聚谷氨酸的检测方法

聚谷氨酸测试方法

1.0 适用范围：本方法适用于聚谷氨酸半成品及成品的 HPLC 纯度分析(第4 段、第 5 段中，蓝字为食品级及化妆品级 PGA纯品粉末的样品制备方法;红字为 PGA发酵液的样品制备方法)

2.0 仪器与设备：

2.1 Pump：SHIMADZU LC-10AT

2.2 Autosampler：PERKIN ELMER series 200 autosampler

2.3 Col umn ：TOSOH TSK Guard column

TOSOH TSK-GEL G6000PWXL

TOSOH TSK-GEL G3000SW

2.4 Detector：PERKIN ELMER 785A UV/VIS Detector

3.0 试剂的制备

3.1 0.05M Na2HPO4(disodium hydrogenophosphate , MW. 141.96g/mol)

称取Na2HPO47.1g ，加入去离水800mL溶解，最后以去离水定容至1L 。

3.2 0.05M NaH2PO4•H2O (Sodium dihydrogenophosphate monohydrate, MW.137.99g/mol)

称取NaH2PO4•H2O 6.9g，加入去离水800mL 溶解，最后以去离水定容至1L。

3.3 磷酸缓冲溶液，pH7.0

将0.05M Na2HPO4与0.05M NaH2PO4•H2O 以约10：7 的比例混合，微调至pH7.0，以0.45μm滤膜过滤。

4.0 PGA样品前处理

4.1 称取PGA样品0.04-0.05g置入50mL烧杯中。

4.2 加入40mL的0.05M Na2HPO4溶液。

4.3 利用磁石搅拌使样品完全溶解。

4.4 移入50mL定量瓶，以0.05M Na2HPO4溶液定容至50mL。

4.5 以0.45μm滤膜过滤，装入样品瓶中。

4.6 将样品放入HPLC 分析。

5.0 发酵液样品前处理

5.1 称取发酵液2 g置入100mL 烧杯中，加入去离子水80mL，利用磁石搅拌均匀。

5.2 以1N H2SO4调整pH4.0。

5.3 移入100mL定量瓶，以去离子水定容至100mL。

5.4 取离心管秤取样品约80g（重量包含离心管、盖、标签、样品）。

5.5 利用高速离心机将菌体及杂质分离。离心条件为：转速12,000rpm，时间10min，温度控制在4℃下。

5.6 离心后取上层液，以0.45μm滤膜过滤后，装入样品瓶中。

5.7 将样品放入HPLC 分析。

6.0 标准品配制

6.1 称取PGA标准品1g，加入0.05M Na2HPO4溶解，最后定

容至100mL，作为PGA标准稀释溶液，浓度为10000μg/mL。

6.2 取 5 只50mL 定量瓶，分别加入PGA标准稀释溶液(10000μg/mL) 1、2、3、4、5mL，以0.05M Na2HPO4定容至50mL，其各点浓度分别为200、400、600、800、1000μg/mL。(分装储存于-20℃，使用时取出解冻，分析完后丢弃)

6.3 分别以0.45μm滤膜过滤，装入样品瓶中，待上机分析。

7.0 HPLC 分析条件

Column ：TOSOH TSK Guard column

TOSOH TSK-GEL G6000PWXL

TOSOH TSK-GEL G3000SW

Mobile phase ：磷酸缓衝溶液，pH7.0

Flow ：0.5mL/min

Detector ：UV220 nm

7.1标准品与样品分别以Autosampler取20μl注入HPLC作定性定量分析。

7.2 另作空白组，操作步骤同检液。

7.3 以波峰面积为纵座标，γ-PGA-H标准品的含量为横座标，绘制标准曲线，并建立线性回归方程式。

7.4 将样品的波峰面积数值，代入标准品线性回归方程式中，求得γ-PGA样品溶液的浓度，再带入计算公式，换算γ-PGA纯度。8.0 计算

γ-PGA 样品溶液的浓度以回归方程计算y = ax + b

x ＝(y－b) / a

a：斜率

b：截距

y：样品的波峰面积

x：样品的浓度,μg/mL

γ-PGA的纯度(%) = ×100 =（C樣× D.F）/W ×100

C 样：样品的浓度(μg/mL)

D.F：样品的稀释倍数

W ：称取样品重量, μg

作为拌种剂使用一般稀释5-10倍拌种。