免疫学检测中干扰因素
ELISA检测的干扰因素与方法
ELISA检测的干扰因素与方法ELISA应用最广，但这种固相测定技术非完美无缺，把握实验过程中每一个可能出现差错的关键性问题，采取相应的举措，才有可能使实验性误(漏)诊减少到最低限度。
1. 表面效应首先必须明确指出的是，：“固相”ELISA与传统的“液相”血清学试验的最大.最本质的区别是有一个预先固相抗原或抗体到载体表面的步骤，以及抗原与抗体结合反应由液态环境移到了固相载体表面进行。
蛋白质分子在吸附过程中，为了克服与固相载体之间的排斥力，需要重新分布其表面的功能性基因，使疏水性基因充分暴露，然后，局部接触区域的偶极分子脱氢，再通过范德瓦尔斯力吸引而固相到载体表面。
表面效应可直接影响抗原，抗体的构象和功能。
此外，表面效应亦影响抗原和抗体结合反应的动力学过程。
(1)固相导致抗原的变化为了测定抗体水平，需预先将抗原固相(包被)到极性和水性的聚苯乙烯(PS)或聚氯乙烯(PVC)酶标板上。
用直接物理吸附方法固相蛋白抗原及DNA等，导致的变化是多方面的，可引起分子构象和抗原性发生改变。
酶活性测定时可消失。
牛血清白蛋白固相之后，其抗原价可由5价降为1价。
此外，发现被动吸附方法固相铁蛋白，呈团串状，不均一的随机分布，这种影响质控的情况具有普遍性。
最后，大多数小分子半抗原不易直接吸附到载体表面。
解决这一难题的方法，一般是采用在小分子抗原上，先偶联上葡聚糖，明胶等手臂后再进行固相包被。
对于有多重表达抗原决定簇的大分子抗原，用抗体桥式包被法可避免表面效应的影响。
将蛋白抗原吸附于胶体AI(OH)3后再固相也可以避免蛋白变性。
用Y射线辐照(400GY)PS板，不但可增加蛋白抗原吸附能力，而且还有降低抗体测定本底的作用。
(2)固相对抗体的影响直接吸附固相抗体(Igs)分子，除了呈团串状，不均分布和易解吸等一般不利因素之外，Igs分子摊开在载体表面，不但构象发生改变，而且影响抗体的活性，如IgG的结合价减少，可由2价变为1价，甚至完全失活。
“CK-MB”测定的“干扰”现象及原因分析
“CK－MB”测定的干扰现象及实验对策湖北省兴山县人民医院彭兰张娥、万芳、邹志宝443711【摘要】目的：探讨“CK－MB”升高的干扰原因及实验对策。
方法：采用免疫抑制法测定“CK－MB”，采用酶偶联速率法测定总CK活性。
结果，10名健康献血员、56名本院心内科人、15名本院收治的恶性肿瘤病人三组人员同时检测“CK－MB”及总CK活力；在正常献血员中有一例CK－MB值异常升高，达总活性的61%；在56例心内科病人血清中CK－MB单项升高16例，总CK单项升高33例，二项指标同时升高28例；在15例恶性肿瘤患者血清中CK －MB单项升高7例，总活性升高2例，二项同时升高1例。
结论：采用免疫抑制法CK－MB作为心肌梗塞诊断指标的特异性仍须探讨，实验存在较多的干扰因素，且CK－MB结果升高与恶性肿瘤有密切关系。
【关键词】：CK－MB 总CK 干扰用免疫抑制法检测血清CK-MB活性,观察其活力单位及与CK 的比值关系作为诊断急性心肌梗死的相对特异性指标、预测冠状动脉再通的治疗效果和观察病情变化等,已被临床广泛应用。
一般情况下正常人CK-MB主要存在于人体心肌细胞内,血清中CK的存在形式主要是CK-MM,只有少量CK-MB,不超过总活性的5%,心肌梗死发生时最高值也不超过38%。
但在日常检测工作中经常发现临床血清标本中CK-MB检测值与理论值不符合,最多见的就是CK-MB检测值大于总CK检测值的现象。
现就肌酸激酶及其同工酶的组成、临床意义和检测的方法学等方面简要分析其原因并就解决方法提出建议。
CK－MB存在于心肌细胞胞浆中，CK－MB作为诊断急性心肌梗塞或心肌坏死的特异时指标，在心肌坏死症状发作4－5小时达正常上限，12－24小时达高峰，72小时逐步恢复。
基层实验室多采用免疫抑制法测定CK－MB，对不同病程的心肌病提供较特异诊断，本室通过三组不同人群的CK－MB测验结果发现，采用免疫抑制法测定CK－MB指标有假性增高现象，与临床体征明显不符，现先从实验原理探讨；免疫抑制法测定CK－MB是用抗体将M亚基抑制，测定B亚基，结果乘以2即为CK－MB活性，当血清中出现文献报道中的巨CK或CK－BB及其它成份时，由于它们不受抗M亚基抗体抑制，其活性已完全测出，再乘以系数2,就可能出现CK－MB升高或高于总CK的现象，造成CK－MB结果失真，本室从1999.9-2000.5共收集71份血清测定CK－MB及总CK活性，现将实验中出现的异常结果提出探讨。
病原免疫学干扰现象名词解释
病原免疫学干扰现象名词解释
干扰现象名词解释：两种病毒同时感染一种宿主细胞时，常发生一种病毒抑制另一种病毒的现象。
病毒间干扰的机制概括起来包括：病毒作用于宿主细胞，诱导产生干扰素。
除干扰素外，还有其它因素也能干扰病毒的增殖，如：第一种病毒占据或破坏了宿主细胞的表面受体或者改变了宿主细胞的
代谢途径因而阻止另一种病毒的吸附或穿入，如粘病毒等。
另外，也可能是阻止第二种mRNA的转译，如脊髓灰质炎病毒干
扰水泡性口炎病毒；还有可能是在复制过程中产生了缺陷性干扰颗粒，能干扰同种的正常病毒在细胞内复制，如流感病毒在鸡胚尿囊液中连续传代，则DIP逐渐增加而发生自身干扰。
免疫透射比浊法常见干扰因素的识别与应对策略
作者简介：贾珂珂，女，1976年生，硕士，副主任技师，主要从事临床生化检验工作。
通信作者：崔丽艳，E-mail ：。
免疫透射比浊法常见干扰因素的识别与应对策略贾珂珂， 孙文苑， 聂 睿， 崔丽艳（北京大学第三医院检验科，北京 100191）摘要：免疫透射比浊法检测结果的准确性常受到一些干扰因素的影响，如样本性状、内源性干扰、钩状效应和携带污染等，这些干扰因素可使检测结果假性升高或降低，影响临床诊断和治疗监测等。
