提取与沉淀分离技术
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细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相 中，破碎后的细胞浆液经固液分离除去细胞碎片 后，再采用wk.baidu.com同的分离手段进一步纯化.
细胞壁的组成和结构
微生物细胞壁的化学组成和结构 细菌：肽聚糖的网状结构 酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质 真菌：细胞壁更厚
植物细胞壁的化学组成和结构 初生壁，次生壁 具有很高的机械强度
第一篇 生化分离技术
定义 从含有多种组分的混合物中将某种生化物质
与其他物质分离的技术
目的
细胞破碎
缩短整个下游过程的流程和提高单项操作的效率
新趋势——高效集成化
1 继续研究和完善一些适用于生化工程的新型分离技术； 2 进行各种分离技术的高效集成化。
第一章 提取与沉淀分离技术
第一节 细胞破碎
定义 采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和
2.1 反复冻溶法
原理：反复冻融过程中，由于渗透压的变化，使结合 水冻结产生组织的变性，冰片将细胞膜破碎，使蛋白质 可溶化，成为黏稠的浓溶液，但脂蛋白冻结变性。
方法：将待破碎的细胞于冷藏库或干冰反复于零下 15-20℃使之凝固，然后缓慢地融解，如此反复操作， 使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。
特点：此法适用于组织细胞，多用于动物性材料， 对微生物细胞作用较差。
作用机理：化学渗透取决于化学试剂的类型以 及细胞壁和膜的结构与组成。
特点：多用于破碎细菌，且作用比较温和； 提取核酸时，常用此法破碎细胞。
存在的问题：时间长，效率低；化学试剂毒性较强， 同时对产物也有毒害作用，进一步分离时需要用透析 等方法除去这些试剂；通用性差：某种试剂只能作用 于某些特定类型的微生物细胞。
细胞破碎技术
一 机械破碎法
通过机械运动产生的剪切力作用使细胞破碎的方法。 分为捣碎法、研磨法和匀浆法
1.1 捣碎法 利用捣碎机的高速旋转叶片产生的剪切力将组织细胞破碎。
如叶绿体的分离
常用于动物内脏、植物叶片等较脆嫩的 组织细胞； 微生物细胞破碎也可以使用
1.2 匀浆法
影响匀浆破碎的主要因素 是压力、温度和通过匀 浆器阀的次数。
存在的问题：易造成产物抑制作用，这可能是导致 胞内物质释放率低的一个重要因素。而且溶酶价格高， 限制了大规模利用。若回收溶酶，则又增加分离 纯化溶酶的操作。 另外酶溶法通用性差，不同菌种需选择不同的酶。 有一定局限性，不适宜大量的蛋白质提取，给进一步 纯化带来困难。
五 选择破碎方法的依据
(1)细胞的处理量 (2)细胞壁的强度和结构 (3)目标产物对破碎条件的敏感性 (4) 破碎程度
适宜的操作条件应从高的产物释放率，低的 能耗和便于后步提取这二方面进行权衡
六 破碎技术研究的方向
(1)多种破碎法的结合 (2)与上游技术结合 (3)与下游操作技术结合
2.2 冷热更替法
将材料投入沸水中，维持90℃左右维持数分钟，立即 置于冰水浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。
2.3 压力差破碎法
通过压力的突然变化，使细胞破碎。 高压冲击法、突然降压法、渗透压变化法
2.4 超声波处理
用一定功率的超声波处理细胞悬液， 使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于 微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶， 常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，频 高于15～20KHz的超声波在高强度声能 输入下可以进行细胞破碎。
④根据疏水相互作用或氢键形成的引力进行分辨者， 有反相高效液相层析、分子杂交技术等。
⑤根据特异相互作用进行分辨者，有亲和层析、免疫化学分析法等。
二、经一系列不同的化学和物理方法处理，以求得差异分辨， 或按指令合成不同的高分子物质。如氨基酸序列分析和 序列合成、核苷酸序列分析和序列合成等。
三、有目的地对 DNA进行剪切拼接，引入细胞中的 （或分子克隆技术）等。
高压匀浆法的适用范围较 广，在微生物细胞和植 物细胞的大规模处理中 常采用.
