液相色谱常见问题及处理方法(LC-MS)
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1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积； 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形； 3）气泡过多可使泵压力不稳甚至停止工作； 4）检测器中的气泡产生基线波动， ① 示差折光检测器——使折射率变化 ② UV检测器（200nm以下）——溶解氧气有吸收 ③ 荧光检测器——溶解氧气有荧光猝灭作用
脱气的方法
1. 超声波脱气法 2. 使用氟树脂膜的减压脱气法
六、其他问题
1. 溶剂的过滤
滤膜类型： 聚四氟乙烯滤膜： 适用于所有溶剂，酸和盐。 醋酸纤维滤膜： 不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。 尼龙66滤膜： 适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以 用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜： 蛋白吸收低，适用于水溶性样品和有机溶 剂。
19
2. 脱气： 除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡。 气泡对测定的影响：
20
使用氟树脂膜的减压脱气法
氟树脂膜
真空室
往送液泵
真空泵 流动相 控制器
21
3. 缓冲液 选择缓冲液的步骤 1、确定最佳分离状态时的流动相pH； 2、选择具有与流动相的pH相近的pKa 的缓冲液 （即使浓度稀也具有较强的缓冲能力）； 3、确认检测波长下缓冲液是否有较大的吸收； （在波长210nm附近及以下进行检测时，不能 用醋酸和柠檬酸的缓冲液） 常用弱酸的pKa
故障：堵塞
表现：管路中不断有气泡生成
措施：用5％～20％的稀硝酸，超声波清洗，
再用蒸馏水清洗 注意点：吸滤头拆下时不得将塑料管剪断
4
二、高压泵
5
1. 单向阀 单向阀结构 单向阀原理
吸液冲程
出口单向阀
排液冲程
宝石球
抛光面 泵头 透明塑料垫片 流动相
进口单向阀
6
常见故障： 故障1：宝石球粘附于垫片 表现：泵无法吸液或排液，流路不通，柱压低或没有。 措施：1）用针筒抽单向阀的出口以产生负压， 使宝石球与垫片分开 2）拆下单向阀，放入异丙醇或水中， 用超声波清洗 故障2：宝石球或塑料垫片受污导致密封不好。 表现：系统压力波动大 措施：拆下单向阀，放入异丙醇或水中，用超声波清 洗。
pK1 pK2 4.76 7.2 1 pK3 6.40 12.32
22
醋酸
柠檬酸 磷酸
4.87
3.13 2.16
13
色谱柱的维护
1. 在使用新柱之前，最好用强洗脱溶剂在低流量下 (0.20.3 ml/min)冲洗 30 min，长时间未用的分析柱也要同 样处理。 2. 定期使用强洗脱溶剂冲洗柱子。 3. 使用缓冲盐作为流动相后，要先用水（含有少量甲醇 5~10%）冲洗，再用有机溶剂（甲醇）冲洗。 4. 净化样品。 5. 分离条件优化（防止鬼峰出现）。 6. 不使用时，两头要盖上盖子，避免固定相干枯。 7. 使用预柱。 8. 避免流动相组成及极性的剧烈变化（梯度洗脱） 14 9、避免压力脉冲的剧烈变化
肩峰或分叉峰产生的原因：
1. 柱子劣化 （柱头处产生不均匀的空隙） 2. 样品变化 （生成氧化物、分解物等） 判断标准：
所有的峰都产生有肩峰或分叉时则为柱子劣化。
延长柱寿命方法：（ 更新）
1、倒（反）冲柱 2、换过滤片 3、修补柱头
15
柱的补修
填料的取出
16
恢复实例
17
五、检测器
1. 更换氘灯（紫外检测器） • 判断氘灯能量： 设定220nm波长，检查参比池能量，如能量低于 800，需更换氘灯。（详细参照说明书） • 操作注意点： 不要用手直接接触氘灯表面 2. 清洁样品池 表现：样品池和参比池能量相差较大； 检查方法：不同的仪器有具体的检查方法； 措施：用针筒注入异丙醇，清洗样品池；如污染严重， 拆开样品池，将透镜等放入异丙醇中超声波清洗。 18
故障2：载样困难 原因： 定量环堵塞 解决措施：清洗或更换定量环
11
ห้องสมุดไป่ตู้
样品过滤：
12
四、色谱柱
故障：系统压力过高、峰型变差（拖尾峰、前沿峰、 分叉峰），保留时间改变等。 解决措施：清洗、填补、更换 正相柱清洗溶剂： 正庚烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇等 反相柱清洗溶剂：： 甲醇、乙腈、氯仿、异丙醇、0.05mol/L稀硫酸 注意：应排除操作不当引起的假象。
7
2. 柱塞密封圈
密封圈
故障：密封圈磨损而导致 密封不良 现象：系统压力波动大或
柱塞杆
漏夜
措施：更换密封圈
泵头清洗管路 流动相
注意点：更换密封圈拆卸 泵头前，柱塞杆复位 （P－SET）
8
三、手动进样阀
9
1. 构造及使用原理
10
2. 常见故障
故障1：转子密封损坏 现象：漏液 原因： a 拧的太紧 b 样品太脏（过滤不充分） c 针头损坏或未使用液相色谱专用注射器 解决措施：更换转子密封，并在使用时注意保养。
1. 高效液相色谱分析方法的建立 2. 高效液相色谱仪常见问题及处理方法 3. 制备型高效液相色谱技术 4. 高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）
1
高效液相色谱仪常见问题 及处理方法
2
泵系统
线路过滤器
单向阀 柱塞密封圈
检测器 手动/自动进样器
吸滤头
3
一、吸滤头
材料：不锈钢烧结，孔径10μm
脱气的方法
1. 超声波脱气法 2. 使用氟树脂膜的减压脱气法
六、其他问题
1. 溶剂的过滤
滤膜类型： 聚四氟乙烯滤膜： 适用于所有溶剂，酸和盐。 醋酸纤维滤膜： 不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。 尼龙66滤膜： 适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以 用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜： 蛋白吸收低，适用于水溶性样品和有机溶 剂。
