抗体检测技术课件
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凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合反 应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整的 细菌、红细胞等与相应抗体相混合，在一 定条件下出现凝集。凝集反应中抗原称为 凝集原，抗体称为凝集素。
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沉淀反应
1、絮状沉淀反应 2、环状沉淀反应 3、双向扩散 4、单向免疫扩散
以消除非特异吸附的干扰
㈡ 酶结合物： 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
1. 要求：纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳
定、来源丰富、标记后稳定
2. 常用酶：HRP、AP、ß-半乳糖苷酶等
3. 底物：
HRP可溶性底物及呈色： 邻苯二胺(OPD)：橙红(492nm)；四甲基联苯胺(TMB)：蓝色(450nm) 5-氨基水杨酸(5-ASA)：棕色(550nm) 鲁咪诺+H2O2：荧光
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一、试剂及仪器准备
（一） 免疫吸附剂 1.固相Fra Baidu bibliotek体
⑴ 要求：① 吸附力强 ② 能保持Ag或Ab活性 ③ 不参与化学反应
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⑵ 载体性能比较 要求：载体材料+、- 结果差别大 检测方法：10ug/L IgG包被,加酶标抗IgG，显
色后，测20孔的OD，要求CV<10%
⑶ 常用载体： 材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等 形状：小试管、小珠、微量反应板
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2. Ag或Ab：纯度高、效价高、结合力高
3. 免疫吸附剂(固相Ag或Ab)： 包被：将Ag或Ab固相化的过程 包被缓冲液 封闭：包被后在用1-5%小牛血清白蛋白再包被，
实验原理
ELISA利用了免疫反应的高度特异性和酶促反应的 高度敏感性检测抗原或抗体 1. 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其 免疫活性 2. 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这 种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的 活性 3. 按一定步骤进行抗原抗体反应 4. 加底物显色，根据颜色反应的深浅进行定性或定量 分析
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双向扩散法的操作：生理盐水配制1%-5%的 琼脂，取4mL倒在显微镜用的载玻片上，凝 固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入 抗体用于测定抗体效价，中心孔滴入抗体， 外周孔滴入抗原，用于检测抗原的存在和 定性抗原。
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A sandwich ELISA. (1) Plate is coated with a capture antibody; (2) sample is added, and any antigen present binds to capture antibody; (3) detecting antibody is added, and binds to antigen; (4) enzymelinked secondary antibody is added, and binds to detecting antibody; (5) substrate is added, and is converted by enzyme to detectable form.
直接法： 此法用于未知抗原的检测，将未知待测抗原吸附于固相载体，加入已知酶标针对特定抗原的 抗体。 间接法： 此法用于未知抗体的检测，将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗体）与之 结合，洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体（酶标抗抗体）和底物进行测定。 双抗体夹心法 此法常用于测定抗原，将已知抗体吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗原）与之结合， 洗涤后，加入酶标抗体和底物进行测定。 双夹心间接法 此法常用于测定抗体，将已知抗原（捕获抗体的抗原）吸附于固相载体，加入待检标本（含 相应抗体）与之结合，洗涤后，加入特异性抗抗体，洗涤，再加入抗抗体特异性的酶标抗体 和底物进行测定。
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➢抗体检测技术
免疫酶技术 免疫荧光技术 凝集反应 沉淀反应 补体结合试验 放射免疫测定 蛋白印迹 免疫共沉淀 亲和力测定
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凝集反应
抗原抗体为单一体系时，抗原浓度不同，沉 淀弧的特征不同：
抗原抗体为多体系时，出现的沉淀弧 有多条，彼此互不干扰。
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酶联免疫吸附测定实验 (ELISA)
Enzyme linked immunosorbent assay
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HRP不可溶性底物及呈色： DAB：棕黄色 α-萘酚：红色 3-氧基-9-乙基卡唑：红色 4-氯-1-萘酚： 灰蓝色
AP可溶性底物及呈色： 对硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黄色(405nm) 4-甲基伞基磷酸酯(4-MuP)： 荧光
AP不可溶性底物及呈色： NBT和BCIP混合液：紫色 坚固红和萘酚ASMX混合液：红色
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方法类型