1.3 研磨法
高速珠磨机研磨是常用 的一种方法，它将细 胞悬浮液与玻璃小珠、 石英砂或氧化铝等研 磨剂一起快速搅拌， 使细胞获得破碎。
在工业规模的破碎中常 采用高速珠磨机
二 物理破碎法
物理法破碎细胞主要通过各种物理因素使组织细胞破碎。
而且大容量装置声能传递，散热均有困难，应采 取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。 空化作用是细胞破坏的直接原因，同时会产生活 性氧，所以要加一些巯基保护剂。
三 化学破碎法
某些有机溶剂（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性剂、 金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或 膜的通透性从而使内合物有选择地渗透出来。
破碎机理：可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。 超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及 首种类型等因素有关。
特点：操作简单，重复性较好，节省时间； 多用于微生物和组织细胞的破碎。
存在问题：超声波破碎在实验室规模应用较普遍， 处理少量样品时操作简便，液量损失少，但是 超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性 活性物质变性失活。
用于生物化学大分子研究的独特的分析、制备技术
生物化学实验技术的主要特点是： ①操作温和，使对所研究组分的天然结构和功能的损害，
尽可能减少至最小。 ②微量分析，低达ng或pg水平；或大量分离制备，高达
公斤级。 ③分辨率高，可明确区分结构或性质极其相似的物质。
现代生物化学实验技术，按其目的和性质分为三大类。
一、按不同的物理化学性质进行分析鉴定和分离制备， 其中又可分为五类
①根据分子的大小进行分辨者，有凝胶过滤法、超速离心法、 超滤法、 SDS电泳分析等。
②根据分子荷电情况进行分辨者，有等电聚焦电泳法、 离子交换层析法等。
③根据吸收光谱和放射性等性质进行分辨者,有紫外/红外/ 荧光分光光度法、X射线结构分析法、电子顺磁共振,电子自旋 共振和核磁共振法,以及放射性核素示踪和放射免疫分析法等。
四 酶促破碎法
利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶、 半纤维素酶、脂酶等，将细胞壁分解，使细胞 内含物释放出来。
有些细菌对溶菌酶不敏感，加入少量巯基试剂或 8mol/L尿素处理后，使之转为对溶菌酶敏感而溶解。
特点： a、此法适用多种微生物； b、具有作用条件温和； c、内含物成分不易受到破坏； d、细胞壁损坏的程度可以控制
细胞壁的组成和结构
微生物细胞壁的化学组成和结构 细菌：肽聚糖的网状结构 酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质 真菌：细胞壁更厚
植物细胞壁的化学组成和结构 初生壁，次生壁 具有很高的机械强度
第一篇 生化分离技术
定义 从含有多种组分的混合物中将某种生化物质
与其他物质分离的技术
目的
细胞破碎
缩短整个下游过程的流程和提高单项操作的效率
新趋势——高效集成化
1 继续研究和完善一些适用于生化工程的新型分离技术； 2 进行各种分离技术的高效集成化。
第一章 提取与沉淀分离技术
第一节 细胞破碎
定义 采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和
2.1 反复冻溶法
原理：反复冻融过程中，由于渗透压的变化，使结合 水冻结产生组织的变性，冰片将细胞膜破碎，使蛋白质 可溶化，成为黏稠的浓溶液，但脂蛋白冻结变性。
方法：将待破碎的细胞于冷藏库或干冰反复于零下 15-20℃使之凝固，然后缓慢地融解，如此反复操作， 使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。
特点：此法适用于组织细胞，多用于动物性材料， 对微生物细胞作用较差。
作用机理：化学渗透取决于化学试剂的类型以 及细胞壁和膜的结构与组成。
特点：多用于破碎细菌，且作用比较温和； 提取核酸时，常用此法破碎细胞。
存在的问题：时间长，效率低；化学试剂毒性较强， 同时对产物也有毒害作用，进一步分离时需要用透析 等方法除去这些试剂；通用性差：某种试剂只能作用 于某些特定类型的微生物细胞。
细胞破碎技术
一 机械破碎法
通过机械运动产生的剪切力作用使细胞破碎的方法。 分为捣碎法、研磨法和匀浆法
1.1 捣碎法 利用捣碎机的高速旋转叶片产生的剪切力将组织细胞破碎。
如叶绿体的分离
常用于动物内脏、植物叶片等较脆嫩的 组织细胞； 微生物细胞破碎也可以使用
1.2 匀浆法
影响匀浆破碎的主要因素 是压力、温度和通过匀 浆器阀的次数。
