质。
掌握和了解微生物、植物、动物细胞和原生质的固定方法及应用。
对酶反应器有一定的认识，并掌握酶反应器的设计原理和操作要点；了解酶的动力学和酶在轻工、食品、医药工业、化工、环境保护等领域的应用以及酶应用的最新发展。
酶的生产培训知识
代谢产物
代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋 白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达
3.分解代谢物阻遏
指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮 源）存在时，利用快的那种分解底物会阻 遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。
分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利 用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通 过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所 产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。
木瓜细胞培养生产木瓜蛋白酶和木瓜 凝乳蛋白酶 人黑色素瘤细胞培养生 产血纤维蛋白溶酶原激活剂
动植物细胞培养的特殊性：
1、细胞比微生物细胞大得多，体积大几 千倍，
2、对剪切力敏感，动物细胞没有细胞壁 更甚
3、生长速率比微生物低，生长倍增时间 和发酵周期均更长，
4、对营养的要求较微生物复杂，动物细 胞往往需要添加血清和其他营养成分
（1）不是致病菌及产生有毒物质或其他 生理活生物质的微生物，确保酶生产和 应用的安全。
（2）能在便宜的底物上生长良好，繁殖 快，产酶量高，有利于缩短生周期
（3）产酶性能稳定，菌株不易退化，不 易受噬菌体侵袭。
（4）目标酶的产量要高，性能符合应用 需要，产生的酶容易分离纯化，最好为 胞外酶。
（5）除蛋白酶生产菌种外，其他酶等胞外产物的生产
第三章 酶的生产和制备
第五节 酶的分离纯化（酶的制备）
酶的提取和分离纯化： 将酶从细胞或培养基中抽提出来，
获得与使用目的相适应的有一定纯度 和浓度的酶产品的过程。
两个基本环节：分离和纯化
分离：将酶从原料中抽提出来，并尽可能少 引入杂质，得到粗酶液
纯化：将酶和杂质中分离开来，或者有选择 地将酶从包含杂质中分离出来，得到一定纯 度的酶。
IPTG/乳糖 纤维素/纤维二糖诱导纤 维素酶
酶工程
一、绪论1、生物催化：利用酶或有机体（细胞或细胞器）等）作为催化剂实现化学转化（通常是加快）的过程。
2、生物催化与发酵：1、发酵：用活细胞，将原材料转化成更复杂的目标产物。
2、前体发酵：发酵过程中添加前体物质，并有活细胞将其转化为目标产物。
3、生物转化：用酶或静息细胞经过一系列步骤，将前体转化成目标产物。
4、生物（酶）催化：提取酶或部分纯化的酶，将底物转化成目标产物。
3、酶工程：应用目的出发研究酶，在一定的生物反应装置中利用酶的催化性质，将相应原料转化成有用的物质。
是酶学和工程学相互渗透结合形成的一门新的技术科学，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学。
4、酶工程研究内容：（一）酶的生产（二）化学酶工程（三）生物酶工程（四）酶反应器（五）酶反应介质（六）酶的应用5、酶反应器：活塞流反应器全混流反应器流化床反应器固定床反应器膜反应器二、酶学概述6、酶的分类：（一）按酶催化反应的类型分类1、氧化还原酶2、转移酶3、水解酶4、裂合酶5、异构酶6、连接酶（合成酶）1．氧化还原酶: 催化氧化-还原反应，转移氢或加氧。
主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)、过氧化氢酶、氧合酶、细胞色素氧化酶。
例如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应2、转移酶: 转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。
参与生物物质的代谢.(例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。
) 3、水解酶:水解酶催化底物的加水分解反应（或逆反应）。
主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。
例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应。
4、裂解酶：裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。
