基因工程的基本操作程序

1、原核细胞的基因结构
非编码区 编码区上游
启动子
编码区
与RNA聚合酶结合位点
非编码区
编码区下游 终止子
RNA聚合酶:能够识别启动子上结合位点的一种 蛋白质.
RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点， 并与其结合。
转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并 以DNA分子的一条链为模板合成RNA。
1.2 基因工程的基本操作程序
基因工程基本操作的四个步骤 1、目的基因的获取
2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞
4、目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
请阅读P9第一和二两段
(一)、目的基因主要是_编__码__蛋__白__质__的__结__构__基__因___ 请举出三个以上的例子
练习
5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计
施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行
碱基互补配对的步骤是
（C ）
A、人工合成目的基因
B、目的基因与运载体结合
C、将目的基因导入受体细胞
D、目的基因的检测和表达
(四)目的基因的检测与鉴定
——检查是否成功
检测—
①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 方法—— DNA分子杂交
1、原核细胞的基因结构
非编码区 编码区上游
启动子
编码区
非编码区
编码区下游 终止子
与RNA聚合酶结合位点
启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断， 它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能 驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质
终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断， 能终止mRNA的转录
① 概念：PCR全称为_聚__合__酶__链__式__反__应__，是一项 在生物_体__外_复制_特__定__D_N_A_片__段_的核酸合成技术
②原理：_D_N_A_复__制____
③条件：_已__知__基__因__的__核__苷__酸__序__列____、 _四__种__脱__氧__核__苷__酸__、__一__对__引__物___ 、
了耐盐水稻新品系。
（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所
用的限制性内切酶作用于图中的 处，
DNA连接酶作用于
处。（填“a”或
“b”）
练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增
加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备
受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐
水稻新品系。
（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方
——显微注射法
将目的基因导入 微生物细胞
——感受态细胞
1、将目的基因导入植物细胞的方法： （1）农杆菌转化法 ①农杆菌特点：
易感染双子叶植物和裸子植物，对大多 数单子叶植物没有感染能力
②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转 移到受体细胞，并整合到受体细胞染 色体的DNA上。
③过程：
④优点
（2）基因枪法 （3）花粉管通道法
C、具有标记基因
D、它是环状DNA
练习
3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ A ）
A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶
练习
4）有关基因工程的叙述正确的是 （ D ）
A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供 资料
标记基因的作用是为了鉴别 受体细胞中是否含有目的基 因，从而将有目的基因的细
三将目的基因导入受体细胞
（一）转化：目受的体基细因 胞进 内入 维持_受_稳__体__定__细____胞和___内表_，_达_并_的且过在程
（二）方法
将目的基因导入 植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
将目的基因导入 动物细胞
2. 构建基因表达载体
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3. 将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法、显微注射法
4. 目的基因的检测与鉴定
检测：是否插入、转录、翻译 鉴定：
练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，
增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利
用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出
（2）.基因文库的构建方法
①基因组文库的构建
通过对受 体菌的培 养而储存 基因
② cDNA文库的构 建-----反转录法：
以目的基因转 录成的信使RNA为 模板，反转录成互 补的单链DNA，然 后在酶的作用下合 成双链DNA，从而 获得所需的基因。
目的基因的mRNA
反转录酶
单链DNA
DNA聚合 双链DNA酶 (目的基因)
（二）、获取目的基因的常用方法有哪些? 1、从基因文库中获取 2、利用PCR技术扩增 3、人工合成
1、从基因文库中获取目的基因
（1）.基因文库
将含有某种生物不同基因的许多 DNA片断，导入到受体菌的群体中， 各个受体菌分别含有这种生物的不同 基因，称为基因文库
基因文库
基因组文库
部分基因文库 （如:cDNA文库）
所需物质：
它们各自 的作用是 什么?
2、基因表达载体的组成：
复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因
它们各自 的作用是 什么?
