PCR技术原理

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引物
• 引物是PCR特异性反应的关键
• PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA互补的程度
• 理论上，只要知道任何一段模板DNA序 列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做
引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大
量扩增
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引物设计的原则（一）
①引物长度： 15-30bp，常用为20mer左右
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百度文库11
PCR技术总论
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聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称 ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ 片段的分子生物学技术。
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聚合酶链式反应也可以当作一项极其重要的酶促合成 DNA技术。PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体 外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新，它 可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。
70年代初，Kleppe等人就提出了PCR的工作原理。Saiki （1985）和Mullis（1986）两家研究室分别用改进的Kleppe 法获得了大量染色体DNA单拷贝基因。当时的PCR技术须在 每次变性和退火后，扩增反应前重新加入DNA聚合酶。1988 年，由于在PCR系统引入了热稳定的TaqDNA聚合酶，这是从 水生栖热菌（Thermusaquaticus）中提取的耐热DNA聚合酶， 简称Taq DNA聚合酶。多次循环后的Taq DNA聚合酶仍然具 有活性，因此反应体系自动往复多次地进行对所需的DNA的 片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，所以命名为聚合酶 链式反应。
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PCR基本原理
PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性 体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性 (Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种 寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键 配对;(3) 延伸(Extension): DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶 的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保 留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复 循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而 且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。 到达 平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 。
PCR原理
变性与复性
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DNA的变性(denaturation)：
在某些理化因素作用下，DNA 分子内碱基对之间的氢键断裂，使 规则有序的双螺旋结构变为不规则 无序的单链线团样结构的过程。
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解链温度（融解温度，Tm） (melting temperature)：
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PCR原理
Sample denaturatation Primer annealing Primer extension
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PCR product
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PCR反应曲线
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标准的PCR反应体系
• 10×扩增缓冲液 4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点
– 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶 切分析或分子克隆很有好处
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引物设计的原则（三）
⑦引物的特异性：
– 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同 源性
热变性的DNA经缓慢冷却后即可复 性，此过程称为退火(annealing)。
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减色效应：
变性DNA复性后 对260nm紫外光 吸收减少的现象。
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1. 常用的变性方法： ① 热变性 ② 酸碱变性 ③ 化学试剂变性
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2. 影响复性的因素 ① 序列简单的分子复性快，如poly(dT)和poly(dA)
– 引物的有效长度不能大于 38 mer，否则最适延伸 温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃）， 不能保证PCR扩增产物的特异性
②引物扩增跨度：以500bp为宜
– 特定条件下可扩增长至10kb的片段
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜
– G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异 条带
识别快
② DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢
③ 离子强度↑→有利于复性 ④ DNA浓度↑→复性↑
Tm值的估算
① <20bp Tm=4（G+C）+2（A+T）
② >20bp Tm=69.3+0.41(G+C)%
③
Tm=81.5℃+16.6lgM+0.41（G+C）%
-500/n-0.61×（甲酰胺%）
使50%的DNA发生变性时的环 境温度。
DNA的变性从开始解链到完全 解链是在一个相当窄的温度内完成 的。
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增色效应：
DNA变性后对 260nm紫外光收 增加的现象。
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DNA的复性（renaturation)：
在适当条件下，变性DNA的两条 互补链可再恢复成天然的双螺旋结 构的过程。
– ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶
核苷酸的成串排列 可编辑ppt
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引物设计的原则（二）
④避免引物内部出现二级结构
– 避免两条引物间互补， 特别是 3’端的互补，否 则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带
⑤引物 3’端的碱基要求严格配对
– 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端 碱基不配对而导致PCR失败
10ul 各200umol/L 10～100pmol 0.1～2ug
2.5u
Mg2+ 加双或三蒸水至
1.5mmol/L 100ul
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PCR反应五要素
• 引物（primer） • 酶 （Taq DNA polymerase） • dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） • 模板 （template） • Mg2+ （magnesium）