存在的问题：易造成产物抑制作用，这可能是导致 胞内物质释放率低的一个重要因素。而且溶酶价格高， 限制了大规模利用。若回收溶酶，则又增加分离 纯化溶酶的操作。 另外酶溶法通用性差，不同菌种需选择不同的酶。 有一定局限性，不适宜大量的蛋白质提取，给进一步 纯化带来困难。
五 选择破碎方法的依据
(1)细胞的处理量 (2)细胞壁的强度和结构 (3)目标产物对破碎条件的敏感性 (4) 破碎程度
适宜的操作条件应从高的产物释放率，低的 能耗和便于后步提取这二方面进行权衡
六 破碎技术研究的方向
(1)多种破碎法的结合 (2)与上游技术结合 (3)与下游操作技术结合
2.2 冷热更替法
将材料投入沸水中，维持90℃左右维持数分钟，立即 置于冰水浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。
2.3 压力差破碎法
通过压力的突然变化，使细胞破碎。 高压冲击法、突然降压法、渗透压变化法
2.4 超声波处理
用一定功率的超声波处理细胞悬液， 使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于 微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶， 常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，频 高于15～20KHz的超声波在高强度声能 输入下可以进行细胞破碎。
④根据疏水相互作用或氢键形成的引力进行分辨者， 有反相高效液相层析、分子杂交技术等。
⑤根据特异相互作用进行分辨者，有亲和层析、免疫化学分析法等。
二、经一系列不同的化学和物理方法处理，以求得差异分辨， 或按指令合成不同的高分子物质。如氨基酸序列分析和 序列合成、核苷酸序列分析和序列合成等。
三、有目的地对 DNA进行剪切拼接，引入细胞中的 （或分子克隆技术）等。
高压匀浆法的适用范围较 广，在微生物细胞和植 物细胞的大规模处理中 常采用.
1.3 研磨法
高速珠磨机研磨是常用 的一种方法，它将细 胞悬浮液与玻璃小珠、 石英砂或氧化铝等研 磨剂一起快速搅拌， 使细胞获得破碎。
在工业规模的破碎中常 采用高速珠磨机
二 物理破碎法
物理法破碎细胞主要通过各种物理因素使组织细胞破碎。
而且大容量装置声能传递，散热均有困难，应采 取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。 空化作用是细胞破坏的直接原因，同时会产生活 性氧，所以要加一些巯基保护剂。
三 化学破碎法
某些有机溶剂（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性剂、 金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或 膜的通透性从而使内合物有选择地渗透出来。
破碎机理：可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。 超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及 首种类型等因素有关。
特点：操作简单，重复性较好，节省时间； 多用于微生物和组织细胞的破碎。
存在问题：超声波破碎在实验室规模应用较普遍， 处理少量样品时操作简便，液量损失少，但是 超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性 活性物质变性失活。
用于生物化学大分子研究的独特的分析、制备技术
生物化学实验技术的主要特点是： ①操作温和，使对所研究组分的天然结构和功能的损害，
尽可能减少至最小。 ②微量分析，低达ng或pg水平；或大量分离制备，高达
公斤级。 ③分辨率高，可明确区分结构或性质极其相似的物质。
现代生物化学实验技术，按其目的和性质分为三大类。
一、按不同的物理化学性质进行分析鉴定和分离制备， 其中又可分为五类
①根据分子的大小进行分辨者，有凝胶过滤法、超速离心法、 超滤法、 SDS电泳分析等。
②根据分子荷电情况进行分辨者，有等电聚焦电泳法、 离子交换层析法等。
③根据吸收光谱和放射性等性质进行分辨者,有紫外/红外/ 荧光分光光度法、X射线结构分析法、电子顺磁共振,电子自旋 共振和核磁共振法,以及放射性核素示踪和放射免疫分析法等。
四 酶促破碎法
利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶、 半纤维素酶、脂酶等，将细胞壁分解，使细胞 内含物释放出来。
有些细菌对溶菌酶不敏感，加入少量巯基试剂或 8mol/L尿素处理后，使之转为对溶菌酶敏感而溶解。
特点： a、此法适用多种微生物； b、具有作用条件温和； c、内含物成分不易受到破坏； d、细胞壁损坏的程度可以控制