启动子：位于基因的首端的 一段特殊的DNA片断，它 是RNA聚合酶识别和结合的 部位，有了它才能驱动基因 转录出mRNA，最终获得蛋 白质
终止子：位于基因的尾端的 一段特殊的DNA片断，能 终止mRNA的转录
——检查是否成功
（一）、检测 1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入 了目的基因
（1）方法: DNA分子杂交 （2）过程:
①.首先取出转基因生物的基因组DNA
②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素 等作标记,以此做探针
③.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显 示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中
练习
பைடு நூலகம்
1）以下说法正确的是
（C ）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷 酸序列
B、质粒是基因工程中唯一的运载体
C、运载体必须具备的条件之一是：具有多 个限制酶切点，以便与外源基因连接
D、基因控制的性状都能在后代表现出来
练习
2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是
A、能复制
（ D）
B、有多个限制酶切点
③基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较
怎样从基因文库中得 到我们所需的目的基 因呢?
④从基因文库中得到目的基因的方 法
依据：目的基因的有关信息。 如：根据基因的核苷酸序列
基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性
2、利用PCR技术扩增目的基因
归纳步骤
DNA分子杂交示意图
采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分 子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补 的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合 在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序 列的部位，仍然是两条游离的单链。
P15思考与探究
2、检测目的基因是否转录出了mRNA
①方法: 分 子 杂 交
法有农杆菌转化法和 法。
（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要
利用
技术，该技术的核心是
和
。
（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既
要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交
检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株
的耐盐性。
答案：（1）a a （2）基因枪 法（花粉管通道法） （3）植物组织培养（1分） 脱分化 （去分化） 再分化 （4）耐盐基因（目的基因） 一定 浓度盐水浇灌（移栽到盐碱地中）
c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下， 合成与模板互补的_D_N_A_链____。
3、人工合成法：
基因较小，核苷酸序列已知，可以 利用DNA合成仪人工合成
二、基因表达载体的构建
——基因工程的核心
1、目的：
使目的基因在受体细胞中稳定存在， 并且可以遗传给下一代，同时使目的 基因能够表达和发挥作用。
转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚 合酶也从DNA模板链上脱落下来。
非编码区 编码区上游
启动子
编码区
非编码区
编码区下游 终止子
原核 细胞 的 基因 结构
编码区 ：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质
①不能转录为信使RNA，不能 非编码区 编码蛋白质。
②有调控遗传信息表达的核 苷酸序列.包括启动子和终止子
②检测目的基因是否转录出了mRNA 方法—— 分子杂交（注意与上不同之处）
③检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法—— 抗原抗体杂交
鉴定—— 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
非编码序列：包括非编码区和内含子
3、原核细胞与真核细胞的基因结构比较
不同点 相同点
原核细胞
真核细胞
编码区是
连__续___的
编码区是间隔的、
_不__连__续的
都由能够编码蛋白质的_编__码__区_和具有 调控作用的非__编___码_区组成的
思 考 编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核
细胞与真核细胞基因结构一样长吗？
2、真核细胞的基因结构
非编码区
编码区上游
启动子 与RNA聚合酶 结合位点
编码区
外显子 内含子
非编码区
编码区下游
终止子
外显子： 能够编码蛋白质的序列叫做外显子
内含子： 不能够编码蛋白质的序列叫做内 含子
真核 细胞 的 基因 结构
外显子：能编码蛋白质的序列 编码区
内含子：不能编码蛋白质的序列
非编码区：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点（启动子）。
__D_N_A_聚__合__酶__.前提条件：
④方式：以_指__数__方式扩增，即__2_n_（n为扩增循 环的次数）
⑤结果： 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
⑥过程：
a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 在热作用下，_氢__键__断裂，形成__单__链__D_N_A___
b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部___双__链___。
②过程: 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若 出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA
3、检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法: 抗原抗体杂交
（二）、鉴定（个体生物学水平） 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
归纳步骤
归纳: 基因工程的基本操作程序
1. 获取目的基因
从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成
2、将目的基因导入动物细胞
①方法：显微注射法
②程序：
目的基因表达载体提纯
显微注射
受精卵
取卵（受精卵） 新性状动物
3、将目的基因导入微生物细胞
①原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少 ②方法：
用Ca2+处理细胞 感受态细胞
表
达载体与感受态细胞混合
感受态
细胞吸收DNA分子
四、目的基因的检测与鉴定