2014年高考生物专题复习——PCR技术
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DNA母链 DNA dNTP
3个温度 Mg2+,缓冲对
连续复制
【基础知识】
二、PCR条件：
引物：决定PCR扩增产物的特异性和长度。 引物设计的原则：
1.引物长度：通常为20～30bp，尽量降低引物与非扩 增区的同源性； 2.引物内部不能存在部分互补序列； 3.两个引物之间不能存在部分互补序列；
例题
1 【2011年安徽】家蚕细胞具有高效表达外源基因能力。将人干扰素
基因导入家蚕细胞并大规模培养，可以提取干扰素用于制药。 采用PCR技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。该PCR
反应体系的主要成分应该包含：扩增缓冲液（含Mg2+）、水、4种 脱氧核糖核苷酸、模板DNA、 对干扰素基因特异的DNA引物对 和
基因文库
Leabharlann Baidu
基因组文库
部分基因文库 （如cDNA文库）
基因文库的构建过程
供体细胞的
基
限制酶 全部DNA 大量DNA
因
片段 拼接到载体上
组
文
导入受体细胞扩增
库
基因文库的构建过程
mRNA 逆转录 单链DNA
双链DNA
cDNA文库
利用PCR技术扩增目的基因
PCR的全称： 聚合酶链式反应
PCR的原理： DNA复制
1988年美国穆里斯 （K.Mullis）等人发明，荣 获1993年诺贝尔化学奖。
【基础知识】
一、PCR原理：
DNA复制：半保留复制； DNA的热变性原理。
Taq DNA聚合酶 耐高温。
【基础知识】
一、PCR原理：
DNA复制：半保留复制；
需要提供合成模板；
DNA聚合酶 不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3’-OH；
二、刑侦破案； 三、古生物学； 四、基因克隆： 五、DNA序列测定。
【基础知识】
三、PCR过程：
预变性； 变性； 复性； 延伸； 循环。
例题
4 【2011年江苏】利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内
DNA复制类似（如下图所示）。图中引物中为单链DNA片段，它 是子链合成延伸的基础。 （1）从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所 占比例为 15/16 。 （2）在第 三 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的 DNA片段。
20世纪自然科学的两大成就
核技术： 能量的放大
计算机芯片： 信息的集成
20世纪生命科学的两大成就
PCR技术： 生命信息的放大
基因芯片： 生命信息的集成
高考专题复习
PCR技术
基因工程的基本操作程序的步骤： 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
例题
5 【2011年北京】根据T-DNA的已知序列，利用PCR技术可以扩增出
被插入的基因片段。如下图，从图中A、B、C、D四种单链DNA片段 中选取 B、C 作为引物进行扩增，得到的片段将用于获取该基因 的全序列信息。
【实验操作】
一、实验仪器：
【实验操作】
二、设置对照：避免外源DNA的污染。
例题
3 【2008年江苏】回答下列问题。
（1）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合 酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是 耐高温 。 （2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种 类来设定。表1为根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与 模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？ 引物对B 。
Taq DNA聚合酶 。
例题
2 【2011年江苏】请回答基因工程方面的有关问题：
（1）设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（ 只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。
①第一组： 引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
；
②第二组： 引物Ⅰ’自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效 。
PCR技术扩增目的基因的前提条件： 要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。
利用PCR技术扩增目的基因
PCR的条件： 模板 ——目的基因DNA 原料 ——四种脱氧核苷酸 引物 ——如单链DNA分子片段
酶 ——耐热的DNA聚合酶 控制温度 ——PCR仪自动调控
PCR
多聚酶链式反应 （Polymerase Chain Reaction），是一种体外迅 速扩增DNA片段的技术。
（2）PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正
确反映DNA聚合酶的功能，这是因为 DNA聚合酶只能将单个脱氧核
苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上 。
【基础知识】
二、PCR条件：
温度： 90℃～95℃：变性； 55℃～60℃：复性； 70℃～75℃：延伸。
【注意】具体温度与DNA母链 及引物中的G、C含量有关。
1、目的基因概念： 主要指的是编码蛋白质的结构基因。也
可以是一些具有调控作用的因子。 2、目的基因获取方法： 从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 化学方法直接人工合成
从基因文库中获取目的基因
基因文库：
将含有某种生物不同基因的许多DNA 片断，导入到受体菌的群体中，各个 受体菌分别含有这种生物的不同基因， 称为基因文库。
三、程序设计：
【实验操作】
四、操作提示：
微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前 必须进行高压灭菌；
微量离心管在每吸取一种试剂都必须更换枪头； 所有的成分加入离心管后，盖严盖子，用手指轻轻 弹击管的侧壁，离心10s，使反应液集中在离心管底 部，再放入PCR仪中进行反应。
【实际应用】
一、遗传疾病的诊断： 基因诊断；
合成的方向都是5’→3’。
【基础知识】
二、PCR条件：
胞内DNA复制与PCR技术的比较：
解旋 酶
模板 引物 能量+原料 温度 缓冲液 子链合成
胞内DNA复制 解旋酶，边解旋边复制
解旋酶/DNA聚合酶 DNA母链 RNA dNTP 最适温度