ELISA既可测抗原又可测抗体，根据试 剂来源、标本性状以及检测的具体条件， 可设计出不同类型的检测方法：
1.直接法 2.间接法 3.双抗体夹心法 4.双夹心间接法
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沉淀反应
1、絮状沉淀反应 2、环状沉淀反应 3、双向扩散 4、单向免疫扩散
以消除非特异吸附的干扰
㈡ 酶结合物： 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
1. 要求：纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳
定、来源丰富、标记后稳定
2. 常用酶：HRP、AP、ß-半乳糖苷酶等
3. 底物：
HRP可溶性底物及呈色： 邻苯二胺(OPD)：橙红(492nm)；四甲基联苯胺(TMB)：蓝色(450nm) 5-氨基水杨酸(5-ASA)：棕色(550nm) 鲁咪诺+H2O2：荧光
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一、试剂及仪器准备
（一） 免疫吸附剂 1.固相Fra Baidu bibliotek体
⑴ 要求：① 吸附力强 ② 能保持Ag或Ab活性 ③ 不参与化学反应
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⑵ 载体性能比较 要求：载体材料+、- 结果差别大 检测方法：10ug/L IgG包被,加酶标抗IgG，显
色后，测20孔的OD，要求CV<10%
⑶ 常用载体： 材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等 形状：小试管、小珠、微量反应板
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2. Ag或Ab：纯度高、效价高、结合力高
3. 免疫吸附剂(固相Ag或Ab)： 包被：将Ag或Ab固相化的过程 包被缓冲液 封闭：包被后在用1-5%小牛血清白蛋白再包被，
实验原理
ELISA利用了免疫反应的高度特异性和酶促反应的 高度敏感性检测抗原或抗体 1. 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其 免疫活性 2. 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这 种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的 活性 3. 按一定步骤进行抗原抗体反应 4. 加底物显色，根据颜色反应的深浅进行定性或定量 分析
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双向扩散法的操作：生理盐水配制1%-5%的 琼脂，取4mL倒在显微镜用的载玻片上，凝 固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入 抗体用于测定抗体效价，中心孔滴入抗体， 外周孔滴入抗原，用于检测抗原的存在和 定性抗原。
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A sandwich ELISA. (1) Plate is coated with a capture antibody; (2) sample is added, and any antigen present binds to capture antibody; (3) detecting antibody is added, and binds to antigen; (4) enzymelinked secondary antibody is added, and binds to detecting antibody; (5) substrate is added, and is converted by enzyme to detectable form.
直接法： 此法用于未知抗原的检测，将未知待测抗原吸附于固相载体，加入已知酶标针对特定抗原的 抗体。 间接法： 此法用于未知抗体的检测，将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗体）与之 结合，洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体（酶标抗抗体）和底物进行测定。 双抗体夹心法 此法常用于测定抗原，将已知抗体吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗原）与之结合， 洗涤后，加入酶标抗体和底物进行测定。 双夹心间接法 此法常用于测定抗体，将已知抗原（捕获抗体的抗原）吸附于固相载体，加入待检标本（含 相应抗体）与之结合，洗涤后，加入特异性抗抗体，洗涤，再加入抗抗体特异性的酶标抗体 和底物进行测定。
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免疫酶技术 免疫荧光技术 凝集反应 沉淀反应 补体结合试验 放射免疫测定 蛋白印迹 免疫共沉淀 亲和力测定
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凝集反应
抗原抗体为单一体系时，抗原浓度不同，沉 淀弧的特征不同：
抗原抗体为多体系时，出现的沉淀弧 有多条，彼此互不干扰。
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酶联免疫吸附测定实验 (ELISA)
Enzyme linked immunosorbent assay
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HRP不可溶性底物及呈色： DAB：棕黄色 α-萘酚：红色 3-氧基-9-乙基卡唑：红色 4-氯-1-萘酚： 灰蓝色
AP可溶性底物及呈色： 对硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黄色(405nm) 4-甲基伞基磷酸酯(4-MuP)： 荧光
AP不可溶性底物及呈色： NBT和BCIP混合液：紫色 坚固红和萘酚ASMX混合液：红色
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方法类型
ELISA既可测抗原又可测抗体，根据试 剂来源、标本性状以及检测的具体条件， 可设计出不同类型的检测方法：
1.直接法 2.间接法 3.双抗体夹心法 4.双夹心间接法
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