dna连接酶 dna聚合酶

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Ⅰ型酶：
1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和 E.coliK中分离出的核酸内切酶。
分子量较大，反应需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫 氨酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别
位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机 的，所以在基因工程中应用不大。
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Ⅱ型酶
1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜 血Rd株中分离出来的限制酶。
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Ⅲ型酶
这类酶可识别特定碱基顺序，并 在 这 一顺 序 的 3’ 端 24~26bp 处 切 开ＤＮＡ，所以它的切割位点也是 没有特异性的。
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Ⅱ型酶的基本特性
1. 在DNA双链的特异性识别序列部位， 切割DNA分子，产生链的断裂。 2. 两个单链断裂部位在DNA分子上的分 布，通常不是彼此直接相对的 3. 因此，断裂的结果形成的DNA片断， 也往往具有互补的单链延伸末端。
分子量较小（105Da），只有一种多肽，
通常以同源二聚体的形式存在。反应只需 Mg++的存在，并且具有以下两个特点，使这 类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。
• 识别位点是一个回文对称结构，并且切割位 点也在这一回文对称结构上。
• 许多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形 成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重组。
酶。
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影响核酸内切酶活性的因素： 1.DNA的纯度：
DNase的污染(Mg++) a.增加核酸内切限制酶的用量， b.扩大酶催化反应的体系（稀释）， c.延长酶催化反应的保温时间。 加入亚精胺提高酶的消化作用，需适当 的温度。
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2. DNA的甲基化程度 3. 酶切消化反应的温度：
大多数酶的标准反应温度 37度。 4. DNA的分子结构：
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R/M体系的作用： 保护自身的DNA不受限制； 破坏外源DNA使之迅速降解
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• 限制性内切酶本是微生物细胞中用于专 门水解外源ＤＮＡ的一类酶，其功能是 避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染， 是细胞中的一种防御机制。由于R/M现 象的发现使得核酸内切酶成为基因工程 重要的工具酶。
• 根据酶的功能、大小和反应条件，及切 割ＤＮＡ的特点，可以将限制性内切酶 分为三类： Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、 Ⅲ型酶
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限制片断的末端连接作用
分子间的连接：不同的DNA片断通过互 补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连 接起来。
分子内的连接：由同一片断的两个互补 末端之间的碱基配对而形成的环形分子。
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限制酶的特性
a.限制酶识别靶序列同DNA的来源无关； b.限制酶识别靶序列是唯一的（对某种限
制酶只具一个限制位点的质粒）。
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E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶
当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于
其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基
序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽
然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲 基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸 （SAM）将甲基转移给限制酶识别序列 的特定碱基，使之甲基化。 EcoB核酸酶 不能识别已甲基化的序列。
人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着 一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与 修饰现象简称（R/M体系）。
细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别 自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。
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• R/M体系： 寄主是由两种酶活性配合完成的 一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶
基因工程的酶学基础
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限制性核酸内切酶 ＤＮΒιβλιοθήκη Baidu连接酶 DNA聚合酶
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限制性核酸内切酶
（restriction endonuclease）
这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶 。
是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核 苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内 切酶。
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寄主控制的限制（restriction） 与修饰 (modification) 现象：
某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒 或病毒DNA所需要的酶量要比消化线性 的DNA高29倍。
C CTAG G
A CTAG T
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杂种位点（hybrid site） 由一对同尾酶分别
产生的粘性末端共价结合形成的位点。
一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。
BamHⅠ G GATC C BclⅠ T GATC A
C CTAG G
A CTAG T
杂种位点 ： GATC C （ BamHⅠ ）
CTAG T（ BclⅠ ）
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同尾酶（isocaudamer）
指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的
粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割 位点的选择余地更大。
杂种位点（hybrid site）：由一对同尾酶分别产 生的粘性末端共价结合形成的位点。
一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。
BamHⅠ G GATC C BclⅠ T GATC A
3’CTTAAG 5’
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平末端
两条链上的断裂位置是处在一个 对称结构的中心这样形式的断裂是 形成具有平末端的DNA片断。不易 重新环化。
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同裂酶（isoschizomers)
指来源不同但识别相同靶序列的核酸内 切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的 末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性 不同。 Example: 限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶 (CCGG) ， 当靶序列中一个5-甲基胞嘧啶时HpaⅡ不能进行 切割，而MspⅠ可以。
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限制性核酸内切酶的命名原则：
第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名 的第一个字母。
第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名 的第一、二个字母。
其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的 菌株号。 罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。
例：EcoR I: 来自于Escheria coli RY13的第一个限制
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核酸内切酶作用后的断裂方式
粘性末端 ：两条链上的断裂位置是交错地、但又是 围绕着一个对称结构中心，这样形式的断裂结果形 成具有粘性末端的DNA片断。
具有3’-OH（ Pst1 ），或5’-OH(EcoR1)的粘性末 端。
Pst1
EcoR1
5’CTGCAG 3’
5’GAATTC 3’
3’GACGTC 5’