第一章提取与沉淀分离技术

2020/9/28
第二节 提取
定义：一定条件下，用适当的溶剂（溶液）处理原料 使欲分离物质充分溶解到溶剂（溶液）中的过程。 也称为抽提。
一 提取方法
1.1 盐溶液提取
盐溶/盐析：低盐下，蛋白质溶解度随盐浓度的升 高而增加/盐浓度达到某一界限后， 蛋白质溶解度随盐浓度升高而下降。
低盐—蛋白质提取—0.02-0.5mol/L 高盐—蛋白质沉淀
三、有目的地对 DNA进行剪切拼接，引入细胞中 （或分子克隆技术）等。
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第一篇 生化分离技术
定义 从含有多种组分的混合物中将某种生化物质
与其他物质分离的技术
目的
细胞破碎
缩短整个下游过程的流程和提高单项操作的效率
新趋势——高效集成化
1 继续研究和完善一些适用于生化工程的新型分离技术； 2 进行各种分离技术的高效集成化。
特点：此法适用于组织细胞，多用于动物性材料， 对微生物细胞作用较差。
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2.2 冷热更替法
将材料投入沸水中，维持90℃左右维持数分钟，立即 置于冰水浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。
2.3 压力差破碎法
通过压力的突然变化，使细胞破碎。 高压冲击法、突然降压法、渗透压变化法
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三 有机溶剂沉析
原理 （一）亲水性有机溶剂本身的水合作用降低了 自由水的浓度，使溶质分子周围的水化层变薄， 导致脱水而相互聚集析出，也就是降低了溶质 的溶解度。 （二）有机溶剂的介电常数比水小，加入有机 溶剂后，整个溶液的介电常数降低，带电的溶 质分子之间库仑引力增强，使溶质分子相互吸 引而聚集。
植物细胞壁的化学组成和结构 初生壁，次生壁 具有很高的机械强度
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细胞破碎技术
一 机械破碎法
通过机械运动产生的剪切力作用使细胞破碎的方法 。 分为捣碎法、研磨法和匀浆法
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1.1 捣碎法 利用捣碎机的高速旋转叶片产生的剪切力将组织细胞破碎。
如叶绿体的分离 常用于动物内脏、植物叶片等较脆嫩的 组织细胞； 微生物细胞破碎也可以使用
等电点沉析的注意事项
（一）等电点的改变 （二）目的物的稳定性 （三）盐溶作用 （四）pH的调节
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等电点沉析的应用
（一）在生化产品的分离纯化过程中，常利用 两性物质如氨基酸、蛋白质、多肽、酶、核酸 等具有不同的等电点的特性来进行产品的分离 纯化。 （二）等电点沉析只适用于水化程度不大，在 等电点时溶解度很低的物质，如四环素等在等 电点(pH=5.4)附近,难溶于水，能产生沉析。
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三 化学破碎法
某些有机溶剂（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性剂、 金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或 膜的通透性从而使内容物有选择地渗透出来。
作用机理：化学渗透取决于化学试剂的类型以 及细胞壁和膜的结构与组成。
特点：多用于破碎细菌，且作用比较温和； 提取核酸时，常用此法破碎细胞。
④根据疏水相互作用或氢键形成的引力进行分辨者， 有反相高效液相层析、分子杂交技术等。
⑤根据特异相互作用进行分辨者，有亲和层析、免疫化学分析法等。
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二、经一系列不同的化学和物理方法处理，以求得差异分辨， 或按指令合成不同的高分子物质。如氨基酸序列分析和 序列合成、核苷酸序列分析和序列合成等。
数几种组分首先沉淀，过滤分离后重新调节pH值， 加入另种沉淀剂使另外少数几种组分生成沉淀。 如此依次沉淀和分离后，可将复杂试样中的各组 分分成若干组，使得复杂的分析问题变得较简单。
盐析/有机溶剂沉析/等电点沉析/有机聚合物沉析 /其他沉析技术
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一 盐析
原理 溶液加入高浓度中性盐后，盐离子与生物分子表
现代生化技术
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用于生物化学大分子研究的独特的分析、制备技术 生物化学实验技术的主要特点是：
①操作温和，使对所研究组分的天然结构和功能的损害， 尽可能减少至最小。
②微量分析，低达ng或pg(10-12 g)水平；或大量分离制备， 高达公斤级。
③分辨率高，可明确区分结构或性质极其相似的物质。
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第一章 提取与沉淀分离技术
第一节 细胞破碎
定义 采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和
细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相 中，破碎后的细胞浆液经固液分离除去细胞碎片 后，再采用不同的分离手段进一步纯化.
