分子生物学课件第16讲

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2， gal操纵元的启动子（图8－9） gal操纵元的启动子 操纵元的启动子（ （1）gal P1 •转录起始位置：S1（+1） 转录起始位置： 转录起始位置 S1（+1） •转录依赖cAMP-CAP 转录依赖cAMP 转录依赖cAMP•功能：葡萄糖不存在时负责gal操纵元 功能： gal操纵元 功能 葡萄糖不存在时负责gal 的转录 （2）gal P2 •转录起始位置：S2（-5） 转录起始位置： 转录起始位置 S2（ •转录不依赖cAMP-CAP 转录不依赖cAMP 转录不依赖cAMP•功能：葡萄糖存在时负责gal操纵元的 功能： gal操纵元的 功能 葡萄糖存在时负责gal 转录
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2，CAP的作用 CAP的作用 （1）CAP的结构特征 CAP的结构特征 •CAP是同源二聚体，由两个 CAP是同源二聚体，由 22.5KD的亚基构成 22.5KD的亚基构成 •CAP单体含DNA结合区及转录 CAP单体含DNA结合区及转录 激活区
CAP结合的DNA位点 （2）CAP结合的DNA位点
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（二）araBAD操纵元的调控
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1，araC基因产物及其结合位点 （1）araC基因对araBAD正调控 的遗传学证据 （2）AraC蛋白的2种形式
•Crep ：未结合阿拉伯糖的AraC蛋 白 •Cind：结合阿拉伯糖的AraC蛋白
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• CAP二聚体结合启动子中一个约22bp的序 CAP二聚体结合启动子中一个约22bp的序 列 阻止CAP作用的突变位于保守的五核苷酸 • 阻止CAP作用的突变位于保守的五核苷酸 序列中（TGTGA），该序列可能是识别的 序列中（TGTGA），该序列可能是识别的 必需成分
半乳糖表异构酶 半乳糖转移酶
UDPGlu
•总反应：半乳糖+ATP 葡萄糖1-磷酸+ADP+H
（二）gal操纵元 Nanjing 1，gal操纵元组成 University （1）结构基因（galK，galT，galE） （2）调节基因（galR） •与结构基因相距很远 •诱导物：半乳糖 •galR－突变：造成组成型表达 （3）P/O位点 •galOC突变：造成组成型表达
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（四）Gal阻遏蛋白的作用 机制
1，gal阻遏蛋白的作用位点 •galOE：位于-60左右 •galOI：与gal OE相距>90bp
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2， gal阻遏蛋白可能的作用机制 （1） gal阻遏蛋白与galOE 结合， 可能通过以下途径发挥作用： •妨碍了cAMP-CAP与其位点的结合 •或改变cAMP-CAP对转录的促进作 用
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2，araBAD操纵元的组成 （1）结构基因
•araB：编码L-核酮糖激酶 •araA：编码L-阿拉伯糖异构酶 •araD：编码L-核酮糖-5-磷酸表异构酶
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（2）操纵元结构（图8-11）
•araC及araBAD 各有启动子， 但转录方向相反
二、阿拉伯糖操纵元：具有 Nanjing University 双重功能（正调控和负调控） 的调节蛋白 (一)阿拉伯糖代谢酶基因的 操纵元 1，阿拉伯糖调控元
（1）三个参与阿拉伯糖代谢的酶的 Nanjing University 基因的操纵元 •ara BAD •araE，araFG：E，F，G编码膜结合 蛋白，与阿拉伯糖的结合与转运有 关 •调节基因：araC （2）调控元：由一个调节基因控制 几个操纵元的系统
（3）CAP Nanjing University 的激活 •只有当 cAMP存在 cAMP存在 时，CAP才 时，CAP才 具有活性
