侵染观赏南瓜的黄瓜绿斑驳花叶病毒的初步鉴定_秦碧霞

侵染观赏南瓜的黄瓜绿斑驳花叶病毒的初步鉴定秦碧霞　蔡健和　刘志明　陈永惠　朱桂宁　黄福新(广西农科院植保所　南宁　530007)Preliminary identification of a Cucumber green mottle mosaic virus infecting pumpkin .Qin B ixia ,Cai Jianhe ,Liu Zhiming ,Chen Yonghui ,Zhu Guining ,Huang Fuxin (Institute of Plant Protection ,Guangxi Academ y of Agricultural Sciences ,Nanning ,530007,China )A bstact A virus isolate ,P -3(NN )was obtained from pumpkin planted in a agricultural demonstration zone in Guangxi .P -3(NN )was found to cause systemic mosaic ,vein clearing or systemic chlorotic spot in all the Cucuribitaceae plants tested ,cause local c hlor otic spot in Datura stramonium and on infection in other Solanaceae ,Leguminosae or Chenopodiaceae plants tested .The lethal temperature of the virus was 95℃to 100℃.Straight tubular particles were observed under electron microscope .The length of most virus particles was close to 300nm .ELI SA test indicated that P -3(NN )showed a close relationship with Cucumbe r green mottle mosaic virus (C GMMV ).All the results suggest that P -3(NN )is an isolate of CGMMV .Key words pumpkin ,Cucumber gre en m ottle mosaic virus ,virus identification摘要　从广西某农业展示中心观赏南瓜上分离到一种直杆状病毒,长约300nm ,该病毒分离物P -3(NN )在测试的葫芦科作物上表现为系统花叶、褪绿斑及明脉症状,在曼陀罗上为局部褪绿斑,在测试的其它茄科作物及豆科和藜科作物上无任何症状反应。

其致死温度为95～100℃。

经DAC -ELISA 测定,P -3(NN )与黄瓜绿斑驳花叶病毒有密切的血清学关系。

根据以上结果,初步鉴定P -3(NN )为黄瓜绿斑驳花叶病毒(C GMMV )的一个分离物。

关键词　观赏南瓜　黄瓜绿斑驳花叶病毒　病毒鉴定 黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumbe r green mottle mosaic virus ,CGMMV )是烟草花叶病毒属(Tobamovirus )的成员,最早由Ainsworth (1935)记述,主要分布在欧洲、印度和日本等国葫芦科植物上[1]。

该病毒极易通过汁液传播,种子带毒是主要的远距离传毒方式,是一种对葫芦科植物具有潜在威胁的病毒之一,属潜在危险性有害生物。

Hseu SH .等[2]曾在我国台湾的葫芦科作物上分离鉴定出该病毒,但我国大陆目前尚未见该病毒发生的报—198— 基金项目:广西青年科学基金项目(桂科青0135006),广西新世纪十百千人才工程项目(2001215),广西农科院科技发展基金项目(2002025)收稿日期:2004-12-20道。

2003年在广西某农业展示中心的观赏南瓜(Cucurbitape po var.ovife ra)上采集到表现脉绿、花叶的病毒病叶片,对该病毒分离物进行了生物学测定、致死温度测定、血清学检测及电子显微镜观察。

1　材料和方法1.1　病毒病标样采集2003年4月在广西某农业展示中心温室内采集到表现脉绿、花叶的观赏南瓜叶片样品1份(编号为P3-(NN)),在防虫网室内分离接种到西葫芦上保存。

1.2　寄主反应测定用汁液摩擦接种法将保存在西葫芦上的病毒分离物P-3(NN)接种葫芦科(Cucuribita-ceae)、茄科(Solanaceae)、豆科(Leguminosae)和藜科(Chenopodiaceae)共4科16种植物,每种植物接种两盆,每盆2～5株苗。

以健康植株做对照,5天后开始记录各种植物的症状反应。

1.3　致死温度测定按常规方法[3]测定感病南瓜汁液中病毒的致死温度。

1.4　血清学检测用抗原直接包被间接ELISA法(DAC-ELISA)检测P-3(NN)与西瓜花叶病毒(Water-melon mosaic virus,WMV)、小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)、南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus,SqMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、烟草花叶病毒(Tobac co mosaic virus,TMV)和黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumbe r green mottle m osaic virus,C GMMV)的关系。

其中W MV-2、ZY MV、CMV、T MV抗血清分别由Dr.Piero Roggero (Istituto Fitovirologia Applicata,CNR,Italy)、浙江农科院病毒学与生物技术研究所、中国农科院油料所和浙江大学生物技术研究所惠赠;SqMV抗血清购自国家质检总局动植物检疫实验所;C GMMV抗血清购自美国Agdia 公司。