文章对免疫透射比浊法常见的干扰因素及机制进行综述，以帮助检验人员识别和确认可能存在的干扰，及时纠正检测结果，尽可能减少不良后果的发生。
关键词：免疫透射比浊法；样本性状；内源性干扰；钩状效应；携带污染；干扰Detection and prevention of common interference in turbidimetric immunoassay JIA Keke ，SUN Wenyuan ，NIE Rui ，CUI Liyan.（Department of Clinical Laboratory ，Peking University Third Hospital ，Beijing 100191，China ）Abstract ：The accuracy of turbidimetric immunoassay is affected by a few interference factors ，such as sample appearance ，endogenous interference ，hook effect and carry-over contamination. These interference factors may cause the results increasing or decreasing falsely and further affect clinical diagnosis and treatment monitoring. The laboratory staff should be familiar with common interference factors and mechanisms ，communicate with doctors in time and identify ，confirm and prevent possible interference ，in order to reduce the occurrence of adverse events.Key words ：Turbidimetric immunoassay ；Sample appearance ；Endogenous interference ；Hook effect ；Carry-over contamination ；Interference文章编号：1673-8640（2021）04-0362-07 中图分类号：R446.1 文献标志码：A DOI ：10.3969/j.issn.1673-8640.2021.04.002免疫比浊法是将液相内的沉淀反应与现代光学仪器和自动分析技术相结合的一种分析技术，常用方法为免疫散射比浊法和免疫透射比浊法。
免疫学检测中的干扰因素
免疫检测技术- 标记物
免疫测定技术均是以标记物示踪作为基 础，同位素、荧光素、酶是经典的三大标记 免疫测定技术。这三大标记技术发展了各种 各样的免疫测定方法，如RIA、ELISA、荧光 免疫测定、免疫化学发光测定等，目前应用 这三大标记技术的检测试剂盒在临床广为应 用。近年来，作为免疫测定发展方向的非同 位素标记技术以其敏感、安全等倍受关注。
免疫学检测方法中的 干扰因素和对策
第二军医大学附属长海医院实验诊断科
沈 茜
随着基础免疫学研究的深入和现代免 疫学理论的建立，使大量免疫学检测技术 被不断地创新、发明；在临床疾病诊治的 应用中也不断地推陈出新。目前应用免疫 学原理检测的检验项目占到三级综合医院 检验科全部检验项目的1／4，医疗收入约 占1／3。这就要求检验人员不断掌握最新 的临床免疫学知识和各种新的检验方法， 了解检验项目的基本原理。
干扰因素和对策- 类风湿因子
收集10份RF31～＞1000IU/L的患者血清， 在美国和欧洲66各临床实验室进行74个项目 的免疫竞争法或免疫夹心法检测，仪器和试 剂均配套。3445个结果中8.7％为假阳性。错 误高值结果中的21％（所有结果的1.8％）引 起了临床的错误诊断，在使用RF吸附剂后再 检测，错误结果得到纠正。39％的假阳性结 果也可在使用RF吸附剂后降低。
干扰因素和对策- 外源性物质
冻存后融解的标本，蛋白质局部浓缩， 分布不均，应充分混合后再测定，但混匀时 应轻柔，不可强烈振荡。标本的反复冻融所 产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子 产生破坏作用，从而引起假阴性结果。
操作流程不当－造成结果的改变
我们对HBV血清标志物五项指标仅抗HBc总抗体单阳性的血清实行了严格的复检 措施，发现初、复检结果的符合率＜50%。 偏差如此之大是无法用实验人员操作不当解 释的。抗-HBc总抗体采用竞争抑制ELISA法 检测, 日常工作中无论标本多少，必然是先 加完血清标本后再加抗-HBc-HRP。这样， 血清中的抗-HBc与抗-HBc-HRP存在着明显 的‚不公平竞争‛。
免疫检测中的干扰
免疫检测中的干扰选译自《The Immunoassay Handbook (Fourth Edition)》翻译：武汉原谷生物科技有限责任公司免疫检测试验是现代临床实验室中一种重要的高敏检测技术, 但它们的致命弱点是它们易受干扰。
在病人的样本中存在干扰物质会导致错误的测试结果, 无论是假阳性或假阴性。
这个测试错误可能在临床上很重要, 并会导致对病人的误诊和灾难性后果。