5、异构酶：此类酶为生物代谢需要对某些物质进行分子异构化，分别进行外消旋、差向异构、顺反异构等，分为差相异构酶、消旋酶、顺反异构酶等。
6、连接酶（合成酶）：能够催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 键的形成反应。
酶工程 第三章
第一节 酶生物合成的基本理论
三、酶生物合成的调节
如上所述，酶的生物合成要经过一系列的步骤，需要 诸多因素的参与。故此，在转录和翻译过程中，许多因素 都会影响酶的生物合成。那么，究竟哪些因素对酶的生物 合成起主要的调节控制作用呢？研究结果表明，至少在原 核生物中，甚至在所有生物中，转录水平的调节控制对酶 的生物合成是至为重要的。 转录水平调节控制，又称为基因的调节控制。这种控 制理论最早是由雅各（Jacob）和莫诺德(Monod)于1960年 提出的操纵子学说来阐明的，1966年发现了启动基因，使 这一调节控制理论不断完善。
第一节 酶生物合成的基本理论
根据基因调节控制理论，在DNA分子中，与酶生物合 成有密切关系的基因有4种。它们是调节基因(Regulator gene)、启动基因(Promoter gene)、操纵基因(Operator gene)和结构基因(Strutural gene)。其中，结构基因与 酶有各自的对应关系，结构基因中的遗传信息可转录成 mRNA上的遗传密码，再经翻译成为酶蛋白的多肽链。操纵 基因可以特异性地与调节基因产生的边构蛋白（阻抑蛋白） 中的一种结构结合，从而操纵酶合成的时机及速度。结构 基因与操纵基因一起称为操纵子。启动基因决定酶的合成 能否开始，启动基因由两个位点组成，一个是RNA聚合酶 的结合位点，另一个是环腺苷酸（cAMP）与环腺苷酸接受 蛋白（CRP）的复合物（cAMP- CRP）的结合位点。只有在 cAMP- CRP复合物结合到启动基因的位点上时，RNA
第一节 酶生物合成的基本理论
转录时，RNA聚合酶首先结合到DNA的特定位点（启动基因）上，DNA的 双螺旋链部分解开，以其中一条链为模板，通过碱基互补方式结合进第一个 核苷三磷酸，然后随着RNA聚合酶的移动，DNA双螺旋逐渐解开，按照模板上 的碱基顺序逐个加入与其互补的核苷三磷酸并聚合而生成多聚核苷酸链。在 RNA聚合酶后面生成的多聚核苷酸链立即与模板分开，DNA分子的两条链又重 新缠绕形成双螺旋。（图3-1）
酶工程第三章 动植物细胞培养产酶
制备微载体的材料主要有：
葡聚糖（DEAE—Sephadex A50及A25 ） 塑料 明胶 玻璃 纤维素
四、动物细胞培养的工艺条件及其控制
种质细胞：体细胞、杂交瘤细胞； 工艺过程：
胰蛋白酶
种质 细胞
悬浮 细胞
悬浮培 养或贴 壁培养
收集培 养液、 分离纯 化
（一）动物细胞培养基组成成分
生产组织纤溶酶原活化剂的工艺过程
１、人黑色素瘤细胞培养基；
２、人黑色素瘤细胞培养；
３、组织纤溶酶原激活剂的分离纯化。
动、植物细胞培养与微生物培养区别
动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固 体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨 基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血 清。动物细胞对环境敏感，包括pH、溶氧、温度、剪 切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测 和控制。 植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于植物细 胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养 产物，以及植物细胞生长较微生物要缓慢，长时间的 培养对无菌要求及反应器的设计也提出特殊的要求。
1、氨基酸：各种必需氨基酸，谷氨酰胺等， 作为碳源和能源利用； 2、维生素：血清中，B族和维C； 3、无机盐：调节渗透压； 4、葡萄糖：作为碳源和能源； 5、激素：胰岛素、生长激素、氢化可的松； 6、生长因子：如表皮生长因子、神经生长 因子、成纤维细胞生长因子。
（二）动物细胞培养基的配制
首先配制各类母液，使用前混合过滤除菌， 使用时稀释至所需浓度； 各种动物培养基已商品化。
（六）溶解氧的控制
溶解氧的供给对动物细胞培养至关重要； 采用调节混合气体的量与比例的方法。
酶工程复习要点
酶工程复习要点名词解释：1、酶活性中心：只有少数特异的氨基酸残基与底物结合及催化作用。
这些特异的氨基酸残基比较集中的区域，即与酶活力直接相关的区域称为没得活性中心或活性部位。
2、酶别构调节的定义：某些小分子物质与酶的非催化部位或别位特异地结合，引起酶蛋白构象的变化，从而改变酶活性的方式。
