补肾活血方的研究

引言

骨性关节炎是中老年人的常见疾患，主要病理特征是关节软骨的退变。关节软骨退变的原因尽管是多方面的，但软骨细胞的结构破坏和功能丧失在其中起着至关重要的作用。采取有效方法保护软骨细胞的结构、调节软骨细胞的功能是防止软骨退变的关键措施，是治疗骨性关节炎有效手段。采用体外细胞培养结合体内试验技术研究中草药防治骨性关节炎是目前研究的热点。中药补肾活血方在既往的骨性关节炎治疗中取得良好的效果，能减轻骨性关节炎的临床症状，改善关节功能，为了探讨其作用机制，本实验采用软骨细胞培养技术观察其对软骨细胞的增殖和细胞总蛋白合成的影响，从细胞分子水平研究中药补肾活血方防治骨性关节炎的作用机制，为提高中药补肾活血方的疗效提供理论依据，为中草药治疗骨性关节炎的深入研究积累一些经验。

1 材料和仪器

1.1 主要试剂

胎牛血清，1640培养液等

1.2.主要仪器

注释倒置显微镜 (Olympus),CO₂培养箱,细胞培养板 (Gibeo),723型分光光度计,ELxsos酶标仪 (美国Bio一Tek 公司 )等

2 实验方法

2.1 药物制备及分组

2.1药物制备

补肾活血方由枸杞20g、杜仲24g、鸡血藤24g、炙甘草12g、山茱萸18g、附子24g、肉桂8g、川芎10g、山药30g、熟地24g(浙江中医药大学提供)按处方比例称取药味，加入8倍量水，回流提取1.5小时；取出药液加入8倍量的95％乙醇，回流提取1.5小时。然后将一部分醇提部分和水提部分分别浓缩，得到相应的流浸膏，另一部分醇提水提药液合并浓缩，得到相应的流浸膏，一起放入60℃烘箱里面烘干至干燥粉末。

2.2 成骨细胞的分离与培养

取出生24h内的SD大鼠(由浙江中医药大学实验动物中心提供)的颅骨,彻底剥离骨

膜等软组织,置入含DMEM培养液的培养皿中修剪成1mm x lmm x lmm的骨片。加入0.1 % I型胶原酶在37℃环境下振荡消化60min,再加入等体积的胎牛血清终止消化。收集消化液,在4℃,1000 r/min条件下离心10min使细胞沉淀。沉淀细胞放置于含15%胎牛血清DMEM培养基的培养皿内。并以约2x10^4 一5xl0^4/em的密度接种于培养瓶中,放入37℃,5%CO₂培养箱内培养,每2一3d换液一次。待细胞长满后进行传代,使用第3代细胞进行实验。

2.3观察指标的测定与造模

2.3.1细胞增殖功能测定：成骨细胞以每孔5xl0^3个细胞的密度接种于96孔培养板中,每孔加入含15%胎牛血清的培养基,在37℃,5%CO₂条件下培养。不同浓度的补肾活血方的DMEM培养基分别培养24h、48h、72h。采用MTT法,分别于570nm，630nm波长测光吸收值(A),在酶标仪上进行测试。

2.3.2造模：取40只小鼠，按照以往我们建立股骨头坏死的模型的经验，参考文献的方法，采用3月龄的小鼠，各组用内毒素20μg/kg两次注射，间隔24h后，甲强龙40mg/kg连续注射三次，每次间隔24h。选择双侧股骨头周围肌肉进行注射。（1）空白组—未作任何处理，20只（10只不灌胃，10只灌生理盐水）

（2）模型治疗组—造模/补肾活血方灌胃，30只（10只不灌胃，10只灌生理盐水，10只灌补肾活血方）

3 分析与讨论

实验根据“肾主骨”、“肝肾同源”的原理选用补肾活血方。方中熟地为补血要药,可补血活血，全方以活血祛痕为主,又兼补益肝肾。为临床上有效治疗骨质疏松症的一种传统中药方。

实验在细胞水平观察了补肾活血方对成骨细胞的直接作用,说明其治疗骨质疏松的作用机制与其促进成骨细胞的增殖、分化的作用有关,为补肾活血方临床应用提供了理论和实验依据。

实验的难点在于，细胞水平不以调控，易污染导致实验出现非人为因素影响的失败，并且在动物身上造模可能因为个体差异而出现的一些不确定因素，而影响实验结果。

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