对免疫检测试验中的干扰问题早已有大量综述性文章(Boscato et al., 1989; Boscato and Stuart, 1986, 1988; Braunstein, 2002; Diamandis, 2004; Ismail and Barth, 2001; Ismail et al., 2002b; Itoh and Yamaguchi, 1995; Jones, 2002; Kohse and Wisser, 1990; Kricka, 1999, 2000; Kricka et al., 1990; Kroll and Elin, 1994; Levinson, 1992; Tate and Ward, 2004; Van Kroonenburgh and Pauwels, 1988; Weber et al., 1990)。
在这里, 我们概述了免疫检测分析中干扰的范围, 消除因其存在于生物体液中的分析问题的方法, 和临床重要的例子。
免疫分析干扰是一个长期存在的问题, 可追溯到1900s 早期的血清学测试(Page and Heimoff, 1946; Seelman, 1918)。
正如一位作者在书信中所述, Wassermann 检测梅毒 (Seelman, 1918):" 在死亡和税收之外, 只有一件事我比这两者更确信的是，如果通过所描述的方法对我的血液进行测试，得到了一个阳性结果，我不会接受这是最终的诊断结果, 而是继续用另一种更准确和更可靠的方法进行测试。
免疫学检测方法中的干扰因素及对应措施
免疫学检测方法中的干扰因素及对应措施在现代临床中对于多种疾病的诊断均会应用到免疫学检查方法，获取到免疫检验结果能够为疾病确诊提供可靠依据。
但在免疫学检测全过程中，基于设备或人员操作等因素可能影响到工作顺利进行，或直接造成检验结果的不可靠。
针对此，需采用有效方式强化免疫学检测管理，以确保其能够为临床实践提供具有可靠性的数据。
结合本人工作经验对免疫学检测的干扰因素进行总结，并提出应对措施。
什么是免疫学检测方法？免疫学检测方法是临床疾病诊断中常用的检查手段。
可将其进一步分为体液免疫学检测与细胞免疫学检测。
其中体液免疫学检测是通过抗原与相应抗体在体外发生特异性结合并参考辅助因子参与下出现的反应，对疾病进行判断。
细胞免疫学测定方法是通过对多种免疫细胞表面独有标志物及产生细胞因子的测定，观察机体细胞免疫水平。
在体液免疫学检测中所观察到的凝集反应是颗粒性抗原与相应抗体特异性结合电解质参与下，形成肉眼能够观察到的凝集物，此种现象被称之为凝集反应。
在免疫学检测中，免疫荧光法的应用较为常见。
此种检测方式具体通过对于荧光素染料的应用标记抗体并不会影响其活性，此种抗体被称之为荧光抗体。
利用已知种类的荧光抗体浸染需要检测的含有抗原细胞或组织切片，若通过观察发现抗原则抗原与此抗体出现特异性结合，形成复合物，粘着在细胞上，在荧光显微镜下可观察到荧光可见物，能够辅助对相应疾病作出判断。
免疫学检测方法干扰因素1 准备工作常见干扰因素在免疫学检测之前，需要做好相应准备工作，包括对材料的采集以及设备准备等，而在此期间也存在诸多因素能够影响到最终检验结果。
例如免疫检验科质量管理体系不够完善，对科室内检测工作人员未能够给予系统化且有针对性的培训，可能导致检测人员自身缺乏风险防控意识，在临床工作中容易出现操作失误等问题。
在样本采集过程中，若相关工作人员没有接受过系统化培训，或其自身安全意识不强，则可导致其样本采集时间与采集部位不合理，致使样品出现溶血或损坏等情况影响到最终检测结果。
影响elisa结果的若干内源性干扰因素
内源性干扰因素一般包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异免疫球蛋白、异嗜性抗体、某些自身抗体、因使用鼠抗体治疗或诊断诱导的抗鼠Ig抗体、交叉反应物质等。
在日常的临床血清(浆)标本中，有相当比例不同程度的含有上述各种干扰物质，从而导致测定结果的假阳性。
1.类风湿因子(rheumatoid factors,RF)在类风湿患者、其他疾病以及正常人血清中,常含有较高或不同浓度的RF，RF一般为TgM型，亦有IgG和IgA型，RF具有与变性IgG产生非特异结合的特点，因为在elisa测定中，其可与固相上包被的特异抗体IgG以及随后加入的酶标的特异抗体IgG结合，从而出现假阳性结果。
尤其是在捕获法IgM型特异抗体的测定中表现最为明显，因为此时固相包被的抗体为抗人弘链抗体，IgM型RF的存在可使其大量结合于固相。
为避免RF对ELISA测定的干扰，通常可以采取下述措施：(1)稀释标本：这在判断急性病原体感染的特异IgM抗体如抗HAVIgM，抗HBclgM， TORCH的IgM 抗体检验等尤为有用。
因为急性感染时，血循环中特异的IgM抗体滴度通常很高，而RF滴度通常相对要低得多。
因此，在测定前对标本进行稀释，特异的IgM因高滴度存在仍可检出，而非特异的RF则会因为稀释变成非常低的滴度，从而对测定几乎不产生干扰。
现在，有些特异IgM检测elisa试剂盒不要求稀释标本，直接检测，这样虽然方便了实验室技术人员的操作，但容易出现假阳性结果，并且由于某些慢性感染，如HBV的感染，血循环中抗HBelgM可持续以一定的滴度存在，标本不做稀释即进行检测，即可出现阳性结果，从而失去抗HBclgM用于HBV急性感染的诊断价值。
因此，在临床实验室，一定要使用要求对标本做1:1000稀释的试剂盒进行检验，从而保证相应检测项目结果的可靠性及临床应用价值。
(2)改变酶标抗体：由于RF结合的是IgG的Fc片段，如果将待酶标的抗体的F，片段酶切夫除，仅留下具有特异结合功能的F(ab’)2部分标记酶，则在测定中即可避免RF的干扰。
免疫检测中的干扰因素及排除方法
二、内源性干扰因素及对策——人抗动物（如鼠、羊、兔等）抗体
人抗动物（如鼠、羊、兔等）抗体： 在临床上，有使用鼠源性单抗进行靶向治疗，及使用放射性标记鼠源性单 抗进行影像诊断等，均有可能使相应患者体内产生抗属抗体。对使用鼠源 性单抗的酶免测定时，可产生假阳性结果。