能发生别构效应的酶称为别构酶。
3、效应物：与别构酶的别构中心结合，能调节酶的反应速率和代谢过程的物质。
4、同促效应和异促效应：当一个效应物分子和酶结合后，影响另一个相同的效应物分子与酶的另一部位结合称为同促效应；如果一分子效应物和酶结合后，影响另一不同的效应物分子与酶的另一部位结合则称为异促效应。
一个效应物分子与别构酶的别构中心结合后对第二个效应物分子结合的影响称为协同效应。
当一个效应物分子与酶蛋白的一个部位结合后，可使另一部位对效应物亲和力增高的效应称为正协同效应，反之称为负协同效应。
5、酶的专一性：酶对催化的反应和反应物有严格的选择性。
1、结构专一性：分为绝对专一性和相对专一性2、立体异构专一性：分为光学专一性和几何专一性6、酶原的激活：分子内肽键的一处或多处断裂，进而使分子构象发生某种改变，形成酶的活性中心。
7、酶原：有些酶在细胞内合成及初分泌时是没有活性的酶的前体，称为酶原。
8、酶活力：又称为酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。
9、抑制剂：能降低酶的活性，使酶促反应速率减慢的物质10、分解代谢物阻遏：是指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物有关酶合成的现象。
11、反馈阻遏作用：是指酶催化作用的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受阻的过程。
12、操纵子：原核基因组中，由几个功能相关的结构基因及其调控区组成一个基因表达的协同单位，这种单位称为操纵子。
操纵子分：诱导型操纵子、阻遏型操纵子13、效应物：效应物是一类低相对分子质量的信号物质（如糖类及其衍生物、氨基酸和核苷酸等），包括诱导物和辅阻遏物两种。
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第一节 细胞的选择
优良产酶细胞应具备的条件 （1）酶的产量高 （2）容易培养和管理（生长速率高、营养要求低） （3）产酶稳定性好，不易退化 （4）利于分离提纯 （5）安全可靠，无毒性
产酶细胞
微生物 植物细胞 生物细胞
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一、微生物
常用的产酶微生物
大肠杆菌： Escherichia coli 假单胞菌 ：Pseudomonas 枯草杆菌： Bacillus subtilis 微球菌 ：Micrococcus 链球菌 ：Streptococcus 链霉菌： Streptomyces 黑曲霉： Aspergillus niger 米曲霉： Aspergillus oryzae 红曲霉 ： Monascus
大豆细胞 1989 超氧化物歧化酶
番木瓜细胞 大蒜细胞
1986 1989 1993
葡萄糖苷酶 利马豆细胞 1987 菠萝蛋白酶
菠萝细胞 1995
酸性转化酶 碱性转化酶
甜菜细胞 甜菜细胞
1988 剑麻蛋白酶 1988 木瓜凝乳蛋白酶
剑麻细胞 番木瓜细胞
1998
2001
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三、动物细胞
动物细胞培养主要用于生产疫苗、激素、多肽、酶等
胞内外的pH、氧化还原电位和渗透压起调节作用。 大量元素(≥0.5mmol/L) ：
P ，S ，K，Na，Ca，Mg，Cl等元素 微量元素(≤ 0.5mmol/L) ：
Cu， Mn， Zn， Mo ，Co，B，I
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4、生长因素（growth factor） 即生长因子，是指细胞生长繁殖所必需的微量有机化合物。 氨基酸：蛋白质组分 嘌呤、嘧啶：核酸、辅酶、辅基的组分 维生素：起辅酶作用 生长激素：起细胞生长、分裂的调节作用
酶、纤维素酶和木聚糖酶
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二、植物细胞
主要用于色素、药物、香精和酶等初级代谢产物的生产。
酶
产酶植物细胞 年份
酶
产酶植物细胞 年份
糖苷酶
胡萝卜细胞 1981
糖化酶
甜菜细胞 1989
半乳糖苷酶 紫苜蓿细胞 1982 苯丙氨酸裂合酶 花生细胞 1990
漆酶
假挪威械细胞 1983
大豆细胞
过氧化物酶 甜菜细胞 1983 木瓜蛋白酶
酶的生物合成法生产 经过预先设计，通过人工操作，利用微生物、植物及动 物细胞的生命活动，获得所需酶的技术过程，称为酶的 生物合成法生产
产酶细胞 适宜培养 酶的合成 分离纯化
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第三章 酶生物合成法生产