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2. 脱气： 除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡。 气泡对测定的影响：
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使用氟树脂膜的减压脱气法
氟树脂膜
真空室
往送液泵
真空泵 流动相 控制器
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3. 缓冲液 选择缓冲液的步骤 1、确定最佳分离状态时的流动相pH； 2、选择具有与流动相的pH相近的pKa 的缓冲液 （即使浓度稀也具有较强的缓冲能力）； 3、确认检测波长下缓冲液是否有较大的吸收； （在波长210nm附近及以下进行检测时，不能 用醋酸和柠檬酸的缓冲液） 常用弱酸的pKa
故障：堵塞
表现：管路中不断有气泡生成
措施：用5％～20％的稀硝酸，超声波清洗，
再用蒸馏水清洗 注意点：吸滤头拆下时不得将塑料管剪断
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二、高压泵
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1. 单向阀 单向阀结构 单向阀原理
吸液冲程
出口单向阀
排液冲程
宝石球
抛光面 泵头 透明塑料垫片 流动相
进口单向阀
6
常见故障： 故障1：宝石球粘附于垫片 表现：泵无法吸液或排液，流路不通，柱压低或没有。 措施：1）用针筒抽单向阀的出口以产生负压， 使宝石球与垫片分开 2）拆下单向阀，放入异丙醇或水中， 用超声波清洗 故障2：宝石球或塑料垫片受污导致密封不好。 表现：系统压力波动大 措施：拆下单向阀，放入异丙醇或水中，用超声波清 洗。
pK1 pK2 4.76 7.2 1 pK3 6.40 12.32
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醋酸
柠檬酸 磷酸
4.87
3.13 2.16
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色谱柱的维护
1. 在使用新柱之前，最好用强洗脱溶剂在低流量下 (0.20.3 ml/min)冲洗 30 min，长时间未用的分析柱也要同 样处理。 2. 定期使用强洗脱溶剂冲洗柱子。 3. 使用缓冲盐作为流动相后，要先用水（含有少量甲醇 5~10%）冲洗，再用有机溶剂（甲醇）冲洗。 4. 净化样品。 5. 分离条件优化（防止鬼峰出现）。 6. 不使用时，两头要盖上盖子，避免固定相干枯。 7. 使用预柱。 8. 避免流动相组成及极性的剧烈变化（梯度洗脱） 14 9、避免压力脉冲的剧烈变化
肩峰或分叉峰产生的原因：
1. 柱子劣化 （柱头处产生不均匀的空隙） 2. 样品变化 （生成氧化物、分解物等） 判断标准：
所有的峰都产生有肩峰或分叉时则为柱子劣化。
延长柱寿命方法：（ 更新）
1、倒（反）冲柱 2、换过滤片 3、修补柱头
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柱的补修
填料的取出
16
恢复实例
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五、检测器
1. 更换氘灯（紫外检测器） • 判断氘灯能量： 设定220nm波长，检查参比池能量，如能量低于 800，需更换氘灯。（详细参照说明书） • 操作注意点： 不要用手直接接触氘灯表面 2. 清洁样品池 表现：样品池和参比池能量相差较大； 检查方法：不同的仪器有具体的检查方法； 措施：用针筒注入异丙醇，清洗样品池；如污染严重， 拆开样品池，将透镜等放入异丙醇中超声波清洗。 18
故障2：载样困难 原因： 定量环堵塞 解决措施：清洗或更换定量环
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ห้องสมุดไป่ตู้
样品过滤：
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四、色谱柱
故障：系统压力过高、峰型变差（拖尾峰、前沿峰、 分叉峰），保留时间改变等。 解决措施：清洗、填补、更换 正相柱清洗溶剂： 正庚烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇等 反相柱清洗溶剂：： 甲醇、乙腈、氯仿、异丙醇、0.05mol/L稀硫酸 注意：应排除操作不当引起的假象。
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2. 柱塞密封圈
密封圈
故障：密封圈磨损而导致 密封不良 现象：系统压力波动大或
柱塞杆
漏夜
措施：更换密封圈
泵头清洗管路 流动相
注意点：更换密封圈拆卸 泵头前，柱塞杆复位 （P－SET）
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三、手动进样阀
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1. 构造及使用原理
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2. 常见故障
故障1：转子密封损坏 现象：漏液 原因： a 拧的太紧 b 样品太脏（过滤不充分） c 针头损坏或未使用液相色谱专用注射器 解决措施：更换转子密封，并在使用时注意保养。
1. 高效液相色谱分析方法的建立 2. 高效液相色谱仪常见问题及处理方法 3. 制备型高效液相色谱技术 4. 高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）
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高效液相色谱仪常见问题 及处理方法
2
泵系统
线路过滤器
单向阀 柱塞密封圈
检测器 手动/自动进样器
吸滤头
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一、吸滤头
材料：不锈钢烧结，孔径10μm