人抗动物（如鼠、羊、兔等）抗体干扰排除对策 使用特异的抗体F（ab）片段作为固相或测定酶标抗体 在标本或标本稀释液中加入过量的鼠Ig，封闭可能存在的抗属抗体。 使用特异的鸡抗体IgG作为固相和测定抗体，鸡IgG不与人抗属抗体反应。
二、内源性干扰因素及对策——自身抗体
自身抗体：如甲状腺球蛋白、抗胰岛素、抗甲状腺激素抗体 等，能与其相应靶抗原结合形成复合物，在ELISA方法中可 干扰相应抗原抗体的测定。
三、外源性干扰因素及对策——溶血
溶血： 要注意避免严重溶血，血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的 活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白 浓度高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP 底物反应显色。另外，机械强力震荡、突然反复冻融、低渗溶液、过酸、 过碱，以及酒精、乙醚、皂碱、胆碱盐等均可以起溶血。
三、外源性干扰因素及对策——纤维蛋白或标本凝固不全
纤维蛋白或标本凝固不全 血液标本采集后，如采集管中无抗凝剂或促凝集，则血液通常在半小时后 开始凝固，18~24h完全凝固。日常检测中，常在血液还未开始凝固时即分 离血清，此时离出的“血清”并非为完全血清，其中会残留部分纤维蛋白 原，如将其加入微孔中，在ELISA测定过程中仍可以形成肉眼可见的纤维 蛋白块，易造成假阳性结果。
免疫学检测方法中的干扰因素及注意的问题重点
标本管中添加物质的影响： 抗凝剂、酶 抑制剂及分离血清的分离胶等均对免疫检测有 一定干扰作用。
标本保存不当： 在冰箱中保存过久的标 本，会造成假阳性；有时抗原或抗体免疫活性 减弱，也会出现假阴性。
操作流程不当－造成结果的改变
对HBV血清标志物五项指标仅抗-HBc总抗体 单阳性的血清实行了严格的复检措施，发现初、复 检结果的符合率＜50%。偏差如此之大是无法用实 验人员操作不当解释的。抗-HBc总抗体采用竞争抑 制ELISA法检测, 日常工作中无论标本多少，必然 是先加完血清标本后再加抗-HBc-HRP。这样，血 清中的抗-HBc与抗-HBc-HRP存在着明显的“不 公平竞争”。
免疫学检测方法中的干 扰因素及注意的问题
组员：吴聪聪 王泽成 沈杨
吕林 包银伟
发言人：包银伟
PPT制作：吴聪聪
高迪
1
பைடு நூலகம்
背景介绍
2
干扰因素
3
注意事项
背景简介
免疫学检测就是利用抗原和抗体高度特异性结 合的原理而检测分析微量物质的方法。从20世纪 50年代美国学者Berson和Yallow发明了放射免
疫测定技术检测胰岛素起，免疫学检测技术经历了
20
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加样同时加入抗-HBc-HRP放置不同时间对检 测结果的影响
放置时 间min 阴性标 本数 临界值－标本A ＜0.3 0 75 10 450nm 假阳性 (%) 假阴性 (%)
0.3~0. ＞0.7 7 3 6 0 0
10
20 30 40
临床免疫学检验方法常见影响因素有哪些
临床免疫学检验方法常见影响因素有哪些临床免疫学检验是当前重要的检验手段之一，检验的准确性，对于患者的诊断和治疗有着重要的意义，随着医学技术的不断发展，检验方法也在不断完善，但还是有很多因素影响着检验的结果，而要提高检验工作的临床价值，就必须明确这些影响因素，找到有效的处理方法。
1、临床免疫学检验中有哪些概念？在临床免疫学检验过程中包含一些主要的概念，比如抗原、抗体、标志物等，很多人一时间容易把抗原和抗体弄混，抗原是人体中能够对免疫系统产生刺激，使其产生特异性的免疫应答，并在应答出现产物后能够与之进行特异性结合的物质。
而抗体一种多免疫功能的球蛋白，是在抗原的刺激下形成的，B细胞在受到刺激后会分化和繁殖，出现的浆细胞合成分泌形成抗体，抗体出现后会和抗原出现特异性结合。
这样我们就可以发现，抗原和抗体间在高度的特异性，且会相结合，而将这种原理利用起来对微量物质进行分析的方法就是免疫学检验，那么在检验学中还有一个特殊的概念，就是标志物。
标志物是在我们进行检验时的基础，检验学中三大标记免疫测定技术包括酶、同位素及荧光素，在这三种标记技术的基础上，发展出了多种不同的检验方法,如免疫化学发光测定、放射免疫分析测定、荧光免疫测定等，在临床中应用广泛。
最近几年，非同位素标记技术的发展速度较快，其较高的敏感性和安全性使之成为了当前免疫测定发展的方向。
2、免疫学检测中标本自身造成的干扰因素有哪些？在进行免疫学检验过程中，我们一直对于标本的质量有一定的要求，同时，在检验开展前也会对标本做出一定的处理，而标本自身的因素对于检验结果的影响也是比较大的。
分析标本自身对会对检验造成影响的因素，主要包括以下方面。
（1）影响因素——类风湿因子当患者体内存在类风湿因子时，会对多种免疫学检验方法的结果产生影响，IgG和IgM型类风湿免疫因子会和免疫检测系统中的捕获抗体，以及标记二抗的Fc段受体相结合，此时检验指标可能会出现升高的情况，结果呈现假阳性。
【doc】免疫学检测方法中的干扰因素和对策