（4）CAP对转录的激活作用 CAP对转录的激活作用 Nanjing University A，CAP激活转录的途径 CAP激活转录的途径 • 直接与RNA聚合酶作用 直接与RNA聚合酶作用 • 作用于DNA，以某种方式改 作用于DNA，以某种方式改 变其结构以利于RNA聚合酶 变其结构以利于RNA聚合酶 的结合
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•CAP与有两个（相反的）五 CAP与有两个（相反的）五 核苷酸序列的位点结合最强， 因为这样两个单体均可结合 DNA
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•相对于RNA 相对于RNA 聚合酶的结 合位点， CAP可以与 CAP可以与 不同的DNA 不同的DNA 位点结合
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（ 三 ） cAMP-CAP 对 galP1 和 gal cAMPgalP1 P2的控制
1 ， gal 启动子的 cAMP-CAP 结合位 gal启动子的 cAMP-CAP结合位 启动子的cAMP 点 位置： 76~ （1）位置：-76~-47 （2）序列特点（图8－10） 序列特点（ 10） •具有保守性和对称性 具有保守性和对称性
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（ ２ ） gal 阻 遏 蛋 白 与 galOI 结合可能导致两个操 作子之间的DNA形成环状结 构，两个阻遏蛋白通过相 互作用而强化了阻遏效应
（五）gal操纵元双启动子的意义
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1，半乳糖的双重作用 （1）作为细菌的碳源 （2）UDPGal是细菌细胞壁的重要 前体 2，双启动子的作用 （1）galP1保证细菌可以利用半乳 糖作为碳源 （2）galP2保证有葡萄糖存在时， 细菌可以合成UDPGal
二、CAP对启动子的正调控 二、CAP对启动子的正调控
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1，cAMP在分解代谢产物抑制中的 cAMP在分解代谢产物抑制中的 作用 • 葡萄糖引起cAMP水平下降是分解 葡萄糖引起cAMP水平下降是分解 代谢产物抑制的原因 • cAMP由腺苷酸环化酶 cAMP由腺苷酸环化酶 （adenylate cyclase，cya） cyclase，cya） 合成 • cya基因突变体对葡萄糖变化没有 cya基因突变体对葡萄糖变化没有 反应
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1，诱导物与操作子上的阻遏蛋白直接结 合的证据 2，诱导物与阻遏蛋白的结合 3，阻遏蛋白与不同DNA的结合 ，阻遏蛋白与不同DNA的结合 （1）不同形式的阻遏蛋白与不同DNA结 ）不同形式的阻遏蛋白与不同DNA结 合的特异性 （2）细胞内阻遏蛋白的结合位点 （3）细胞内阻遏蛋白的存在
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B，CAP与DNA和RNA聚 CAP与DNA和RNA聚 合酶的作用 •CAP二聚体结构保证了一 CAP二聚体结构保证了一 个亚基可与RNA聚合酶接 个亚基可与RNA聚合酶接 触，哪一个亚基以何种方 向与DNA结合无关紧要 向与DNA结合无关紧要
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（四）影响阻遏蛋白与操作子相互作用的
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突变体 1，i-突变体 2，iS突变体 3，it突变体 4，i-d突变体 • 等位基因互补 5，Oc突变体
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第四节 分解代谢产物抑制涉及 分解代谢产物抑制涉及 的启动子正调控
1，某些启动子转录的起始需要辅助蛋 ，某些启动子转录的 白质 • 某些启动子缺乏保守的RNA聚合酶 某些启动子缺乏保守的RNA RNA聚合酶 识别位点（-35序列 / Sextama 框） 识别位点（-35序列 和结合位点（-10序列 和结合位点（-10序列 /Pribnow 框），需要辅助蛋白质参与转录的起 始
（3）阻遏蛋白有效地使RNA聚 合酶与lac启动子上形成一个 很强的关闭式的转录起始复合 物，阻止转录的起始 （4）阻遏蛋白的这种作用对 操纵元的诱导也有促进意
4，上述模式不一定适用于其他系