第一节 细胞的选择 第二节 培养基的配制 第三节 产酶工艺条件及其调节控制 第四节 微生物发酵产酶 第五节 植物细胞培养产酶 第六节 动物细胞培养产酶
（2）植物细胞需要多种维生素和植物生长激素： 维生素：如琉胺素（VB1）、吡哆素（VB6）、烟酸、肌醇：浓度一般为 0.1~100mg/L）； 生长激素：生长素、分裂素：浓度一般为0.1~10mg/L，
（3）植物细胞要求的氮源一般为无机氮源：即可以同化硝酸盐和铵盐。 （4）植物细胞一般以蔗糖为碳源：蔗糖的浓度一般为2%~5%。
青霉： Penicillium 木霉： Trichoderma 根霉： Rhizopus 毛霉： Mucor 犁头霉 ：Absidia 啤酒酵母： Saccharomyces cerevisiae 假丝酵母： Candida
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一、微生物
微生物酶的种类 大众工业用酶：淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸
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2、几种常用的植物细胞培养基
（1）MS培养基：MS培养基是1962年由Murashinge和Skoog为烟草细胞培 养而设计的培养基。其特点是硝酸盐（硝酸钾、硝酸铵）的浓度比其他培养 基高，广泛应用于植物细胞、组织和原生质体培养。
（2）B5培养基：B5培养基是1968年Gamborg等人为大豆细胞培养而设计的 培养基。其主要特点是铵的浓度较低，适用于双子叶植物特别是木本植物的 组织、细胞培养。
有机氮：蛋白质及其水解物，如蛋白胨、酵母膏等。
无机氮：含氮的无机物，如氨水、硫酸铵等。
动物细胞：氨基酸、蛋白胨等有机氮
植物细胞：铵盐、硝酸银等无机氮
微生物：
异养型：有机氮
自养型：无机氮
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3、无机盐（inorganic salt） 是提供细胞生命活动所必不可缺的各种无机元素，并对细
酶：纤溶酶原激活剂（tPA）、胶原酶、尿激酶等。
产酶细胞
人黑色素瘤细胞 中国仓鼠卵巢细胞（CHO） 小鼠骨髓瘤细胞 牛内皮细胞
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第二节 培养基的配制
培养基（culture medium）是指人工配制的用于细胞培养和发酵的 各种营养物质的混合物。
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一、培养基的基本成分
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二、微生物培养基
用于微生物培养和发酵生产的各种培养基的总称。 碳源：淀粉或其水解物 氮源：含有有机氮和无机氮的混合氮源 无机盐和生长因子：根据需要添加
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三、植物细胞培养基
1、植物细胞培养基特点（与微生物培养基的不同点）
（1）植物细胞的生长和代谢需要大量的无机盐： 大量元素：P、S、N、K、Na、Ca、Mg等大量元素：浓度一般为 102~3×103mg/L 微量元素：Mn、Zn、Co、Mo、Cu、B、I等：浓度一般为10-2~30 ng/L。
1、碳源（carbon source） 能为细胞提供碳素化合物的物质。 细胞构成、酶的组成，也提供能源 微生物：淀粉、糊精、淀粉水解糖、麦芽糖、葡萄糖 植物细胞：蔗糖 动物细胞：谷氨酰胺、谷氨酸
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2、氮源（nitrogen source）
向细胞提供氮元素的营养物质。
蛋白质、核酸、酶的组成成分。
（3）White培养基：White培养基是1934年由White为番茄根尖培养而设计 的培养基。1963年作了改良，提高了培养基中MgSO4 的浓度，增加了微 量元素硼（B）。其特点是无机盐浓度较低，适用于生根培养。
酶工程 Enzyme Engineering
林范学fanxuelin@
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第三章 酶生物合成法生产
酶的生产方法：
提取分离法 生物合成法 化学合成法
生物合成法：
微生物细胞发酵产酶 植物细胞发酵产酶 动物细胞发酵产酶
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第三章 酶生物合成法生产
酶的生物合成（biosynthesis） 通过细胞的生命活动合成各种酶的过程