免疫学检测方法中的干扰因素和对策现代中西医结合杂志ModernJournalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine2009Jul,18(21)量蛋白从尿中漏出使有效血容量减少,血液浓缩,而血脂蛋白代谢异常,高血脂症,导致血液黏稠度增加.蛋白质的丢失,肝脏代偿性合成蛋白增加,引起机体凝血,抗凝和纤溶系统失衡,导致高凝状态.肾病综合征患者血小板功能亢进及应用激素治疗等均可加重高凝状态.血液黏稠度增加,高凝状态对肾病的进展,恶化起重要作用,因此.肾小球疾病的治疗中,抗凝治疗尤为重要.丹参有活血化瘀,理气通络,除烦安神的功能.丹参注射液由中药丹参精制而成,具有改善微循环,抗凝,促进纤溶,抑制血小板聚集,抑制血栓形成的作用.临床药理显示其有效成分丹参酮具有抗凝,去纤,溶栓和降脂作用,促进肾组织病理改变的恢复.黄芪为补气要药,具有补中益气,补气生血,补气行滞,益卫固表的功能.黄芪注射液由黄芪精制而成,含有黄芪皂甙,黄酮类,多糖类等多种有效成分,能提高血浆组织中cAMP的含量,增强免疫功能,利尿,降压,能消除实验性肾炎蛋白尿L2J.有研究证明,黄芪能使肾病综合征患者蛋白质合成增加_3_3.此外,黄芪尚能减少激素,细胞毒药物不良反应,这是由于黄芪具有增强免疫功能和双向免疫调节作用.因此,两药合用,能起到协同作用,提高机体免疫力,改善病理状态,提高疗效,降低复发率,减轻西药的毒副作用.通过临床加用黄芪注射液和复方丹参注射液的疗效观察,20d内治愈率62%,总有效率100%,2个月后随访,全部病例达治愈标准,取得了较为理想的临床疗效,值得进一步在临床推广应用和不断完善治疗方案.[参考文献][1]叶任高.内科学[M].6版.北京:人民卫生出版社,2004:508[2]雷载权.中药学[M].上海:上海科学技术出版社,1995:205; 280—281[3]李丽英,于宏,潘缉圣,等.黄芪与当归对肾病综合征患者总蛋白质代谢的影响[J].中华内科杂志,1995,34(10):670—672 [收稿日期]2009—02—15免疫学检测方法中的干扰因素和对策陈金超,刘涤瑕,王丽,董风珍,徐立风(解放军第532医院,安徽黄山245041)[关键词]免疫学检测;干扰因素;对策[中图分类号]R446.61[文献标识码]B随着基础免疫学研究的深入和现代免疫学理论的建立,使大量免疫学检测技术被不断地创新,发明,在临床疾病诊治中的应用也不断推陈出新.这就要求检验人员不断掌握最新的临床免疫学知识和各种新的检验方法.为保证实验结果的正确性和可靠性,必须对实验整个过程中各个环节中的干扰因素有比较清楚的掌握和了解.笔者分析了标本内在因素以及人为因素等外在因素对免疫检测结果造成的影响…,探讨了如何在临床工作中注意和解决这些干扰,以保证结果的准确性的对策,现报道如下.1免疫学检测干扰因素和对策在临床检测过程中,标本自身及前处理所造成的干扰因素有类风湿因子(RF),嗜异性抗体,自身抗体,补体,纤维蛋白,溶血或黄疸,交叉反应物质,外源性物质,交叉污染等_2J.如何排除这些因素干扰,对免疫检测结果将起到重要作用. 1.1RF患者体内存在的RF能显着干扰许多免疫学检测方法,其中IgM,IgG型RF可以与免疫检测系统中的捕获抗体及标记二抗的Fc段直接结合,从而导致检测结果假阳性或假阴性升高.RF对不同检测系统的干扰程度有所差异,影响程度并不与RF的浓度成正比.在使用RF吸附剂后再检测, 可有效纠正错误结果.捕获抗体检测用F(ab')2替代完整的IgG,标本用连有热变性(63℃,10rain)IgG的固相吸附剂(Euroimmune公司)处理(将热变性IgG加入到标本稀释液或血清中同样有效),4℃过夜离心后再检测;检测抗原时,可以[文章编号]1008—8849(2009)21—2575—02用终浓度0.1mol/L2一巯基乙醇(2一ME)等加入到标本稀释液或标本中,使RF(IgM型)降解.1.2嗜异性抗体嗜异性抗体通常是指与其他种类动物的免疫球蛋白产生反应的人类抗体,具有广泛的种特异性.免疫检测系统中大量使用单克隆抗体,嗜异性抗体可与啮齿类动物IgG的Fc段结合,这样嗜异性抗体既可与检测系统中的捕获抗体结合,又可和标记抗体结合,造成检测结果假阳性或假阴性升高.嗜异性抗体干扰的程度,频率与患者的疾病状态,年龄,性别等无关,可在标本稀释液或待检标本中加入过量的动物Ig(s)处理,但加入量不足或亚型不同时无效(要与捕获抗体和标记抗体的Ig亚型相同).捕获抗体使用F(ab') 2.切除Fc段.1.3自身抗体嗜靶抗原的自身抗体,如抗甲状腺球蛋白,抗胰岛素等嗜靶抗原的自身抗体,能与靶抗原结合形成复合物,在免疫检测系统中均可对靶抗原的测定结果造成负性干扰L3].判断嗜靶抗原的自身抗体对检测的负干扰,应紧密结合患者的疾病诊断,病史,其他实验室检查结果综合分析.为避免以上情况出现,解决的办法是:测定前标本需用理化方法将免疫复合物解离后再测定.解离液组成:0.3%TritonX一100,1.5%CHAPS,15%SDS;100L标本,50L解离液混匀,56℃30min处理.1.4补体免疫检测系统中捕获抗体在向固相包被中和标记抗体的标记过程中,抗体分子发生变构,其Fc段的补体现代中西医结合杂志ModernJournalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine2009Jul,18(21) Clq分子结合位点被暴露出来,使Clq可以将二者连接起来,从而造成假阳性.一些公司为了增加检测的敏感性,使用链霉亲和素包被固相,将捕获抗体用亲和素标记,此过程也可引起捕获抗体的构象发生改变,造成假阳性或假阴性升高.可用终浓度10～40mmol/LEDTA处理标本,灭活补体,用53℃,10min或56℃,30rain加热血清使Clq灭活.1.5纤维蛋白在没有促凝剂和抗凝剂存在的情况下,正常血液采集后30min开始凝固,2h后完全凝固.临床检验工作中,有时为了争取时间快速检测,常在血液还未开始凝固时或未完全凝固时即强行离心分离血清,此时血清中仍残留部分纤维蛋白原,在免疫检测过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块,易造成假阳性结果,尤其是在大批量标本使用ELISA检测时,操作人员不注意,最易造成错误结果.