（二）阻遏蛋白上与操作子结合 Nanjing University 的位点 1，阻遏蛋白单体的结构 （1）长头片段（long ）长头片段（long headpiece） headpiece） （2）短头片段 （3）核心片段（core） ）核心片段（core） （4）铰链区
C，CAP对RNA聚合酶的作 CAP对RNA聚合酶的作 用取决于两者的相对位置： •CAP位于启动子内部（如 CAP位于启动子内部（如 gal）时，可提高闭合复合物 gal）时，可提高闭合复合物 向开放复合物的转化速率 •当CAP位于启动子临近位置 CAP位于启动子临近位置 （如lac）时，其主要作用是 （如lac）时，其主要作用是 提高最初结合的速率，以形 成开放复合物
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3，阻遏蛋白对RNA聚合酶功能的 影响 （1）阻遏蛋白和RNA聚合酶可同 时与DNA结合 （2）阻遏蛋白与DNA的结合能增 强RNA聚合酶结合启动子的能力 （RNA聚合酶与的平衡常数从 1.9*107增加到2.5*109）
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第四节 操纵元的其他 操纵元的其他调控形式
一、具有双启动子的源自文库乳糖操纵元 （一）半乳糖代谢 1，半乳糖代谢相关的酶 （1）半乳糖激酶 （2）半乳糖转移酶 （3）半乳糖表异构酶
2，代谢步骤
Nanjing University （1）半乳糖+ATP
半乳糖激酶
半乳糖1-磷酸+ADP+H （2）半乳糖1-磷酸+UDPGlu UDPGal+葡萄糖1-磷酸 （3） UDPGal
一、分解代谢产物抑制 一、分解代谢产物抑制
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•最常见的是大肠杆菌对碳 源利用有关的一组操纵元， 受一种代谢产物激活蛋白 （catabolite activator protein， protein， CAP） CAP）控制，在葡萄糖存 在时保证细菌优先利用葡 萄糖
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2，cAMP-CAP对S1转录的激活 cAMP-CAP对 及对S 及对S2转录的阻遏 •对galP1：有激活作用 对galP1 •对 galP2 ： cAMP-CAP 结合位 对 galP2 cAMP点离galP 较近，妨碍RNA galP2 RNA聚 点离galP2较近，妨碍RNA聚 合酶与galP galP2 合酶与galP2的结合
2，阻遏蛋白四聚体的结构
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3，阻遏蛋白与操作子的结合 4，阻遏蛋白需要组成四聚体才能实现完 全的阻遏作用 （1） lac系统存在多个操作子 （2）阻遏蛋白四聚体可以同时与两个操 作子结合 （3）阻遏蛋白结合第二个操作子影响阻 遏的水平
（三）阻遏蛋白与操作子的解离
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2，分解代谢产物抑制 ，分解代谢产物抑制 •含义：葡萄糖会引起许多操纵元 （包括乳糖操纵元、半乳糖操纵元 和阿拉伯糖操纵元）表达的阻遏 和阿拉伯糖操纵元）表达的阻遏 •原因：葡萄糖引起cAMP含量下 原因：葡萄糖引起cAMP含量下 降，使分解代谢产物激活蛋白失活， 降，使分解代谢产物激活蛋白失活， 从而抑制依赖该蛋白的利用其他碳 从而抑制依赖该蛋白的利用其他碳 源的代谢相关酶的表达
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（3）AraC结合位点
•araO1 (-110~-140)：与araPC 重 叠 •araO2 (-265~-294) •araI (-40~-78)：下游与RNA聚 合酶结合位点紧密相连，上游与 CAMP-CAP 结 合 位 点 （ -107~-78 ） 紧密相连
三、阻遏蛋白与操作子的相互作用
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（一）操作子上与阻遏蛋白结 合的位点 1，lacI基因的表达特点 2，lac操作子（lacO）与阻遏蛋
白的结合 （1）阻遏蛋白与lacO结合的实 验证据
（2）lacO与阻遏蛋白结合的位 Nanjing University 点及其结构 A，DNA内切核酸酶消化实验证明： 受阻遏蛋白保护区域位于-5 ~ +21(26bp) B，阻遏蛋白保护位点 C，lacO 的结构及其与阻遏蛋白 的结合性质