1.5　病毒提纯在西葫芦上繁殖病毒分离物P-3(NN),两周后收取病叶采用差速离心和PE G二次沉淀法进行病毒粒子的初提取。

1.6　病毒粒子电子显微镜观察分别取病毒初提纯液及病叶浸渍液经负染后在JE M-1200EX S型电子显微镜下观察病毒粒子形态及大小。

2　结果2.1　寄主反应和症状表现表1　观赏南瓜病毒分离物P-3(NN)在测试植物上的反应接种植物寄主反应南瓜(Cucurbita mos chata)SCS西葫芦(Cucurbita pe po)SCS,SM西瓜(Cit rullus vulgari a)SM黄瓜(Cucumis s ativus)VC,SM八角丝瓜(Luffa acutangula)SCS,SM罗汉果(Si raitia gr osv enorii)SM普通烟(Nic otiana t abacum)O心叶烟(Nic otiana glutinos a)O番茄(Lyc ope rsic um es cul entum)O辣椒(C apsicum annum)O曼陀罗(Datur a s tramonium)LCS菜豆(Vicia faba)O豌豆(Pis um s ati vum)O豇豆(Vigna s ine nsi s)O苋色藜(C henopodium amaranticolor)O昆诺藜(C henopodium quinoa)O 注:SCS:系统褪绿斑,SM:系统花叶,VC:明脉,LCS:局部褪绿斑,O:不侵染。

病毒分离物P-3(NN)经汁液摩擦接种供试植物的结果见表1。

观察至25天,P-3 (NN)经人工摩擦接种侵染测试的南瓜、西葫芦、西瓜、黄瓜、八角丝瓜和罗汉果等葫芦科植物,症状主要表现为系统花叶、褪绿斑和明脉等;在曼陀罗接种叶上表现为局部褪绿斑,在苋色藜、昆诺藜、普通烟、心叶烟、番茄、辣椒、菜豆、碗豆、豇豆等上无任何症状反应。

2.2　致死温度—199—经测定,在南瓜汁液中P -3(NN )的致死温度为95～100℃。

2.3　E LISA 检测结果经DAC -ELISA 检测,P -3(NN )与CGMMV和TMV 抗血清呈阳性反应,与W MV 、ZY MV 、SqMV 、CMV 抗血清呈阴性反应。

2.4　病毒粒子的电子显微镜观察病毒初提纯液及病叶浸渍液经负染后在电子显微镜下观察,均可见大量直杆状病毒粒子(图1),典型粒子长度约300nm。

图1　P -3(NN )的电镜照片3　结论和讨论初步试验结果表明,观赏南瓜病毒分离物P -3(NN )与黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGM -MV )有密切的血清学关系,与烟草花叶病毒(TMV )抗血清有血清学关系,可通过人工摩擦接种侵染葫芦科植物表现系统症状,接种曼陀罗表现局部褪绿斑,不侵染普通烟、心叶烟和豆科、藜科植物,致死温度为95～100℃。

病毒粒子直杆状,长度约300nm 。

这些性状与C GMMV 的特征基本相符,而寄主反应与TMV 明显不同[1,4],据此,我们初步鉴定P -3(NN )为C GMMV 的一个分离物。

CGMMV 存在株系分化[1],日本报道了3个株系,即西瓜株系、黄瓜株系和Yodo 株系,其中黄瓜株系和Yodo 株系上在曼陀罗上产生局部褪绿斑,而Yodo 株系还在苋色藜上产生局部枯斑。

本试验分离的P -3(NN )接种曼陀罗也出现了局部褪绿斑,但不侵染苋色藜,最后确定P -3(NN )的株系划分还有待进一步的深入鉴定。

CGMMV 是典型的种传病毒,且非常稳定,常温下侵染力可保持数月。

据了解,设施观光农业中的观赏南瓜种子是国内有关单位从欧洲、美国、印度、日本等世界各地引进种子,经提纯复壮和适应性繁育后选育出的,而欧洲、印度、日本是该病毒的主要分布地区,从病区引进种子就很有可能把病毒随种子带进来。

种焱[5]1993年曾对CGMMV 进行检疫性评估,指出我国应加强对西瓜、南瓜等葫芦科种子的检疫工作,注意对CGMMV 的检疫,2004年厦门检验检疫局曾从日本进口的南瓜种子中检出过该病毒,我们的初步鉴定结果表明在广西设施栽培的观赏南瓜上已有该病毒的发生。

随着我国设施观赏农业的发展和农业对外交流的日益频繁,我们认为有必要加强对引进葫芦科种子的病毒检疫工作,把危险性病虫拒之于国门之外,并对目前CGMMV 在国内发生的情况进行普查,以便采取相应措施防止其在国内的扩散传播。

致谢　广西大学电镜室文宗振老师协助观察病毒粒子并拍照,特此致谢。