为避免这种情况出现,解决的办法最好是血液标本采集后必须使其充分凝固再分离血清,或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂.怀疑检测结果存在纤维蛋白干扰的标本,最好将标本4～10℃放置过夜,离心后再检测.1.6溶血或黄疸各种人为原因引起的标本溶血,导致红细胞破坏,血红蛋白以及细胞碎片和蛋白质等释放出来.溶血对免疫检测的作用不仅是游离血红蛋白的影响,更多的是细胞碎片和蛋白质等其他溶血产物;血红蛋白具有过氧化物酶活性,在以辣根过氧化物酶为标记的ELISA测定中,会导致非特异性显色.溶血因测定方法的不同可导致对免疫学检测的正向或负向干扰,且影响大小也有所差异.一项针对溶血对电化学发光法影响的研究发现,cTnT测定浓度的负偏倚与血清中血红蛋白浓度相关,血红蛋白浓度每增1gilL,cTnT>0.1Mg/L的可能性下降2.5%_4J.标本中结合胆红素和未结合胆红素任一或两者含量的增高都会对采用免疫学原理的检测系统产生负干扰.因此应特别注意人为因素导致上述物质干扰.1.7交叉反应物质待检标本中存在类地高辛,类AFP样物质等,是一些与检测的靶抗原有交叉反应的物质.这类交叉反应物质在用多克隆抗体测定抗原时对测定结果影响不大,但在用单克隆抗体测定抗原时,如果交叉抗原决定簇正好是所用单克隆抗体相对应的靶决定簇时,会出现假阳性结果[.1.8外源性物质外源性物质常常是由于用于免疫测定的血标本处理及保存不当,添抗凝剂等不当所致L6J.标本受细菌污染:因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶,被细菌污染的标本在以辣根过氧化物酶为标记的ELISA测定中,可产生非特异性显色而干扰测定结果.标本管中添加物质的影响:抗凝剂,酶抑制剂(如NaN可抑制ELISA系统中HRP活性)及分离血清的分离胶等均对免疫检测有一定干扰作用.标本保存不当:在冰箱中保存过久的标本,血清中IgG可聚合成多聚体,AFP可形成二聚体,在间接法ELISA测定中会导致本底过深,甚至造成假阳性;有时抗原或抗体免疫活性减弱,亦可出现假阴性.为克服上述干扰,ELIsA测定的血清标本宜为新鲜采集;如不能立即测定,5d内测定的血清标本可存放于4℃,1周后测定的血清标本应低温冻存.冻存后融解的标本,蛋白质局部浓缩,分布不均,应充分混合后再测定, 但混匀时应轻柔,不可强烈振荡.标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用,从而引起假阴性结果.1.9操作不当一交叉污染定性免疫测定已广泛用于感染性病原体抗原和抗体检测,目前国内应用最广泛的是ELISA 等.由于测定操作和/或全自动加样系统吸头重复使用,常有标本间的交叉污染所致"拖带"现象,致假阳性结果的出现.标本交叉污染不光是导致假阳性,亦会因为乙肝疫苗的普遍免疫,标本中存在的抗HBs可使受污染标本中可能存在的HBsAg检测受抑,而致假阴性.目前的全自动加样系统,不管是一次性加样针还是永久性加样针,均难以避免样本的污染问题.特别是当遇到高浓度的抗原或抗体,沿加样方向被污染的甚至可能不只1个孔.为了排除这种污染造成的假阳性,建议当同一行/歹0上(沿加样方向)出现连续阳性,并经复查仍为阳性时,应同时采取新鲜标本进行检测来加以证实.2免疫检测中值得注意的问题2.1钩状效应由于待检标本中抗原浓度的显着升高,而致捕获抗体不足所造成的检测结果假阴性或假低测定值,这种现象可以出现在任何免疫学检测中,一步法检测更易见.在临床检测中应密切关注容易出现钩状效应的几个项目:甲胎蛋白(AFP),HBsAg,HBeAg,免疫球蛋白,大便隐血(OB),CA125等.预防和处理:关注患者的其他实验室检查结果和患者的临床诊断;不放过任何异常的测定值或模式;使用免疫渗透层析法快速验证;尽可能使用二步法进行检测.处理:用正常人血清系列10倍稀释再检测.2.2复检特殊项目出现阳性/阴性时应及时复检,复检必须使用另一种试剂盒,最好方法学也不一样.HBsAg,抗一HBs,HBeAg,抗一abe的检测最后可以使用"中和法"来鉴定. 抗一HCV的检测目前国内外的试剂盒单独使用均有可能出现假阴性或假阳性,联合使用可以减少错误结果,并可用RT—PCR鉴定.[参考文献][1]程艳杰,范存琳,王旭,等.ELISA方法检测HbsAg假阳性一例[J].中华检验医学杂志,2009,32(1):102—103[2]叶千红,张丽霞.关于标本因素对ELISA检测结果影响的分析[J].中国实验诊断学,2003,7(5):440—441[3]郭彤丽.ELISA检测的影响因素的分析[J].实用医技杂志, 2007,14(21):3748[4]叶应妩,王毓三,申子瑜.全国临床检验操作规程[M].3版.南京:东南大学出版社,2006:580[5]许斌,朱虎定.ELISA检测HbsAg影响因素的探讨[J].临床检验杂志,2000,18(4):232[6]武国威,李桂芹.标本污染致乙肝表面抗原假阳性1例[J].中国社区医师,2007,23(9):85【收稿日期]2009—02—25。
【临床】临床免疫检测的干扰因素
【临床】临床免疫检测的干扰因素免疫检测法中能够改变被检测物浓度或改变被检物与相应检测抗体结合能力的物质,均可能对检测结果造成干扰。
干扰因素：自身抗体、异嗜性抗体、人抗动物抗体及其他一些结合蛋白等,脂血、交叉反应及一些分析前变异、基质效应、甚至检测的设备不同也可对免疫检测造成干扰。
干扰原理：1、通过改变被检测物的浓度影响该物质最后的检测结果，如激素结合蛋白、检测物自身抗体。