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细胞壁的组成和结构
微生物细胞壁的化学组成和结构 细菌：肽聚糖的网状结构 酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质 真菌：细胞壁更厚
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1.2 酸溶液提取 酸性条件下，溶解度大、稳定的物质使用 PH不能太低，以免失活；一般PH3-6
1.3 碱溶液提取 碱性条件下，溶解度大、稳定的物质使用 PH不能过高，以免影响酶活性；
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1.4 有机溶剂提取 与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的蛋白质，
采取与水可以混溶的乙醇、丙酮等有机溶剂提取； DNA和RNA可以采用苯酚水溶液提取： DNA、蛋白质-苯酚层 RNA、多 糖-水层
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现代生物化学实验技术，按其目的和性质分为三类。
一、按不同的物理化学性质进行分析鉴定和分离制备， 其中又可分为五类
①根据分子的大小进行分辨者，有凝胶过滤法、超速离心法、 超滤法、 SDS电泳分析等。
②根据分子荷电情况进行分辨者，有等电聚焦电泳法、 离子交换层析法等。
③根据吸收光谱和放射性等性质进行分辨者,有紫外/红外/ 荧光分光光度法、X射线结构分析法、电子顺磁共振,电子自旋 共振和核磁共振法,以及放射性核素示踪和放射免疫分析法等。
基团与疏水基团不相同，不同生物分子产生盐析 现象所需中性盐的浓度（离子强度）亦不同。
（三）生物分子浓度 溶液中生物分子的浓度对盐析的效果有很大
的影响，要得到理想的沉析效果，必须将生物分 子的浓度控制在一定的范围内。一般对于蛋白质 溶液，其浓度为2%～3%比较合适。
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（四） pH值 在盐析时，如果要沉析某一成分，应将
等电点沉析原理 调节两性生化物质溶液的pH值，以达到某
一生化物质的等电点，使其从溶液中沉淀析 出而实现分离的技术称为等电点沉析技术。
等电点(pI)是两性物质在其质点的净电荷为零时 介质的pH值,溶质净电荷为零，分子间排斥 电位降低，吸引力增大，能相互聚集起来， 沉淀析出，此时溶质的溶解度最低
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面的带相反电荷的离子基团结合，中和了生物分子 表面的电荷，降低了生物分子与水分子之间的相互 作用，生物分子表面水化膜逐渐被破坏，当盐浓度 达到一定的限度时，生物分子之间的排斥力降到很 小，此时生物分子很容易相互聚集，在溶液中的溶 解度降得很低，从而形成沉淀从溶液中析出。
产生盐析的另一个原因是大量盐离子自身的水合 作用降低了自由水的浓度，使生物分子脱去了水化 膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用， 使其沉淀析出。
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（二）盐析的主要应用
盐析是最早使用的生化分离技术之一，由于易 产生共沉作用，故其分辨率不是很高，但配其他手 段完全能达到很好的分离效果。
由于成本低，操作安全简单，对许多生物活性 物质具有很好的稳定作用，常用于蛋白质、酶、多 肽、多糖、核酸等物质的分离纯化。
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二 等电点沉析
溶液的pH值调整到该成分的等电点，如果希 望某一成分保留在溶液中不析出，则应使溶 液的pH值偏离该成分的等电点。
（五）温度 多数物质的溶解度会受温度变化的影响。
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盐析的操作与应用
（一）盐析的操作 1、盐的处理 硫酸铵使用时要求纯度较高，生产 时为降低成本，一般选用化学纯的硫酸铵，在使 用前应进行预处理，可通过化学法将重金属除去， 再将硫酸铵重结晶备用。 2、加盐的方法
2.4 超声波处理
用一定功率的超声波处理细胞悬液， 使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于 微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶， 常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，频 高于15～20KHz的超声波在高强度声能 输入下可以进行细胞破碎。
破碎机理：可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。 超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及 首种类型等因素有关。
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五 选择破碎方法的依据
(1)细胞的处理量 (2)细胞壁的强度和结构 (3)目标产物对破碎条件的敏感性 (4) 破碎程度
适宜的操作条件应从高的产物释放率，低的 能耗和便于后步提取这些方面进行权衡
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六 破碎技术研究的方向
(1)多种破碎法的结合 (2)与上游技术结合 (3)与下游操作技术结合
（1）直接加入固体硫酸铵法 （2）加入饱和硫酸铵溶液法
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3、盐析操作注意事项 （1）盐析反应完全需要一定时间，一般硫酸 铵全部加完后，应放置30min以上才可进行固液分离。 （2）经过一次分级得到的盐析沉淀，能否进 行第二次盐析要靠试验确定。 （3）盐析操作时加入盐的纯度、加量、加入 方法、搅拌的速度、温度及pH等参数应严格控 制。
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影响盐析的因素
（一）盐离子浓度 在低盐浓度时，盐离子能增加生物分子表面
电荷，使生物分子水合作用增强，具有促进溶解 的作用，称盐溶现象。当盐浓度达一定值后,盐浓 度升高，生物分子溶解度不断降低,产生了盐析作 用,不同的生物分子，“盐溶”与“盐析”的分界 值不同。
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（二）生物分子种类 生物分子的分子结构不同，其分子表面亲水
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特点：操作简单，重复性较好，节省时间； 多用于微生物和组织细胞的破碎。
存在问题：超声波破碎在实验室规模应用较普遍， 处理少量样品时操作简便，液量损失少，但是 超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性 活性物质变性失活。