Mg2+,缓冲对 半不连续复制
PCR 变性
Taq DNA聚合酶
3个温度 Mg2+,缓冲对
连续复制
【基础知识】
二、PCR条件：
引物：决定PCR扩增产物的特异性和长度。 引物设计的原则：
1.引物长度：通常为20～30bp，尽量降低引物与非扩 增区的同源性； 2.引物内部不能存在部分互补序列； 3.两个引物之间不能存在部分互补序列；
例题
1 【2011年安徽】家蚕细胞具有高效表达外源基因能力。将人干扰素
基因导入家蚕细胞并大规模培养，可以提取干扰素用于制药。 采用PCR技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。该PCR
反应体系的主要成分应该包含：扩增缓冲液（含Mg2+）、水、4种 脱氧核糖核苷酸、模板DNA、 对干扰素基因特异的DNA引物对 和
基因文库
Leabharlann Baidu
基因组文库
部分基因文库 （如cDNA文库）
基因文库的构建过程
供体细胞的
基
限制酶 全部DNA 大量DNA
因
片段 拼接到载体上
组
文
导入受体细胞扩增
库
基因文库的构建过程
mRNA 逆转录 单链DNA
双链DNA
cDNA文库
利用PCR技术扩增目的基因
PCR的全称： 聚合酶链式反应
PCR的原理： DNA复制
1988年美国穆里斯 （K.Mullis）等人发明，荣 获1993年诺贝尔化学奖。
【基础知识】
一、PCR原理：
DNA复制：半保留复制； DNA的热变性原理。
Taq DNA聚合酶 耐高温。
【基础知识】
一、PCR原理：
DNA复制：半保留复制；
需要提供合成模板；
DNA聚合酶 不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3’-OH；
二、刑侦破案； 三、古生物学； 四、基因克隆： 五、DNA序列测定。
【基础知识】
三、PCR过程：
预变性； 变性； 复性； 延伸； 循环。
例题
4 【2011年江苏】利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内
DNA复制类似（如下图所示）。图中引物中为单链DNA片段，它 是子链合成延伸的基础。 （1）从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所 占比例为 15/16 。 （2）在第 三 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的 DNA片段。
20世纪自然科学的两大成就
核技术： 能量的放大
计算机芯片： 信息的集成
20世纪生命科学的两大成就
PCR技术： 生命信息的放大
基因芯片： 生命信息的集成
高考专题复习
PCR技术
基因工程的基本操作程序的步骤： 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
例题
5 【2011年北京】根据T-DNA的已知序列，利用PCR技术可以扩增出
被插入的基因片段。如下图，从图中A、B、C、D四种单链DNA片段 中选取 B、C 作为引物进行扩增，得到的片段将用于获取该基因 的全序列信息。
【实验操作】
一、实验仪器：
【实验操作】
二、设置对照：避免外源DNA的污染。
例题
3 【2008年江苏】回答下列问题。
（1）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合 酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是 耐高温 。 （2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种 类来设定。表1为根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与 模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？ 引物对B 。
Taq DNA聚合酶 。
例题
2 【2011年江苏】请回答基因工程方面的有关问题：
（1）设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（ 只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。
①第一组： 引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
；
②第二组： 引物Ⅰ’自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效 。
PCR技术扩增目的基因的前提条件： 要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。
利用PCR技术扩增目的基因
PCR的条件： 模板 ——目的基因DNA 原料 ——四种脱氧核苷酸 引物 ——如单链DNA分子片段
酶 ——耐热的DNA聚合酶 控制温度 ——PCR仪自动调控
PCR
多聚酶链式反应 （Polymerase Chain Reaction），是一种体外迅 速扩增DNA片段的技术。
（2）PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正
确反映DNA聚合酶的功能，这是因为 DNA聚合酶只能将单个脱氧核
苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上 。
【基础知识】
二、PCR条件：
温度： 90℃～95℃：变性； 55℃～60℃：复性； 70℃～75℃：延伸。
【注意】具体温度与DNA母链 及引物中的G、C含量有关。
1、目的基因概念： 主要指的是编码蛋白质的结构基因。也
可以是一些具有调控作用的因子。 2、目的基因获取方法： 从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 化学方法直接人工合成
从基因文库中获取目的基因
基因文库：
将含有某种生物不同基因的许多DNA 片断，导入到受体菌的群体中，各个 受体菌分别含有这种生物的不同基因， 称为基因文库。
三、程序设计：
【实验操作】
四、操作提示：
微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前 必须进行高压灭菌；
微量离心管在每吸取一种试剂都必须更换枪头； 所有的成分加入离心管后，盖严盖子，用手指轻轻 弹击管的侧壁，离心10s，使反应液集中在离心管底 部，再放入PCR仪中进行反应。
【实际应用】
一、遗传疾病的诊断： 基因诊断；
合成的方向都是5’→3’。
【基础知识】
二、PCR条件：
胞内DNA复制与PCR技术的比较：
解旋 酶
模板 引物 能量+原料 温度 缓冲液 子链合成
胞内DNA复制 解旋酶，边解旋边复制
解旋酶/DNA聚合酶 DNA母链 RNA dNTP 最适温度
Mg2+,缓冲对 半不连续复制
PCR 变性
Taq DNA聚合酶