2、通过干扰抗原抗体结合影响检测结果，如:异嗜性抗体和钩状效应(HOOK效应)等；一些治疗性抗体药物也可以通过与检测试剂中的抗体竞争抗原，对检测结果产生干扰。
自身抗体：大部分自身抗体为IgG型，亲和力较高,可对竞争法和免疫测定法产生较强的干扰，包括：酶类(肌酸激酶、淀粉酶)、肌钙蛋白、甲状腺激素(游离或总甲状腺)、甲状腺球蛋白、胰岛素、催乳素和睾酮等。
异嗜性抗体：包括天然抗体和一些自身抗体,针对的抗原不明确,可能来自于食物中的动物成分、与动物的接触或疫苗接种等,通常能够与两种或两种以上其他物种的抗体反应,属于亲和力较低的结合反应。
独特性抗体：能结合到被检测抗原上,影响免疫检测过程中抗原抗体的结合,进而影响检测结果。
独特型抗体和自然产生或自身免疫源性的类风湿因子(RF),是免疫检测过程中异嗜性干扰的主要因素，RF是患者体内针对变性IgG的内源性IgM抗体，可模拟异嗜性抗体的作用结合其他物种来源的抗体，可直接连接ELISA法中的捕获抗体和检测抗体引起假阳性结果在日常检测中比较多见。
HOOK效应在免疫分析法中，如果被检物质浓度过高，过量的未被捕获的抗原与检测抗体发生结合，阻断了捕获抗体一抗原一检测抗体复合物的形成，从而产生假阴性结果，称为HOOK效应；通过稀释标本或增加检测抗体浓度，改变被检测物与检测试剂中抗体的比例，可以避免或减轻HOOK效应。
蛋白因素包括:补体、溶菌酶、副蛋白等。
IgG K链副蛋白可与TSH检测试剂中的抗体结合，阻碍TSH与捕获抗体或检测抗体结合,导致TSH水平的假性降低。
临床免疫检验中的15大干扰因素
临床免疫检验中的干扰因素内源性干扰物质1、类风湿因子（Rheumatoidfactors，RF）类风湿因子（rheumatoid factor，RF）是一种抗人或动物IgG 分子Fc片段抗原决定簇的抗体，是以变性IgG为靶抗原的自身抗体。
RF最初由Rose等（1984年）在类风湿性关节炎（RA）患者血清中发现。
RA患者体内有产生RF的B细胞克隆，在变性IgG或EB病毒的直接作用下可大量合成RF。
RF主要为IgM类自身抗体，但也有IgG类、IgA类、IgD类和IgE类。
人血清中IgM、IgG型类风湿因子（RF）可以与ELISA系统中的捕获抗体及酶标记二抗的Fc段直接结合，从而导致假阳性。
类风湿因子干扰的排除（1）用F（ab）替代完整的IgG。
（2）标本用联有热变性（63°C，10min）IgG的固相吸附剂处理（将热变性IgG加入到标本稀释液中同样有效）。
（3）检测抗原时，可以用2-巯基乙醇等加入到标本稀释液中，使RF降解。
2、嗜异性抗体嗜异性抗体（Id）是由低纯度抗原引起的，又称之为对非特异性抗原产生的抗体应答。
天然的嗜异性抗体（IgG）可分为两类：一类（85%的假阳性或假增高由其引起）可结合于山羊、小鼠、大鼠、马和牛IgG的Fab区域，但不与兔IgG的Fab区结合。
另一类（15%的假阳性或假增高由其引起）可结合于小鼠、马、牛和兔IgG的FC区表位，但不与山羊和大鼠IgG的FC 区表位结合。
嗜异性抗体可通过交联固相和酶标的单抗或多抗而出现假阳性或假增高反应。
其也可造成假阴性或假降低的结果。
嗜异性抗体干扰的排除使用特异的兔F（ab’）2片段作为固相或酶标抗体。
在标本或标本稀释液中加入过量的动物Ig，封闭可能存在的嗜异性抗体。
但加入量不足或亚类不同时无效。
使用靶特异的非Ig亲和蛋白（Affibody）替代固相或酶标抗体之一。
采用噬菌体展示技术展示来自单个金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）联合文库的人IgA结合亲和蛋白，用于IgA的测定，不受异嗜性抗体的影响。
免疫学检测方法中的干扰因素及注意的问题
随着基础免疫学研究的深入和现代免疫 学理论的建立，使大量免疫学检测技术被不 断地创新、发明；在临床疾病诊治的应用中 也不断地推陈出新。要保证实验结果的正确 性和可靠性，必须对实验整个过程中各个环 节中的干扰因素有比较清楚的掌握和了解。
免疫学检测- 干扰因素
标本自身及前处理所造成的干扰因素: ❖类风湿因子（RF） ❖嗜异性抗体 ❖自身抗体 ❖补体 ❖纤维蛋白 ❖溶血或黄疸 ❖交叉反应物质 ❖外源性物质
操作流程不当－造成结果的改变
对HBV血清标志物五项指标仅抗-HBc总抗体 单阳性的血清实行了严格的复检措施，发现初、复 检结果的符合率＜50%。偏差如此之大是无法用实 验人员操作不当解释的。抗-HBc总抗体采用竞争抑 制ELISA法检测, 日常工作中无论标本多少，必然 是先加完血清标本后再加抗-HBc-HRP。这样，血 清中的抗-HBc与抗-HBc-HRP存在着明显的“不 公平竞争”。
标本受细菌污染： 因菌体中可能含有内 源性辣根过氧化物酶，被细菌污染的标本在 以辣根过氧化物酶为标记的 ELISA测定中， 可产生非特异性显色而干扰测定结果。
标本管中添加物质的影响： 抗凝剂、酶 抑制剂及分离血清的分离胶等均对免疫检测有 一定干扰作用。
标本保存不当： 在冰箱中保存过久的标 本，会造成假阳性；有时抗原或抗体免疫活性 减弱，也会出现假阴性。
❖4、抗－HCV的检测目前国内外的试剂盒单 独使用均有可能出现假阴性或假阳性，联合 使用可以减少错误结果；并可用RT－PCR 鉴定。
类风湿因子
患者体内存在的类风湿因子能显著干扰 许多免疫学检测方法。RF对不同检测系统的 干扰程度有所差异，影响程度并不与RF的浓 度成正比 。目前，在临床工作中使用的免疫 检测试剂盒大部分均没有很好地防止RF干扰 的措施，国外著名公司要好于国内公司。
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免疫学检测- 干扰因素
标本自身及前处理所造成的干扰因素 －类风湿因子（RF） －嗜异性抗体 －自身抗体 －补体 －纤维蛋白 －溶血或黄疸 －交叉反应物质 －外源性物质
