PCR的原理与应用

第二章PCR技术的原理及应用

故事发生在1983年的春夏之交

很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖，Mullis是其中之一

Kary B. Mullis (1944 -)，

在Cetus 公司工作期间，

发明了PCR。他原本是

要合成DNA引物来进行

测序工作，却常为没有

足够多的模板DNA而烦

恼。1983年春夏之交的

一个晚上，他开车去乡

下别墅的路上萌发了用

两个引物（而不是一个

引物）去扩增模板DNA

的想法…...

Mullis 开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA 的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA 聚合酶，面对面地合成着DNA ，……

Mullis的第一个PCR实验•1983年9月中旬。

Mullis在反应体系中加

入DNA聚合酶后在37

℃一直保温。结果第二

天在琼脂糖电泳上没有

看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。

第一种高温菌DNA聚合酶的分离

美国黄石国家公园

Thermus aquaticus

•Taq

•Not permanently destroyed at 94ºC •Optimal

temperature is 72ºC

耐高温DNA聚合酶的种类•Taq DNA聚合酶(Thermus aquaticus，Cetus/Roche)•Tth DNA聚合酶(Thermus thermophilus，Toyobo)•Pfu DNA聚合酶（Pyrococcus furiosus，Stratagene）Deep Vent DNA聚合酶(Bio-labs）

•Tfl DNA聚合酶（Thermus flavus，Promega)•Tli DNA聚合酶(Thermococcus litoralis，Promega) Vent DNA聚合酶(Bio-labs）

•Pwo DNA聚合酶( Pyrococcus woesei，Roche)•Pfx DNA聚合酶(Thermococcus kodakaraensis, Invitrogen)•Dyna zyme DNA聚合酶（Thermus brockianus，Finnazyme）•FD DNA聚合酶(Thermus sterophilus？，复旦大学)•Tma, Tne, KOD, ……

PCR仪器的变迁

•三个水浴锅，用手移动（Mullis等人当时用的）•电加热块＋自来水冷却（PE，1988）•电加热块＋内置循环液冷却（PE，1989）•三个加热块＋机械手（Stratagene，1994）•半导体制冷和加热（MJ, PE, BioMetra, Eppendrof）•温度梯度, 荧光检测(如Roche的Lightcycler)

•风加热

•Lab-on-chip式的PCR仪(所谓的芯片PCR)

中国的状况

•1991年出现三个水浴锅+机械手的原始PCR仪（华美，复日等）•现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈, 厦门安普利等）

PCR的发展史

•1983年春，Mullis发展出PCR的概念；

•1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环；

•1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断；

•1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒；•1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202），这回Mullis是第一发明人。

•1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法；

•1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，Taq DNA polymerase，这是85年春天Mullis建议做的；

•1988年，第一台PCR仪问世；

•1991年，Hoffman LaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。

PCR不只是一个方法改进•Mullis的上司有句“名言”，“我们要扩增这么多DNA样品有什么用”；•到了1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关专利转让给瑞士Hoffman LaRoche公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红；•Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远。

PCR相关的术语和产品层出不穷

•T-vector •HotStart Taq •RT-PCR •RAPD-PCR •DDRT-PCR •LM-PCR •Inverse PCR •Nested PCR •Real-time PCR •RACE

•Flow chip PCR •TAS

•Multiplex PCR •Immuno PCR •Asymmetric PCR •LP-PCR

•NASBA •Recombinant PCR •AFLP

•SSCP

•In situ PCR •TaqMan/SYBR green

1st cycle2nd cycle3rd cycle

过程

变性

引物退火

DNA 复制（一）PCR的基本原理

（二）PCR的种类1.普通PCR

PCR

琼脂糖凝胶电泳

最终产物紫外光观察

3-4 小时