干扰因素和对策- 类风湿因子
患者体内存在的类风湿因子能显著干扰 许多免疫学检测方法，IgM、IgG型RF可以与 免疫检测系统中的捕获抗体及标记二抗的Fc 段直接结合，从而导致检测结果假阳性或假 性升高。RF对不同检测系统的干扰程度有所 差异，影响程度并不与RF的浓度成正比 。目 前，在临床工作中使用的免疫检测试剂盒大 部分均没有很好地防止RF干扰的措施，国外 著名公司要好于国内公司。
4
/L天然MAK33或15mg/L热处理
MAK33后结果正常
4 仅加入15mg/L热处理MAK33后
3
结果正常
0.08 0.06
干扰因素和对策- 嗜异性抗体
使用Access免疫化学发光检测系统测
定TSH、PSA、βHCG和皮质醇，前三项为
双位点非竞争法，后为竞争法。160份标本
测定HCG有5份（3.1%)假性升高；53份标
免疫检测技术- 标记物
免疫测定技术均是以标记物示踪作为基 础，同位素、荧光素、酶是经典的三大标记 免疫测定技术。这三大标记技术发展了各种 各样的免疫测定方法，如RIA、ELISA、荧光 免疫测定、免疫化学发光测定等，目前应用 这三大标记技术的检测试剂盒在临床广为应 用。近年来，作为免疫测定发展方向的非同 位素标记技术以其敏感、安全等倍受关注。
干扰因素和对策- 自身抗 体 嗜靶抗原的自身抗体，如抗甲状腺球蛋
白、抗胰岛素等嗜靶抗原的自身抗体，能与 靶抗原结合形成复合物，在免疫检测系统中 均可对靶抗原的测定结果造成负性干扰。
判断嗜靶抗原的自身抗体对检测的负干 扰，因紧密结合患者的疾病诊断、病史、其 他实验检查的结果综合分析。如甲亢、甲低、 I型糖尿病等。
免疫学检测方法中的 干扰因素和对策
随着基础免疫学研究的深入和现代免 疫学理论的建立，使大量免疫学检测技术 被不断地创新、发明；在临床疾病诊治的 应用中也不断地推陈出新。目前应用免疫 学原理检测的检验项目占到三级综合医院 检验科全部检验项目的1／4，医疗收入约 占1／3。这就要求检验人员不断掌握最新 的临床免疫学知识和各种新的检验方法， 了解检验项目的基本原理。
干扰因素和对策- 嗜异性抗体
嗜异性抗体通常是指与其他种类动物的 免疫球蛋白产生反应的人类抗体，具有广泛 的种特异性。免疫检测系统中大量使用单克 隆抗体，嗜异性抗体可与啮齿类动物IgG的 Fc段结合。这样嗜异性抗体既可与检测系统 中的捕获抗体结合、又可和标记抗体结合， 造成检测结果假阳性或假性升高。嗜异性抗 体干扰的程度、频率与患者的疾病状态、年 龄、性别等无关。
本（37.9%)用嗜异性抗体吸附剂吸收后结果
出现差异性下降；有4份标本的结果出现＞
4SD的显著增高，使临床对；49(7):1163～1169
嗜异性抗体的干扰－对策
在标本稀释液或待检标本中加入过量的动 物Ig (s) ，但加入量不足或亚型不同时无 效（要与捕获抗体和标记抗体的Ig亚型 相 同）。 捕获抗体使用F(ab`)2，切除Fc段。
干扰因素和对策- 类风湿因子
收集10份RF31～＞1000IU/L的患者血清， 在美国和欧洲66各临床实验室进行74个项目 的免疫竞争法或免疫夹心法检测，仪器和试 剂均配套。3445个结果中8.7％为假阳性。错 误高值结果中的21％（所有结果的1.8％）引 起了临床的错误诊断，在使用RF吸附剂后再 检测，错误结果得到纠正。39％的假阳性结 果也可在使用RF吸附剂后降低。
Clinical Chemistry 2002;48(11):2008~2016
RF的干扰－对策
捕获抗体用F(ab`)2替代完整的IgG 标本用连有热变性（63℃，10 min）IgG的 固相吸附剂（Euroimmune公司）处理 （将 热变性IgG加入到标本稀释液或血清中同 样 有效），4℃过夜离心后在检测； 检测抗原时，可以用终浓度0.1mol/L 2-巯 基乙醇(2- ME)等加入到标本稀释液或标本
干扰因素和对策- 嗜异性抗体
将11261份血清标本使用荧光时间分辨免 疫分析系统（PE公司，二步法、双位点）检 测CEA，将缓冲液中加入小牛IgG 约210个病 人、3.3~4.7%的标本出现假性升高；加入 15mg/L热处理小鼠IgG（MAK33 ）（Roche） 可将干扰降为0.86%；同浓度天然小鼠IgG无 效；去除捕获抗体或标记抗体的Fc段也可将 干扰降至0.1%。
要保证实验结果的正确性和可靠性，必 须对实验整个过程中各个环节中的干扰因素 有比较清楚的掌握和了解。在本次课中主要 讨生论化的是标本本身内在因素、以及由于人为 因临素检对标本处理不当等引起的外在因素、对 免疫检测结果造成的影响。在了解这些因素 的同时，如何在临床工作中注意和解决这些 干扰，以保证结果的准确性。
Clinical Chemistry 2002；48(4):613~621
表1. 不同处理方法对嗜异性抗体干扰的排除
处理方法
病人数 频率（％）
1 切除捕获抗体Fc段和加入热处 148
理15mg/LMAK33后结果正常
2 仅切除捕获抗体Fc段后结果正
41
常
3.0 0.82
3 切除捕获抗体Fc段或加入15mg
基本概念
抗原：是一类能刺激机体免疫系统产生特异性 免疫应答、并能与相应免疫应答产物（抗体或 致敏淋巴细胞）发生特异性结合的物质。
抗体： 是由抗原刺激 B细胞经分化增殖形成 的浆细胞合成和分泌 的，能与相应抗原发
基本概念
免疫学检测就是利用抗原和抗体高度特异 性结合的原理而检测分析微量物质的方法。从 20世纪50年代美国学者Berson和Yallow发明 了放射免疫测定技术检测胰岛素起，免疫学检 测技术经历了从定性到定量；从常量分析到微 量、超微量分析；从手工检测到全自动化；从 单个标本检测到高通量检测等一系列长足的进 步。